畜牧兽医学报  2018, Vol. 49 Issue (1): 218-222. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2018.01.025    PDF    
引用本文
廖成水, 王晓利, 田文静, 杨亚东, 张梦珂, 王安琪, 张春杰, 刘明远, Boireau Pascal, 程相朝. 旋毛虫plancitoxin-1-like基因的序列分析与编码蛋白结构预测[J]. 畜牧兽医学报, 2018, 49(1): 218-222.  
LIAO Cheng-shui, WANG Xiao-li, TIAN Wen-jing, YANG Ya-dong, ZHANG Meng-ke, WANG An-qi, ZHANG Chun-jie, LIU Ming-yuan, BOIREAU Pascal, CHENG Xiang-chao. Cloning and Sequence Analysis of Plancitoxin-1-like Gene in Trichinella spiralis[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2018, 49(1): 218-222.  
旋毛虫plancitoxin-1-like基因的序列分析与编码蛋白结构预测
廖成水1,4, 王晓利2, 田文静1, 杨亚东1, 张梦珂1, 王安琪4, 张春杰1, 刘明远4, Boireau Pascal4,5, 程相朝1,3     
1. 河南科技大学, 动物科技学院/洛阳市活载体生物材料与动物疫病防控重点实验室, 洛阳 471023;
2. 河南科技大学 医学院, 洛阳 471023;
3. 洛阳职业技术学院, 洛阳 471003;
4. 吉林大学 人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室, 长春 130062;
5. 法国国家食品、环境及劳动卫生署动物卫生实验室, 迈松阿尔福 94706
收稿日期：2017-06-26
基金项目：国家自然科学基金（31030064）；国家自然科学基金面上项目（31572489）；河南科技大学博士启动基金（13480071）；河南省高等学校重点科研项目计划（17A230009）
作者简介：廖成水(1986-), 男, 博士, 主要从事微生物感染与先天性免疫细胞作用研究, E-mail:liaochengshui33@163.com
通信作者：程相朝, 教授, 主要从事动物疫病分子与免疫学机制研究, E-mail:chengxch@126.com
摘要：基因组预测旋毛虫拥有125种庞大的DNase Ⅱ家族蛋白，但只有plancitoxin-1唯一在C端含有一个保守的DNase Ⅱ活性位点（HKD基序）。为研究旋毛虫plancitoxin-1基因的序列结构特征，以旋毛虫总RNA为模板进行RT-PCR，获得plancitoxin-1基因的序列，并利用生物信息学方法进行系统性分析。结果显示，扩增得到的核苷酸序列比GenBank中相关序列短210 bp，编码294个氨基酸，由20种氨基酸组成，重新命名为plancitoxin-1-like，且氨基酸序列中在N端和C端都具有HKD基序。蛋白质理论相对分子质量为33.19 ku，等电点为9.17，是稳定存在的亲水性蛋白。Plancitoxin-1-like的氨基酸序列与其他物种DNase Ⅱ的相似性为35%左右。Plancitoxin-1-like含有4个N-糖基化位点、3个O-糖基化位点、31个磷酸化位点、17个B细胞线性结合位点和9个T细胞结合位点以及3个二硫键。二级结构中，α-螺旋占14.29%（42个），延伸链占28.23%（83个），无规卷曲占55.10%（162个）。本研究成功克隆旋毛虫plancitoxin-1-like基因，对其序列结构进行分析，为进一步研究庞大的DNase Ⅱ家族蛋白在旋毛虫发育和感染中的作用奠定基础。
关键词：旋毛虫    DNase Ⅱ    克隆    生物信息学    
Cloning and Sequence Analysis of Plancitoxin-1-like Gene in Trichinella spiralis
LIAO Cheng-shui1,4, WANG Xiao-li2, TIAN Wen-jing1, YANG Ya-dong1, ZHANG Meng-ke1, WANG An-qi4, ZHANG Chun-jie1, LIU Ming-yuan4, BOIREAU Pascal4,5, CHENG Xiang-chao1,3     
1. College of Animal Science and Technology/Luoyang Key Laboratory of Live Carrier Biomaterial and Animal Disease Prevention and Control, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;
2. Medical College, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China;
3. Luoyang Vocational and Technical College, Luoyang 471003, China;
4. Key Laboratory of Zoonisis of Ministry of Education, Institute of Zoonosis, Jilin University, Changchun 130062, China;
5. ANSES's Laboratory for Animal Health, Maisons-Alfort 94706, France
Abstract: It is noteworthy that more extensive expansion of the DNase Ⅱ-like protein family (estimated 125 genes) in the genome of the parasitic nematode Trichinella spiralis (T. spiralis). However, only plancitoxin-1 possesses one predicted active site of DNase Ⅱ (HKD motif) in its C-terminus domain in 125 DNase Ⅱ-like protein family. To explore the molecular characteristics of plancitoxin-1 gene in T. spiralis, plancitoxin-1 gene was cloned by RT-PCR from total RNA of T. spiralis larvae, and analyzed with bioinformatics software. The results showed that the sequences of plancitoxin-1 cloned from T. spiralis were shorter (210 bp less) than the XM_003370715.1 sequence in GenBank, and named after plancitoxin-1-like. The gene encoded a protein of 294 amino acids. Intriguingly, there were two HKD motifs in the N-and C-termini in the cloned sequences. plancitoxin-1-like is a stable protein with a predicted molecular mass (Mr) of 33.19 kDa and theoretical pI of 9.17. By sequence alignment, plancitoxin-1-like protein revealed 35% sequence identity to previously reported DNase Ⅱ family members from other species. A total of 4 N-linked glycosylation sites, 3 O-linked glycosylation sites, 31 phosphorylation site 17 linear B cell piptope, 9 T cell binding sites, and 3 disulfide bond were predicted in plancitoxin-1-like. Analysis of secondary structure revealed that α-helix, extended strand, and random coil were 14.29% (42), 28.23% (83), and 55.10% (162), respectively. In this study, the plancitoxin-1-like gene was cloned and analyzed. The results laid the foundation for the further study on the role of development infection in T. spiralis.
Key words: Trichinella spiralis     DNase Ⅱ     clone     bioinformatics    

脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease, DNase)具有DNase I(EC 3.1.21.1)和DNase Ⅱ(EC 3.1.22.1)两大类[1]。1988年首次报道人类DNase Ⅱ基因后[2]，DNase Ⅱ在脊椎动物、无脊椎动物和单细胞原虫中被陆续报道[3]。旋毛虫是一种寄生于骨骼肌细胞的重要人兽共患胞内寄生虫，主要分布于中国、阿根廷和部分东欧国家等[4]。旋毛虫基因组显示旋毛虫具有多达125个DNase Ⅱ蛋白家族基因[5]。在这之前含有最多DNase Ⅱ的物种是秀丽杆线虫(仅10种)[6]，旋毛虫如此庞大的蛋白家族在其他物种中实属罕见，而关于旋毛虫DNase Ⅱ的研究仍未见有明显进展。经典DNase Ⅱ的氨基酸序列在N端和C端都具有高度保守区域，即HKD基序[7]。在线软件分析显示旋毛虫125个基因中仅仅plancitoxin-1(1 095 bp, GenBank accession No. XM_003370715.1)含有一个HKD基序，且位于C端。因此，本研究克隆得到旋毛虫plancitoxin-1基因，并分析其序列特征，以期为庞大的DNase Ⅱ蛋白家族在旋毛虫发育和感染中的作用研究提供科学资料。

1 材料与方法 1.1 主要材料

Wistar大鼠(200.0 g±20.0 g)购自吉林大学白求恩医学院动物实验中心；中国河南猪旋毛虫分离株Trichinella spiralis (genotype T1)，国际标准虫种编号为ISS534，由本实验室小鼠传代保种；pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌DH5α购自德国Novagen公司，由本实验室常规冻存；胰蛋白胨和酵母浸出物购自英国OXOID公司；胃蛋白酶购自中国医药集团总公司；RPMI-1640培养液购自Hyclone公司；青霉素、硫酸链霉素均购自美国Sigma-Aldrich公司；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker、BamHⅠ、HindⅢ和RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0均购自宝生物工程(大连)有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

1.2 Plancitoxin-1基因的克隆

根据GenBank上的旋毛虫plancitoxin-1基因序列(GenBank No.: XM_003370715.1)设计引物(上游引物：5′-GGATCCATGGACGCACGTCGGCCGGTAT-3′，BamHⅠ；下游引物：5′-AAGCTTTCAATATGGTGGAATAGGACAAAGT-3′，HindⅢ)。常规方法收集旋毛虫肌幼虫、新生幼虫和成虫虫体，根据Trizol试剂盒的方法得到三个时期总RNA。根据RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂盒的方法得到cDNA。以旋毛虫cDNA为模板，常规PCR扩增获得plancitoxin-1基因。

1.3 同源性分析

利用CLASTALX 2.1进行二十余种物种DNase Ⅱ蛋白多重序列分析。采用PHYLIP 3.695-NEIGHBOR重复1 000次的bootstrap法进行氨基酸序列的遗传进化树分析。

1.4 理化性质分析

在线网站ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质相对分子质量大小、理论等电点和氨基酸组成。在线网站http://people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html和http://biotech.ou.edu/分别用于分析氨基酸的稀有密码子和重组蛋白质的可溶性。在线网站ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白质的亲水性与疏水性。

1.5 结构分析

在线网站http://www.cbs.dtu.dk/services/的NetNGlyc、NetOGlyc和NetPhos分别分析N-糖基化位点、O-糖基化位点和磷酸化位点。在线网站http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html分析二硫键数量。http://tools.immuneepitope.org/bcell/和NetCTL (http://www.cbs.dtu.dk/services/)预测蛋白可能存在的线性B细胞抗原表位和T细胞结合位点。在线软件https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_server.html预测二级结构。SWISS-MODEL Workspace分析三级结构。

2 结果 2.1 Plancitoxin-1-like基因的克隆

从旋毛虫中扩增得到一条885 bp的序列(图 1)，与plancitoxin-1(Tsp_09974, GenBank No. XM_003370715.1)相比，核苷酸序列少210 bp，缺少部分位于184—393位，将其命名为plancitoxin-1-like。从肌幼虫、成虫和新生幼虫扩增得到的plancitoxin-1-like序列均一致，而从基因组扩增的序列与NCBI公布的1 471 bp一致。Plancitoxin-1-like编码294个氨基酸，比plancitoxin-1少70个氨基酸，缺少部分位于62—131位。保守区域预测显示plancitoxin-1只有一个HKD基序，且位于C端，但plancitoxin-1-like在N端和C端均具有HKD基序。

M. DNA相对分子质量标准(DL2000)；1.水对照；2.肌幼虫；3.新生幼虫；4.成虫；5.基因组 M. DNA marker ladder (DL2000); 1. ddH2O control; 2. ML; 3. NBL; 4. Ad; 5. T. spiralis genome 图 1 旋毛虫plancitoxin-1-like基因的PCR扩增 Figure 1 Amplification of T. spiralis plancitoxin-1-like gene by PCR
2.2 同源性分析

Plancitoxin-1-like的核苷酸序列与其他物种的DNase Ⅱ的相似性较低，最高的是广杆属线虫CBR-CRN-6基因(10.07%)，与人类、牛、马、猪、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼、非洲蟾蜍、果蝇、海星、河豚、类鼻疽杆菌、盘基网柄菌、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、冈比亚按蚊、广杆属线虫和秀丽杆线虫等DNase Ⅱ成员的相似性集中在34%~38%，与海星plancitoxin-1具有40.18%的相似性，遗传进化关系上被分在一个进化支(图 2)，但保守区域基本相同。Plancitoxin-1-like与低等生物具有较近的亲缘关系，且更靠近于DNase Ⅱβ。

图 2 Plancitoxin-1-like与其他物种DNase Ⅱ家族蛋白的遗传进化树分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of plancitoxin-1-like and other previously reported DNase Ⅱ family proteins
2.3 Plancitoxin-1-like的理化性质分析

Plancitoxin-1-like的理论相对分子质量为33.19 ku，理论等电点为9.17。分子式为C1507H2333N399O425S1。不稳定系数为39.25，属于稳定存在蛋白质。氨基酸由20种氨基酸组成，不含Sec和Pyl，其中频次较高的氨基酸残基有Leu、Ser和Lys；频次较低的氨基酸残基有Met、Cys和His。正电荷残基数(R+K)为33个，负电荷残基数(D+E)为24个。含有26个稀有密码子，其中有两处连续出现稀有密码子，在大肠杆菌中呈可溶性表达的可能性为8.8%。在287位亲水性分值最高(1.967)，有最强的疏水性；在175位分值最低(-2.811)，有最强的亲水性。

2.4 序列结构分析

在N19GS、N49NT、N209CS和N262RS共有4个N-糖基化位点。在L22、L26和A108共有3个O-糖基化位点。存在31个磷酸化位点，分别为14个Ser、9个Thr和8个Tyr，潜力值均大于0.5。有17个B细胞线性结合位点和9个T细胞结合位点。蛋白质二级结构主要由42个α-螺旋(14.29%)、83个延伸链(28.23%)和162个无规卷曲(55.10%)构成。存在3个二硫键，分别位于59和101位、210和269位、250和289位(图 3)。Plancitoxin-1-like三维结构同源模型见图 4，三级结构预测发现，蛋白质序列与PDB数据库中5i3e.1.A模板序列相似性为31.79%。

图 3 Plancitoxin-1-like蛋白二级结构分析 Figure 3 Predicted secondary structure of plancitoxin-1-like protein
图 4 Plancitoxin-1-like三维结构同源模型 Figure 4 Three-dimensinal model of plancitoxin-1-like
3 讨论

1999年，C. H. Mak等首次发现旋毛虫排泄分泌产物具有降解DNA的活性[8]。来源于排泄分泌产物的43 ku蛋白质与哺乳动物DNase Ⅱ序列具有一定的同源性[9]，但由于缺乏DNase Ⅱ保守的活性位点，该43 ku蛋白质是否具有DNase Ⅱ活性仍然存在争议。2011年公布的旋毛虫基因组显示，旋毛虫可能存在一个高达125种DNase Ⅱ蛋白家族。人类、牛、马、猪、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼、非洲蟾蜍、果蝇、海星、河豚、类鼻疽杆菌、盘基网柄菌、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、冈比亚按蚊、广杆属线虫和秀丽隐杆线虫等物种只有一种或几种DNase Ⅱ[10]，而秀丽隐杆线虫具有最多DNase Ⅱ。但旋毛虫拥有如此多的DNase Ⅱ家族成员有何作用仍不清楚。43 ku蛋白具有一个螺旋环螺旋基序分子结构，具有调节肌细胞分化的功能[11]，因此与旋毛虫包囊形成有关[12]。125种旋毛虫DNase Ⅱ蛋白50%以上的基因编码排泄分泌产物，DNase Ⅱ蛋白被认为是控制和预防旋毛虫病的理想疫苗候选蛋白质。

DNase Ⅱ在N端和C端包含有两个保守的HKD基序(H-x-K-x(4)-D)[7]。旋毛虫p43、SS1和AAK85403三个蛋白与人类DNase Ⅱ具有一定的相似性，但缺乏DNase Ⅱ经典的HKD基序[13]。但除了plancitoxin-1具有一个DNase Ⅱ保守活性位点，其他124种DNase Ⅱ蛋白都不具有DNase Ⅱ保守活性位点。在本研究中，plancitoxin-1-like具有两个HKD基序，分别位于序列的N端和C端。由于小鼠、大鼠、河豚和斑马鱼DNase Ⅱβ的C端保守区域为DHSK，因此，根据DNase Ⅱα和DNase Ⅱβ在C端的HKD保守基序分别为DHSK和DHAK的说法很难把plancitoxin-1-like归为DNase Ⅱα还是DNase Ⅱβ。但遗传进化树分析显示，plancitoxin-1-like的亲缘关系更靠近于DNase Ⅱβ(图 2)。

4 结论

以旋毛虫总RNA为模板进行RT-PCR，获得旋毛虫plancitoxin-1-like基因，得到的核苷酸序列为885 bp，编码294个氨基酸，由20种氨基酸组成。其氨基酸序列在N端和C端都具有HKD基序。蛋白质理论相对分子质量为33.19 ku，等电点为9.17，是稳定存在的亲水性蛋白。plancitoxin-1-like的氨基酸序列与其他物种DNase Ⅱ的相似性为35%左右。

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