羊是重要的经济动物，在各国畜牧业发展中占据重要位置。目前，中国已成为世界上羊肉生产、消费与贸易的第一大国，具有多个优质山羊品种，尤其是陕西省的陕北白绒山羊、萨能奶山羊、陕北黑山羊^[1]。然而，随着羊产业规模的不断扩大，有关羊群疾病的研究和报道也越来越多，羊群疾病已成为阻碍羊产业发展的重要因素。毕氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)是一种具有重要公共卫生学意义的人畜共患病原，宿主范围广泛，致病力强^[2-4]。据报道，无论是发达国家还是发展中国家均有越来越多的人和动物感染E. bieneusi, 如猪(瑞士，28/109)、奶牛(美国，70/413)、山羊(西班牙，1/7)、马(哥伦比亚，21/195)、狗(日本，2/79) 等^[5-8]。虫体侵入宿主小肠上皮细胞和胆道上皮细胞后，可引发宿主肠炎、胆道炎、胆管炎等，尤其对艾滋病人等免疫力缺陷病人造成严重的危害^[9-13]。

准确分析病原的遗传多样性是进行感染性疾病有效防控的基础和核心。虽然E. bieneusi种系相对单一，但仅根据孢子的大小、形态等数据仍无法将毕氏肠微孢子虫与其他种的微孢子虫准确区分，且基于核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)的分子生物学分析发现毕氏肠微孢子虫存在遗传多样性，包括多种人兽共患基因型和动物特异性基因型^{[8, 14-16]}。基于毕氏肠微孢子虫ITS基因检测的结果虽准确，但却无法明确E. bieneusi各基因型的来源、传播途径等，且同一ITS基因是否存在多样性仍无法阐明。为了能更加精确地分析毕氏肠微孢子虫的基因型和遗传特征，Y.Y.Feng等^[17]根据E. bieneusi基因组序列选取3个微卫星(MS1、MS3、MS7) 和1个小卫星(MS4) 位点开发了用于E. bieneusi的多位点序列分型(multilocus sequence typing，MLST)技术，该方法具有较高的灵敏度，能展示同一ITS基因型的多态性^[18]。

笔者课题组利用基于ITS的分子生物学技术对陕西省部分地区的奶山羊、黑山羊和绒山羊的毕氏肠微孢子虫检测发现，这些羊中广泛存在毕氏肠微孢子虫的感染，并存在多种基因型^[1]。为了进一步明确毕氏肠微孢子虫的遗传多样性，笔者利用MLST技术对这些羊的毕氏肠微孢子虫进行了多位点基因分型研究。

1 材料与方法 1.1 样品

经基于ITS的分子生物学方法鉴定为毕氏肠微孢子虫阳性^[1]的陕西不同地区山羊的122份粪便样品保存于2.5%的重铬酸钾溶液中，置4 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

粪便基因组E.Z.N.A.^®DNA提取试剂盒购自OMEGA；10×Ex Taq buffer、Ex Taq DNA聚合酶、2.5 mmol·L^-1 dNTP、25 mmol·L^-1 MgCl₂、6×Loading Buffer、DL2000 DNA marker、溴化乙锭(ethidium bromide，EB)购自大连宝生物工程有限公司；琼脂糖购自上海英潍捷基贸易有限公司。

1.3 粪便样品基因组DNA的提取

每份粪便样品分别取200 mg置于1.5 mL离心管中，加入蒸馏水，混匀，12 000 g离心1 min，弃上清，重复以上步骤直至洗净重铬酸钾溶液；然后严格按照粪便基因组E.Z.N.A.^®DNA提取试剂盒说明书提取粪样基因组DNA，并置于-20 ℃保存备用。

1.4 PCR扩增及电泳

参照Y.Y. Feng等^[17]建立的基于3个微卫星位点(MS1、MS3、MS7) 和1个小卫星位点(MS4) 的MLST技术引物进行序列分型分析(表 1)。针对4个扩增位点，均采用巢式PCR扩增。两轮PCR反应体系基本相同，除第一轮PCR所使用的模板为样品中提取的基因组DNA，第二轮PCR所使用的模板为第一轮的扩增产物外，其他试验均按如下反应体系进行：10×Ex PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol·L^-1)2 μL，MgCl₂ (25 mmol·L^-1)2 μL，Ex Taq酶0.5 U，上、下游引物(50 μmol·L^-1)各1 μL，模板1 μL，加双蒸水至25 μL。扩增条件除退火温度不同以外，其他反应程序按照以下条件进行：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，退火(温度见表 1)45 s，72 ℃延伸1 min，进行35个循环；72 ℃再延伸7 min。取3 μL PCR扩增产物与0.5 μL 6×Loading Buffer混合均匀，按照顺序加入含1% EB的琼脂糖凝胶平板加样孔中，110 V电压下电泳30 min，借助紫外凝胶成像仪进行观察、鉴定。

1.5 测序及序列分析

将所有位点的第二轮阳性PCR产物样品编号记录，送往上海生工生物工程有限公司，使用ABI 3730 XL DNA自动分析仪(Applied Biosystems，USA)结合第二轮PCR的上游引物和下游引物进行双向测序。利用Clustal X 1.83软件，将测序获得的两条正反互补核苷酸序列进行比对校正，将校准序列使用BLAST进行相似性分析，基于每个位点的核心重复序列的变异进行基因分型分析，最终根据所有位点的基因型进行多位点基因分型研究。

2 结果 2.1 基于小卫星、微卫星位点巢式PCR扩增

在对122份毕氏肠微孢子虫阳性样品进行小卫星、微卫星位点巢式PCR扩增后发现，在MS1位点共检出有34个阳性样品，MS4位点共检出22个阳性样品，MS7位点共检出62个阳性样品(表 2)，但所有样品在MS3位点均没有得到有效扩增，未获得目的条带。在MS1、MS4、MS7三个位点同时得到扩增的样品共有9份。对比笔者所在课题组基于ITS位点鉴定的基因型^[1]发现，在56份新鉴定出的基因型SX1样品中，75%(42份)在MS7位点成功扩增，在MS4位点检出9份，在MS1位点检出5份，同时在以上三个位点成功扩增的有2份样品。在基因型BEB6样品中，仅有1份在三个位点均成功扩增。在基因型为CHG1的样品中，有2份在三个位点均成功扩增。在基因型为CHG2的样品中，有4份在三个位点均成功扩增。

2.2 MLST分析结果

本研究共获得的122份ITS位点阳性毕氏肠微孢子虫分离株分别在MS1、MS4和MS7位点的扩增效率依次为27.9%(34/122)、18.0%(22/122)、50.8%(62/122)。核苷酸序列分析表明，分别在MS1、MS4和MS7位点出现了16、9和18个核苷酸变异单倍型，形成了16、9和18个基因型，共形成了14个MLGs(表 3)。其中，50份绒山羊阳性样品在三个位点的扩增效率分别为10.0%(5/50)、14.0%(7/50) 和90.0%(45/50)，分别具有3、3和10个基因型，共形成了5个MLGs；56份奶山羊阳性样品的扩增效率依次为28.6%(16/56)、19.6%(11/56) 和8.9%(5/56)，分别组成4、4、1个基因型，共组成7个不同的MLGs；黑山羊阳性样品的扩增效率依次为81.3%(13/16)、25.0%(4/16)、75.0%(12/16)，分别具有9、2、7个基因型，构成2个MLGs。

3 讨论

毕氏肠微孢子虫作为一种重要的人兽共患病原，具有复杂的遗传多样性。早期检测毕氏肠微孢子虫的方法有吉姆萨染色法、革兰染色法、韦伯Chromotrope染色法、电子显微镜观察、免疫学方法等^{[8, 18-19]}。染色法虽操作简单，但要求检查人员有较丰富的经验，且无法鉴定微孢子虫的具体基因型；利用电子显微镜检查成本高，操作繁琐，应用于水样或粪样的研究时具有一定局限性；而免疫学方法虽特异性高、灵敏度高，但在应用于水样中微孢子虫的检查时表现出一定的局限性^[20]。近年来，基于ITS位点的分子生物学方法以其高特异性、高敏感性的特点，不仅作为毕氏肠微孢子虫的检测标记，还可准确鉴定毕氏肠微孢子虫的基因型^[21]。目前鉴定的毕氏肠微孢子虫ITS基因型已超过200个，其中一些具有宿主特异性，只存在于单一宿主，有些基因型可感染包括人在内的两种或多种宿主^{[15, 22-23]}，但由于以前对基因型的命名方法和规则不够规范，具有相同的ITS序列的基因型在不同的研究中被不同作者赋予了不同名称(如基因型Type Ⅳ也被命名为K、BEB5、BEB-var、MITS1、PtEBIII、peru2)。为了规范基因型名称，M. Santín等^[16]列述了当时的所有已报道的毕氏肠微孢子虫基因型，并讨论和统一规定了今后对毕氏微孢子虫的命名规则，为鉴定毕氏肠微孢子虫基因型提供了标准。

然而，ITS无法明确E. bieneusi各基因型的来源、传播途径等，新发现的基因型多数情况下只能证明对此宿主易感，其基因型分布、感染力强弱是否存在地域性特点、是否存在亚群体遗传等方面仍难以明确，故仅依靠ITS单一位点判定某基因型是否具有人兽共患性仍只能靠搜集同一基因型在不同宿主之间的感染病例数据来确认。为了能更加精确地分析毕氏肠微孢子虫的基因型和遗传特征，2011年，Y.Y.Feng等^[17]根据E. bieneusi基因组序列选取3个微卫星(MS1、MS3、MS7) 和1个小卫星(MS4) 位点开发了用于E. bieneusi的MLST技术。MLST最初被开发并应用于测定细菌的分型，通过应用巢式PCR扩增的手段来获取全基因组中多个位点的管家基因序列，以多个生物学标签的方式来更好地展示病原体的某些特性^[24]。通过应用MLST技术，可以发现不同来源的E. bieneusi基因型存在明显的亚型分布和群体遗传规律^[25-27]，并可配合多种生物技术更准确地鉴定及研究毕氏肠微孢子虫的生物学特性。

本研究首次将MLST技术用于山羊的毕氏肠微孢子虫的多位点基因分型研究，所使用的MLST分型工具的各位点是通过分析毕氏肠微孢子虫人分离株H348全基因组测序结果筛选而确立的^[17]，ITS基因型鉴定显示其具有宿主适应特性，因而所建立的MLST位点在部分宿主特异性进化群体中可能不存在对应位点或表达量过低，这可能是本研究中出现的某些位点(如MS3) 即使多次扩增也未得到目的条带的原因，尽管MS1、MS4和MS7也因此不能得到100%扩增，但本研究中MS1和MS7位点的扩增效率较高，与前人研究报道相符^{[2, 28]}。此外，本研究中MS1、MS4、MS7位点具有明显的核苷酸多态性(SNPs、碱基缺失和插入)，可依次形成16、9、18个基因型。在122份阳性样品中，共有9份阳性分离株均在MS1、MS4、MS7位点PCR扩增成功，且同一ITS基因型出现多种MLGs，表明山羊毕氏肠微孢子虫同一ITS基因型存在遗传多样性，MLST能更详尽地反映陕西部分地区山羊感染E. bieneusi基因型的复杂性，为山羊乃至其他动物及人微孢子虫病研究提供了基础资料。

4 结论

采用基于微卫星(MS1、MS3、MS7) 和小卫星(MS4) 位点的多位点序列分型技术首次对陕西省部分地区的不同用途山羊的122个毕氏肠微孢子虫分离株进行了多位点序列分型研究。结果显示，在MS1、MS4和MS7位点的扩增效率依次为27.9%、18.0%和50.8%，而在MS3位点所有样品均未获得有效扩增。序列分析表明，所有样品的MS1、MS4和MS7位点分别具有16、9和18个基因型，共形成了14个MLGs。其中，50份绒山羊阳性样品三个位点扩增效率分别为10.0%、14.0%和90.0%，分别具有3、3和10个基因型，共形成了5个MLGs；56份奶山羊阳性样品三个位点的扩增效率依次为28.6%、19.6%和8.9%，分别组成4、4、1个基因型，共组成7个不同的MLGs；16份黑山羊阳性样品在三个位点的扩增效率依次为81.3%、25.0%和75.0%，分别具有9、2、7个基因型，构成2个MLGs。