2. 广州市南沙区动物防疫监督所, 广州 511458
2. Servicing Department of Pasturage of Nansha District, Guangzhou 511458, China
禽流感(avian influenza)是由A型流感病毒引起的禽类(家禽和野禽)的感染和/或疾病综合征[1]。禽流感病毒感染、非家禽的鸟类包括野生鸟类高致病性A型流感病毒感染被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告疫病[2]。高致病性禽流感临床症状主要表现为采食量下降、鸡冠发绀、产蛋率下降、精神萎靡、呼吸困难等,剖检常见腺胃、肌胃角膜出血[3]。流行特征主要为潜伏期短,传播快,发病急,死亡率可达100%,同时可引起人感染发病,甚至死亡,因此备受关注。H5N6亚型禽流感病毒曾以低致病性形式在大部分国家的禽类中存在。现在情况已发生变化,监测数据显示,目前在我国南方地区H5N6亚型禽流感病毒监测到的比例增大,禽类、野鸟和活禽市场中都曾分离到,毒株的致病力有逐渐增强的趋势[4-5]。2014年8月23日,黑龙江省哈尔滨市首次发生了鹅感染H5N6禽流感疫情[6]。2015年4月,香港首次从野鸟中检测出H5N6亚型禽流感病毒[7]。根据农业部疫情发布数据统计,2010年1月至2017年7月,我国共发生禽流感疫情37起,H5N6亚型禽流感疫情占到疫情发生数的76.2%,H5N6已取代H5N1成为禽流感病毒优势流行亚型,发生省份或自治区包括湖南、湖北、新疆、四川、甘肃、贵州、广东、江苏等地,呈全国范围流行。2014年5月7日,四川省出现了全球首例人感染H5N6亚型禽流感病毒致死病例,H5N6亚型禽流感也跨越了宿主屏障,对人类健康安全造成了威胁[8]。
新型优势毒株的出现和流行趋势的变化引发了广泛的关注。研究显示,新型H5N6亚型禽流感病毒可能是通过抗原转变的变异方式,由H5N1亚型禽流感病毒与H6N6亚型禽流感病毒重组而来,毒力更强、传播更快、发病率和死亡率更高[9]。近年来流行的H5N6亚型禽流感病毒作为一种新型流感病毒,其进化机制、流行趋势和致病性尚不明晰,需要密切监测、系统和深入的研究与分析。
本研究对2015—2016年广东临床送检的病料进行病毒分离鉴定,得到4株H5N6亚型禽流感病毒,通过点眼滴鼻方式攻毒,研究其对SPF鸡的致病性,为禽流感的防控提供数据参考。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与实验动物总RNA抽提试剂盒购自上海飞捷生物技术有限公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Magen公司;反转录酶、Ex Taq聚合酶、DL1000 Marker、DL2000 Marker等购自TaKaRa公司;随机引物、反转录引物、PCR扩增引物购自广州艾基生物有限公司;9~11日龄的SPF鸡胚购于广东大华农动物保健品有限公司;4周龄SPF鸡购于新兴大华农SPF实验动物中心。
1.2 试验样品2015—2016年湛江、惠州、清远等地临床送检样品,由人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室保存。
1.3 病毒分离与鉴定临床病料称重研磨后,按1 g·mL-1加入PBS,冻融3次,10 000 r·min-1离心3 min,取上清接种。每个样品接种3枚9~11日龄SPF鸡胚。每隔12 h照胚,将死亡鸡胚4 ℃保存,收取含有病毒的尿囊液,48 h后通过HA/HI试验鉴定禽流感病毒的HA亚型。抽提病毒RNA。
1.4 基因测序及进化分析利用各基因特异性引物(表 1)进行PCR扩增、纯化,纯化产物克隆到pMD18-T载体上, 阳性克隆送广州艾基生物技术有限公司进行测序。用NCBI Blast进行序列比对;用MEGA6.06软件进行进化树分析;用NetNGlyc 1.0 Server分析序列糖基化位点。
尿囊液按照10倍稀释法稀释成10-5~10-9 5个稀释度,每个稀释度各接种5枚9~11日龄非免疫胚,0.2 mL·枚-1,37 ℃培养,弃去12 h内死亡鸡胚,12 h后死亡鸡胚放入4 ℃中保存,48 h后测定所有感染鸡胚的尿囊液血凝活性,来判断该鸡胚是否被感染。通过Reed-Muench法计算病毒EID50。
1.6 对SPF鸡致病性试验及同居试验将4周龄SPF鸡随机分为4组,每组12只(攻毒组6只,同居组6只),另设一组空白对照组(6只),每只鸡戴上脚标登记编号。攻毒组每只鸡经点眼、滴鼻方法接种105 EID50 200 μL病毒尿囊液,同居组和空白对照组不攻毒,随后连续观察9 d,并随时记录各组鸡的临床症状和鸡的死亡情况。饲养期间分别于感染后3、5、7、9 d采集各组鸡的咽、肛拭子,用含有青霉素与链霉素各5 000 IU的PBS缓冲液振荡,各接种3枚9~11日龄的非免疫胚,37 ℃孵化,48 h后测定鸡胚尿囊液的血凝活性,判断是否存在病毒感染。
在攻毒后4 d随机剖杀攻毒组和对照组鸡,无菌采取心、肝、脾、肺、肾、脑6种组织,用含有5 000 IU双抗的无菌PBS液倍比稀释成10-1~10-7 7个稀释度接胚,测定病毒感染SPF鸡后各个组织脏器中病毒复制能力。
1.7 病理组织学观察在攻毒后4 d随机剖杀攻毒组、同居组和对照组鸡,分别取心、肝、脾、肺、肾、脑6种组织,用甲醛浸泡固定,送武汉赛维尔生物科技有限公司进行病理切片分析。
2 结果 2.1 病毒分离2015—2016年临床样品共分离到4株H5N6亚型禽流感病毒(表 2)。
基因序列分析结果显示,分离株HA基因相似性在95.4%~97.1%之间,HA基因位于Clade2.3.4.4 (图 1),NA基因属于欧亚分支(图 2)。
HA氨基酸序列分析结果表明,HA基因编码567个氨基酸,具有8个潜在糖基化位点(表 3)。HA蛋白的裂解位点处具有多个连续碱性氨基酸,符合高致病性禽流感病毒分子特征。NA基因编码459个氨基酸,具有6~7个潜在糖基化位点(表 4)。HA基因编码HA受体结合位点存在S137A突变;NA蛋白相应位点没有改变;PB1蛋白的L13P位点、PA蛋白的N615K位点、NP蛋白的A184K位点和NS1蛋白的D92E位点发生改变(表 5)。
试验中所有感染病毒的鸡胚都在12~24 h死亡,病毒EID50结果如表 6。
SPF鸡的致病性试验结果发现,攻毒后第2天,16274、16875和16887攻毒组全部死亡,同居组到第3天死亡率达50%以上。15577攻毒组至第5天全部死亡,同居组第9天全部死亡。对照组无鸡死亡(表 7)。
15577攻毒组死亡的鸡脑和肺中病毒滴度较其他脏器高,lg EID50·200 μL-1值大于4.50,而心和肾的病毒滴度较低,为2.25~2.75。16274攻毒组死亡的鸡肺和肝中病毒滴度较其他脏器高些,lg EID50·200 μL-1平均值分别为6.13和5.00,心和肾病毒滴度相对低些,为3.88、3.50。16875和16887攻毒组死亡的鸡6个脏器中病毒滴度值差距不大,病毒滴度都在4.5左右。空白对照组没有检测到病毒滴度(图 3)。
15577组的攻毒组和同居组第3天开始都能分到病毒,一直到第9天鸡死亡为止;其余各攻毒组第2天鸡全部死亡,咽、腔拭子无数据;同居组除了16875组咽拭子没检测到病毒外,其余同居组从第3天咽、腔拭子均分离出病毒;空白对照组所有咽、腔拭子都分离不出AIV(表 8)。
病理切片结果发现,病毒对鸡的肺组织、肝组织、脑组织、脾组织、肾组织和心肌造成了广泛性的损伤。主要的病变:肺和肾充血、出血;肝细胞坏死,淋巴细胞浸润;脑组织坏死,神经胶质细胞增生;脾细胞坏死、减少;心肌纤维坏死、充血(图 4~9)。
禽流感病毒为RNA病毒,有8个片段,RNA酶的复制精确程度比不上DNA酶,存在较多突变,有些突变能增强病毒的感染力,有些突变则是减弱病毒的毒力。有些单一突变能增强病毒的繁殖力和致病力,有些致病力改变需要多片段、多位点共同突变完成,是一个协调作用的过程。总体而言,本研究中的禽流感病毒分离株有多基因片段发生了突变,如PB1的L13P、PA的N615K,NP的A184K、NS的D92E等,导致了禽流感病毒毒力的增强[10-13]。有研究显示HA的Q226L、G228S双位点突变,PB2的E627K、Q591K和D701N突变,NS的G540A独特突变等,可增强病毒在哺乳动物细胞的感染和繁殖能力[14-16]。这些突变在本研究中未发现。
对SPF鸡致病性试验发现,15577株为2015年分离到的毒株,与2016年分离到的另外3个毒株相比,致死性和水平传播力稍弱,是否说明广东H5N6亚型禽流感病毒的毒力在变强,这有待于更多样本数据的研究。
研究发现,4个毒株在感染鸡的心、肝、脾、肺、肾、脑中均检测到禽流感病毒。其中15577株和16274株病毒肺和脑中病毒滴度最高,心、肾中病毒滴度较低;16875株和16887株病毒比较均衡得存在于6个脏器中,各个脏器组织的病毒滴度都很高,引发严重的内脏器官功能障碍,导致机体死亡。在排毒试验中,鸡从开始检测咽、腔拭子排毒情况到死亡之前都能发现持续不间断的排毒,其中泄殖腔排毒是重要的排毒方式,所有鸡泄殖腔拭子都能检测到病毒,提示要做好粪便的无害化处理。
禽流感病毒对机体的损伤主要是通过病毒对脏器组织的损伤,引发功能性障碍,最终出现多器官衰竭而死。在H5N6亚型禽流感病毒感染鸡的剖杀过程中,发现有脑的皮下出血、心包炎、心肌坏死、肝坏死等症状。病理切片可观察到禽流感病毒感染鸡的肺和肾充血、出血;肝细胞坏死,淋巴细胞浸润;脑组织坏死,神经胶质细胞增生;脾细胞坏死、减少;心肌纤维坏死、充血等组织学病变。
4 结论从广东省临床病料中分离到4株H5N6亚型禽流感病毒,遗传序列分析结果表明,分离株HA基因位于2.3.4.4分支,HA蛋白裂解位点具有连续碱性氨基酸序列,属于高致病禽流感病毒。SPF鸡的致病性试验表明,4株禽流感病毒对SPF鸡具有高致病性,致死率为100%,具有致死快、死亡率高的特点。因此,建议加强对H5N6亚型禽流感的监测与防控,严防禽流感疫情的发生。
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