马梨形虫病(equine piroplasmosis，EP)是由马泰勒虫(Theileria equi)^[1-2]和/或驽巴贝斯虫(Babesia caballi)^[3-4]引起的蜱传血液原虫病^[5]。该病主要感染马属动物(马、骡、驴和斑马)，呈急性、亚急性或慢性发病等。患病时动物通常呈发烧，贫血，黄疸，肝、脾肿大，血管内溶血，可视黏膜黄染及血红蛋白尿等表征^[6]，但慢性感染时临床症状不明显^[7]；患病马匹即使后期治愈后也会终身带虫，作为传染源传播给其他马属动物；该病广泛分布在热带和亚热带地区^[8]，据联合国粮食和农业组织的数据显示，2013年世界范围内马匹存栏量约1.12亿匹，其中全球大约90%的马属动物分布在马梨形虫病流行地区^[9]。近年来，多个国家有马梨形虫病的报道，如韩国、蒙古、委内瑞拉、突尼斯、苏丹、意大利、匈牙利、沙特阿拉伯、墨西哥及美国德克萨斯等^[7]，对马产业造成重大经济损失；在国际马术竞技比赛中马梨形虫病作为重要的检测项目之一^[10]。为保持健康良好的国际性马产业市场，对马梨形虫病的防控至关重要。

补体结合试验(CFT)是常用于检测马泰勒虫病的方法^[10]，然而因其低灵敏度和检测速率等因素对检测造成一定的限制^[12]。间接荧光抗体试验(IFAT)也可用于诊断马泰勒虫感染，但通常受到抗体的检测范围和交叉反应性的影响；除CFT和IFAT之外，基于马泰勒虫裂殖子抗原的ELISA已被用于抗体检测^[13]。近几年，通过重组抗原建立的几种ELISA检测方法，已证明其诊断慢性马泰勒虫病感染是非常有效的^[14]。新疆作为马泰勒虫病的流行疫区，其急性病例死亡率达30%，制约着新疆马产业的健康发展^[15]。笔者拟构建马泰勒虫新疆株EMA-1基因原核表达载体及其间接ELISA方法，为马泰勒虫病的血清学诊断及地方疫区马梨形虫病的检测、监控及综合防控提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 材料

马泰勒虫新疆流行虫株Te-Y(伊犁分离株)，pGEX-4T-1表达载体及马泰勒虫标准阳性、阴性血清均由新疆农业大学动医学院寄生虫实验室提供；待检血清样品采自于新疆伊犁地区的放牧马。

组织/全血DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自德国QIAGEN公司；胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4连接酶和pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司；大肠杆菌DH5α、BL21感受态细胞为北京全式金生物技术有限公司产品；HRP标记的兔抗马IgG、DAB显色试剂盒和四甲基联苯胺(TMB)购自上海生工生物有限公司；马泰勒虫cELISA检测试剂盒购自美国RMVD公司；其他常规试剂均为国产分析纯；所用水为超纯水。

1.2 引物设计与合成

基于马泰勒虫虫株(GenBank登录号AF255730)EMA-1全基因序列设计的PCR引物：EMA1-P1(5′-CGGATCCATGATTTCCAAATCCT-3′)和EMA1-P2(5′-TTGCGGCCGCTTAGTAAAATAGAGTAGAGT-3′)，加下划线的序列分别对应BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，基因片段大小为819 bp。引物由上海生工公司合成。

1.3 EMA-1基因的扩增

使用DNA提取试剂盒提取马泰勒虫新疆株(Te-Y)的基因组DNA。通过PCR技术对EMA-1全长基因(819 bp)进行扩增(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s；30个循环)，扩增的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳加以确证，并用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。

1.4 表达载体的构建与鉴定

将回收产物连接到pMD18-T载体中，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落接种至含100 μg·mL^-1氨苄青霉素的LB液体培养基，收集菌液进行测序。对重组质粒和pGEX-4T-1载体双酶切(BamHⅠ和EcoRⅠ)回收目的片段和空载体，用T4 DNA ligase于16 ℃过夜连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。测序和酶切验证正确的重组质粒pGEX-4T-1/EMA1转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

1.5 重组GST-EMA1蛋白的诱导条件筛选及鉴定

在含100 μg·mL^-1氨苄青霉素的LB培养基(50 mL)中小规模诱导，测定重组蛋白质的表达情况。于37 ℃ 200 r·min^-1下进行诱导时间(1、3、5、7和12 h)和诱导剂IPTG浓度(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol·L^-1)的最佳条件筛选，通过12%的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析蛋白质表达情况。

1.6 重组蛋白质的纯化及其反应原性测定 1.6.1 蛋白质的纯化

根据高慎阳等^[16]的KCl染色切胶纯化法稍作改进，收集最佳诱导条件下菌体，样品处理后进行SDS-PAGE电泳，用适量的0.25 mol·L^-1的KCl溶液染色后，切下目的条带碾碎加入500 μL PBS涡旋混匀，置于-80 ℃反复冻溶3次后12 000 r·min^-1离心2 min取上清，用紫外分光光度仪测定上清中蛋白质浓度，置于-20 ℃保存备用。

1.6.2 Western blot

取10 μL重组蛋白质样品(~5 μg的蛋白质含量)进行SDS-PAGE电泳后，半干转印于NC膜上，封闭液(5%脱脂奶，含0.5% Tween的PBS稀释)封闭1 h；加马泰勒虫阳性血清37 ℃反应1.5 h；加二抗(HRP-兔抗马IgG)37 ℃温育1 h。最后，向膜上滴加DAB显色液，避光37 ℃孵育10 min，观察结果。

1.7 重组EMA-1为包被抗原建立间接ELISA 1.7.1 抗原包被浓度和血清稀释倍数的选择

采用九宫格的方法：包被质量浓度分别为1、2、3、4、5和6 μg·mL^-1，血清稀释倍数分别为1:100、1:200、1:400、1:800。P/N值最大的一组为最佳蛋白质浓度和血清稀释倍数。

1.7.2 最佳酶标二抗稀释倍数的选择

以确定的包被浓度和血清稀释倍数为基础，按1:1 000、1:2 000、1:4 000、1:8 000、1:10 000、1:20 000稀释二抗。P/N值最大的一组为二抗最佳稀释倍数。

1.7.3 最佳包被液的选择

分别以碳酸盐缓冲液(0.05 mol·L^-1 pH9.6，CB)、磷酸盐缓冲液(0.01 mol·L^-1 pH7.4，PBS)、Tris-HCl缓冲液(0.05 mol·L^-1 pH8.5)、NaOH(0.01 mol·L^-1 pH9.6)、生理盐水(0.05 mol·L^-1 pH7.0，NS)和双蒸水(dH₂O)作为包被液，按照优化好的最佳抗原包被浓度进行包被，每孔100 μL，4 ℃过夜包被，按照优化好的最佳血清稀释浓度进行检测，以P/N值最大为判定标准，即为最佳包被液。

1.7.4 最佳封闭液的选择

分别用0.05%脱脂奶、2.0%脱脂奶、5.0%脱脂奶、0.05% BSA、2.0% BSA、5.0% BSA作为封闭液，每孔150 μL，37 ℃封闭1 h，按照上述优化好的条件进行检测，以P/N值最大的一组作为最佳封闭液。

1.7.5 血清稀释液的选择

分别以PBS、PBST1(0.05% Tween-20)、PBST2(0.1% Tween-20)、0.1% BSA、5%脱脂奶(SM)和0.05% Tween-20的SM(SMT)作为一抗稀释液。选定最大P/N值一组作为最佳稀释液。

1.7.6 血清反应时间的选择

加入稀释的一抗后，分别在37 ℃孵育0.5、1.0、1.5、2.0 h，进行ELISA检测，选定P/N值最大时为最佳反应时间。

1.7.7 酶标抗体反应时间的选择

加入稀释的酶标二抗后，分别在37 ℃孵育0.5、1.0、1.5、2.0 h，进行ELISA检测，P/N值最大时选为最佳反应时间。

1.7.8 TMB底物反应时间的选择

避光环境下，加入TMB底物溶液后分别于37 ℃培养箱反应10、15、20、25 min，加入50 μL 2 mol·L^-1 H₂SO₄ 终止反应，P/N值最大时选为最佳反应时间。

1.7.9 ELISA判定标准的确定

用上述优化好的ELISA检测方法，对实验室保存的36份马泰勒虫病阴性血清进行检测，每份血清做3个重复检测，取3份检测孔的平均值，计算检测样品OD_{450 nm}的x±s，根据统计学，当样品的OD_{450 nm}值大于阴性样品OD_{450 nm}值的x±2s时，即可判定样品为阳性，否则为阴性。

1.7.10 敏感性试验

将马泰勒虫标准阳性血清按照1:100、1:200……1:12 800倍比稀释，其余条件同ELISA。

1.7.11 特异性试验

用ELISA方法同时检测马泰勒虫病、驽巴贝斯虫病阳性血清和健康马血清，判断ELISA与其他马病的病原有无交叉反应。

1.7.12 批内批间重复性试验

用同一批次和不同批次纯化的蛋白质包被，分别检测10份阳性血清和5份阴性血清，重复试验3次，分别计算每个样品的平均值、标准方差和变异系数，确定ELISA同批和不同蛋白质抗原的变异系数范围。

1.7.13 符合性试验

对采集的96份马血清，分别用建立的间接ELISA和cELISA检测试剂盒检测，结果以商品试剂盒的结果为标准，计算二者的符合率。对结果不一致的样品，以试剂盒的结果为准。

$ 符合率=\frac{结果相同的样品数}{样品总数}\times 100\% $

2 结果 2.1 GST-EMA1重组蛋白质表达质粒的构建

将新疆株EMA-1全基因序列克隆于原核表达载体pGEX-4T-1，构建pGEX-4T-1/EMA1重组质粒，并酶切鉴定(图 1)。

2.2 GST-EMA1蛋白表达条件优化

测序和酶切验证正确的重组质粒pGEX-4T-1/EMA1转化至大肠杆菌菌株BL21(DE3) 进行蛋白质表达。最佳诱导条件：加入终浓度1.0 mmol·L^-1 IPTG在37 ℃ 200 r·min^-1条件下诱导5 h获得最佳表达；通过12%的SDS-PAGE分析蛋白质表达情况，见图 2。

2.3 蛋白质的纯化及其反应原性分析 2.3.1 纯化后重组蛋白质SDS-PAGE鉴定

紫外分光光度仪测定纯化后蛋白质质量浓度在0.9~2.1 mg·mL^-1。取10 μL处理后样品进行SDS-PAGE电泳验证，见图 3。

2.3.2 Western blot

结果表明重组蛋白质能够与马泰勒虫阳性血清反应，具有很好的特异性和反应原性(图 4)。

2.4 ELISA最佳反应条件的确定

通过对抗原包被浓度，血清、酶标二抗稀释倍数，最佳反应时间的确定，以及包被液、封闭液、稀释液的选择，确定如下操作程序：① 酶标板每孔加入100 μL 4 μg·mL^-1蛋白质，4 ℃包被过夜；② 每孔加入200 μL PBST溶液洗涤5次；③ 加入150 μL 0.05%脱脂奶37 ℃封闭1 h，洗涤同上；④ 每孔按1:400加入血清与5%脱脂奶，37 ℃反应30 min，洗涤同上；⑤ 每孔按1:10 000加入HRP标记兔抗马IgG与5%脱脂奶，37 ℃反应30 min，洗涤同上；⑥ 各孔加入100 μL TMB底物溶液，37 ℃反应15 min；⑦ 每孔加入50 μL 2 mol·L^-1 H₂SO₄；⑧ 在450 nm处测定各孔的OD值。

2.5 阴阳性临界值的确定

用上述优化好的ELISA检测方法，对实验室保存的马泰勒阴性血清取36份进行检测，每份血清做3个重复检测，取3份检测孔的平均值，计算检测样品OD_{450 nm}的平均值和标准方差，根据统计学，当样品的OD_{450 nm}值大于阴性样品OD_{450 nm}值的x+2s时，即可判定样品为阳性。临界值为0.353，大于0.353为阳性；小于0.353为阴性。见图 5。

2.6 ELISA方法评测情况 2.6.1 敏感性试验

将马泰勒虫标准阳性血清按照1:100、1:200……1:12 800倍比稀释，其余条件同ELISA。最终确定当阳性血清稀释至1:1 600时其结果仍为阳性。

2.6.2 特异性试验

用ELISA方法检测的马驽巴贝斯虫病阳性血清和健康马血清，OD_{450 nm}值均在0.2以内，判断ELISA与其他马病的病原有无交叉反应。

2.6.3 重复性试验

对采集的10份马泰勒虫阳性血清和5份阴性血清，分别进行3次重复检测试验。其中同一批EMA-1蛋白抗原包被板批内变异系数在1.43%~14.79%，不同批次EMA-1蛋白抗原包被板批间变异系数在1.46%~11.06%。结果表明EMA-1蛋白的稳定性较好，具可重复性。

2.6.4 符合性试验

对采集的96份马血清，分别使用建立的ELISA和cELISA试剂盒进行检测：阳性率分别为27.1%(26/96) 和25.0%(24/96)；两者间阳性符合率为92.3%，阴性符合率为97.2%，总符合率为95.8%。

3 讨论

本试验首次对新疆马泰勒虫地方流行虫株(伊犁分离株)EMA-1基因进行克隆，并成功构建了重组质粒pEGEX-4T-1/EMA1，经优化诱导时间和IPTG浓度后，以包涵体的形式高效表达，虽用尿素溶液变性纯化，但洗涤后蛋白质浓度低，杂蛋白质较多。故后期使用KCl染色切SDS-PAGE胶进行蛋白质回收，提高目的蛋白质的纯度和回收率；经Western blot鉴定，重组GST-EMA1蛋白能够被马泰勒虫阳性血清特异性识别，说明EMA-1抗原能与抗体特异性结合。

ELISA检测马泰勒虫抗体与其他血清学诊断方法(CFT，IFAT)相比^[17-19]，ELISA方法速度快，对实验条件要求不高，更适用于基层实验室血清学诊断及大规模疫病普查^[20]。本研究所建立的间接ELISA具有很好的特异性、敏感性和重复性，与cELISA商品试剂盒相比，两者的符合率可达95.8%，与其他学者建立的间接ELISA检测符合率^[21-23]的结果相符。

4 结论

基于马泰勒虫重组EMA-1蛋白建立的间接ELISA方法可以用于检测抗马泰勒虫血清抗体效价，虽然不能代表机体的中和抗体效价，但其检测速度快，对实验条件要求不高，安全便捷，在短时间内可以检测大量样品，非常适于基层大批临床马血清样品的检测，为患马泰勒虫病的马匹体内IgG抗体水平监测与检测试剂盒的开发奠定了基础。