2. 滕州市畜牧局, 滕州 277599;
3. 山东农业大学 动物科技学院, 泰安 271018
2. Tengzhou Bureau of Animal Husbandary and Veterinary, Tengzhou 277599, China;
3. College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China
禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV)为反转录病毒科α-反转录病毒属成员,具禽C型反转录病毒的特征[1]。根据反转录病毒的生物学特性,ALV分外源性病毒和内源性病毒两种,其中外源性ALV的宿主都是鸡,包括A、B、C、D、J亚群[2-4]以及近年来疑似为K亚群的ALV[5-6],而内源性ALV以鸡为宿主的是E亚群。对鸡具有致病性的ALV以A、B和J亚群为主,目前我国鸡群中A、B两个亚群病毒报道较少,主要以J亚群为主[7-11],同时K亚群在地方品种鸡群中的分离率逐年增加[12]。目前我国鸡群ALV感染的现状是商品肉鸡、蛋鸡群中主要以ALV-J为主,地方品种鸡群中主要以ALV-K为主;发病鸡群中以ALV-J为主;健康鸡群以ALV-K为主。K亚群是2012年从江苏省地方品种鸡中分离到的一种新的ALV,近年来陆续从江苏省和华南地区饲养的不同地方品系鸡群中分离出[12-13]。相对于其他亚群ALV,K亚群ALV分离株在细胞中的复制较慢,对SPF鸡的致病性也比较弱[13]。其基因组结构属于典型的复制完整型的C型反转录病毒,囊膜糖蛋白gp85序列具有很高的相似性,与GenBank中已经发表的A~E五个经典亚群的相似性在77.7%~82.4%之间,与J亚群的相似性更是低于40%[5-6]。本研究对山东省某地区大型养殖场不同个体养殖场出栏肉鸡群进行外源ALV检测,分离到一株K亚群ALV,并对其进行全基因组序列分析以追踪其溯源,为我国ALV-K流行病学研究提供素材。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品背景从山东省某地方肉用型养殖场下属7个鸡场中出栏肉鸡群采集无菌抗凝血样品164份,饲养品种均带有地方品种鸡育种背景,包括各地固有的纯地方品种草公鸡和黑脚麻鸡以及纯地方品种鸡通过与进口的快大型白羽肉鸡培育出的优黄肉鸡,日龄为50~80 d。
1.1.2 细胞DF-1细胞由山东农业大学家禽肿瘤病研究室保存,用含10%的胎牛血清的DMEM传代,含2%的胎牛血清的DMEM维持,在5% CO2的37 ℃培养箱进行培养。
1.1.3 试剂DNA Marker DL2000/DL5000、pMD-18T载体和大肠杆菌DH5α克隆菌购自TaKaRa(大连)公司;DNA Gel Extraction Kit购自Omega公司;血液/组织/细胞DNA提取试剂盒为北京天根生化科技有限公司(Tiangen)产品;Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit购自美国IDEXX公司;DMEM培养基(高糖,含谷氨酰胺)、胎牛血清均为Gibco公司产品;胰蛋白酶购自Amresco公司。
1.2 病毒分离与鉴定将采集的抗凝血离心,取血浆接种DF-1细胞,37 ℃ CO2培养箱中培养2 h,用含2%胎牛血清的DMEM维持培养5~7 d,收集上清液,用IDEXX公司的ALV抗原检测试剂盒检测p27抗原。将病毒分离获得p27抗原阳性的细胞扩增培养,用0.25%胰酶消化,反复冻融3次,细胞悬液经12 000 r·min-1离心2 min收集细胞沉淀,按照血液/组织/细胞DNA提取试剂盒提取病毒前基因,作为含有ALV前病毒cDNA的模板。参照文献[5]针对env基因两侧的保守区合成一对通用引物Env-F/R,用于扩增ALV囊膜蛋白env基因的约2 200 nt片段,引物序列见表 1。
参照GenBank上发表的ALV-K(JS11C1,GenBank登录号KF746200) 的全基因序列,设计合成用于扩增前病毒基因组的引物FC1-F/R、FC2-F/R、FC3-F/R(表 1),对ALV分离株cDNA分为3个片段进行扩增,PCR产物连接至pMD-18T载体,转化DH5α,经筛选和鉴定,重组质粒经验证正确后送北京华大公司进行测序,每段进行三个克隆的测序。
1.4 前病毒全基因组序列分析应用序列分析软件DNAStar,获得ALV分离株的gp85核苷酸序列,推导其氨基酸序列分别与GenBank中已发表的不同亚群ALV的gp85氨基酸序列作相似性比较,初步根据相似性程度及遗传进化树来确定该分离株的亚群类型。进一步将ALV分离株的各个基因分别与国内外已报道的ALV毒株进行序列比较分析以追踪其溯源。用于比较分析的不同亚群ALV参考株和我国近年分离的ALV毒株信息见表 2。
本研究结合病毒分离和ELISA方法检测共获得25个ALV阳性样品,阳性比例高达15.2%。本次调查的7个肉鸡鸡场有6个养殖场均存在不同程度的外源性ALV感染。
2.1 病毒env基因的扩增经PCR扩增的ALV分离株env基因全长1 787 nt,gp85基因大小为1 005 nt,gp37基因大小为609 nt。其中gp85基因编码335个氨基酸,6个养殖场分离到的病毒gp85氨基酸相似性在99%以上,说明它们属于一株病毒,将该毒株命名为FC1505。将它的氨基酸序列与GenBank中已发表的鸡源ALV已知6个不同亚群参考株以及新定义的K亚群的氨基酸序列进行相似性比较,该分离毒株gp85氨基酸序列与A、B、C、D亚群参考毒株的相似性分别为86.1%、83.7%、88.1%和83.7%;与E亚群参考毒株的相似性平均为87%;而与J亚群的相似性更低,不到20%。然而,FC1505株与前期从江苏省地方品系鸡分离的疑似K亚群的毒株以及GenBank中来自华南地区黄羽肉鸡分离株、台湾土著鸡分离株、日本原种鸡分离株的氨基酸序列相似性高达95%以上,说明从山东肉鸡场中分离的FC1505毒株可能也属于ALV-K亚群。在ALV不同亚群毒株gp85同源性比较的遗传进化树中,也显示了FC1505毒株与这些分离株独特的亚群关系(图 1)。
应用DNAStar软件中的Seq Man程序,将获得的三段序列进行剪辑和拼接,最终获得FC1505分离株前病毒全基因组序列,全长7 497 nt,符合典型的C型复制完整型反转录病毒的特点,缺乏致瘤基因。本毒株和其他ALVs的比较见图 2。FC1505的三个主要基因gag、pol、env分别长2 106、2 688、1 791 nt,分别编码702、896、591个氨基酸。长末端重复序列位于病毒基因组的5′和3′端,长度为281 nt,包含U3-R-U5元件。
将病毒基因组进行分段比较,结果见图 2。FC1505的gag、pol和gp37基因与其他ALVs相比比较保守,相似性在90%以上,主要与日本分离株Sp_53等、广东分离株GDFX0601等以及江苏分离株JS11C1等相似性最高;与E亚群的相似性很高,分别为96%、99%和98%。R区和U5区序列与其他不同亚群相对比较保守,与A亚群和C亚群参考毒株的相似性均为92%。U3区和R区与分离自中国山东的毒株SDAU09E1相似性最高,达到99%,与广东分离株GDFX0603等、日本分离株CTS_053等以及台湾分离株TW-3593等的相似性也在93%以上。5′UTR序列与其他不同亚群相比相对比较保守,相似性在94%以上。3′UTRs区除了与分离自日本、中国台湾、山东和华南地区的ALV相似性很高以外,与J亚群的NX0101以及其他的ALV相似性也比较高。
3 讨论自2012年从我国江苏省地方品种鸡中分离到的一种命名为K亚群的ALV后,近年来陆续从江苏省和华南地区具有地方品系鸡育种背景的鸡群中分离到类似该亚群的病毒[12-13]。2011到2014年间,对来自山东、江苏和浙江三省份的临床样品分析表明其分离比例高于ALV-J[12]。本研究对山东省某地区养殖场出栏肉鸡群进行ALV检测,分离到一株K亚群ALV,并获得其全基因组序列,进一步丰富了我国ALV-K流行病学研究资料。
本研究分离的ALV毒株FC1505来源于固有的纯地方品种优质土鸡草公鸡、黑脚麻鸡以及纯地方品种鸡通过与进口的快大型白羽肉鸡培育出的优黄肉鸡,与前期实验室分离的JS11C1及江苏分离株和华南地区分离的类似K亚群的ALV分离株的gp85序列具有很高的相似性。同时这些毒株具有相似的宿主背景特点,鸡群都具有我国地方品系育种背景。近年来,我国自繁自养的地方品系鸡汶上芦花鸡、东乡绿壳蛋鸡、琅琊鸡以及与地方品种鸡杂交培育的优质黄羽肉鸡鸡群中陆续被报道存在K亚群ALV的感染[12-13],说明我国地方品种鸡群中ALV-K感染较为普遍。
对ALV-K分离株FC1505进行全基因组序列分析发现其主要编码基因gag、pol、env、3′UTR以及U3区序列均与之前我国大陆报道的K亚群ALV分离株[6]具有很高的相似性,同时它与来自亚洲东部其他地区(包括日本)具有致脑胶质瘤的ALV分离株[14-15]和中国台湾土著鸡群的ALV分离株[16]的相似性也很高。据资料显示,17世纪到19世纪,日本曾经与中国大陆和中国台湾存在鸡的贸易往来[17-18],感染这些ALV的日本土著鸡品种(如矮脚鸡)可能与中国的很多地方品种鸡来源于一个祖先。所以推测这些毒株可能属于一个在我国甚至东亚地区的地方品系鸡群中已长期存在的特有的亚群。虽然这些分离株的gp85基因与来自于西方国家的A~E亚群尤其是J亚群截然不同,但5′UTR、gag、pol以及3′UTR均与J亚群分离株具有很高的相似性,说明不同亚群ALV也可能本身具有相同的宿主来源,或者它们之间可能存在一定程度的重组。ALV属于反转录病毒,具有遗传不稳定性和多样性的特征[19]。这提示我们在加强对西方引种祖代鸡群中ALV的监测的同时,应提高我国自繁自养的地方品系鸡群ALV的系统净化[7, 20]。尤其是进口鸡群ALV在与我国地方品种鸡进行杂交培育时,应重视ALV的检测,杜绝不同亚群ALV可能发生重组产生新的病毒[21]。
虽然目前尚无该亚群ALV感染鸡群早期致肿瘤的报道,但是其亚临床感染带来的影响不容忽视;同时,这些分离株与日本地方品种鸡群中具有引起脑胶质瘤特性的ALV病毒[14]相似性很高,所以也应该加强对其生物学特性的深入分析。
4 结论本研究继我国江苏省和华南地区报道K亚群ALV后,首次从山东地区肉鸡中鉴定到一株ALV-K并获得其全基因组序列,进一步丰富了我国ALV-K流行病学研究资料。
[1] |
赵振华.
禽白血病[M]. 北京: 中国农业出版社, 2006.
ZHAO Z H. Avian leukemia[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2006. (in Chinese) |
[2] | PAYNE L N, BROWN S R, BUMSTEAD N, et al. A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chickens[J]. J Gen Virol, 1991, 72(4): 801–807. DOI: 10.1099/0022-1317-72-4-801 |
[3] | PAYNE L N. Developments in Avian leukosis research[J]. Leukemia, 1992, 6(Suppl 3): 150S–152S. |
[4] | PAYNE L N, NAIR V. The long view:40 years of avian leukosis research[J]. Avian Pathol, 2012, 41(1): 11–19. DOI: 10.1080/03079457.2011.646237 |
[5] |
王鑫, 赵鹏, 崔治中. 我国地方品种鸡分离到的一个禽白血病病毒新亚群的鉴定[J]. 病毒学报, 2012, 28(6): 609–614.
WANG X, ZHAO P, CUI Z Z. Identification of a new subgroup of avian leukosis virus isolated from Chinese indigenous chicken breeds[J]. Chinese Journal of Virology, 2012, 28(6): 609–614. (in Chinese) |
[6] | CUI N, SU S, CHEN Z M, et al. Genomic sequence analysis and biological characteristics of a rescued clone of avian leukosis virus strain JS11C1, isolated from indigenous chickens[J]. J Gen Virol, 2014, 95(11): 2512–2522. |
[7] | PAN W, GAO Y L, SUN F F, et al. Novel sequences of subgroup J avian leukosis viruses associated with hemangioma in Chinese layer hens[J]. Virol J, 2011, 8: 552. DOI: 10.1186/1743-422X-8-552 |
[8] |
吴晓平, 钱琨, 秦爱建, 等. 商品蛋鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定及序列分析[J]. 中国预防兽医学报, 2010, 32(5): 351–355.
WU X P, QIAN K, QIN A J, et al. Isolation and sequences analysis of subgroup J avian leukosis viruses in commercial layer chickens[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2010, 32(5): 351–355. (in Chinese) |
[9] |
李昕键, 严一铭, 李广伟, 等. 黄羽肉鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定与全基因组序列分析[J]. 动物医学进展, 2016, 37(2): 27–31.
LI X J, YAN Y M, LI G W, et al. Isolation, identification and full-genome sequence analysis of subgroup J Avian leukosis virus from yellow broilers[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2016, 37(2): 27–31. (in Chinese) |
[10] |
成子强, 张利, 刘思当, 等. 中国麻鸡中发现禽J亚群白血病[J]. 微生物学报, 2005, 45(4): 584–587.
CHENG Z Q, ZHANG L, LIU S D, et al. Emerging of Avian leukosis virus subgroup J in a flock of Chinese local breed[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2005, 45(4): 584–587. (in Chinese) |
[11] | GAO Y L, YUN B L, QIN L T, et al. Molecular epidemiology of avian leukosis virus subgroup J in layer flocks in China[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(3): 953–960. DOI: 10.1128/JCM.06179-11 |
[12] | DONG X, ZHAO P, XU B, et al. Avian leukosis virus in indigenous chicken breeds, China[J]. Emerg Microbes Infect, 2015, 4(12): e76. DOI: 10.1038/emi.2015.76 |
[13] | LI X J, LIN W C, CHANG S, et al. Isolation, identification and evolution analysis of a novel subgroup of avian leukosis virus isolated from a local Chinese yellow broiler in South China[J]. Arch Virol, 2016, 161(10): 2717–2725. DOI: 10.1007/s00705-016-2965-x |
[14] | HATAI H, OCHIAI K, TOMIOKA Y, et al. Nested polymerase chain reaction for detection of the avian leukosis virus causing so-called fowl glioma[J]. Avian Pathol, 2005, 34(6): 473–479. DOI: 10.1080/03079450500368086 |
[15] | HATAI H, OCHIAI K, MURAKAMI M, et al. Prevalence of fowl glioma-inducing virus in chickens of zoological gardens in Japan and nucleotide variation in the env gene[J]. J Vet Med Sci, 2008, 70(5): 469–474. DOI: 10.1292/jvms.70.469 |
[16] | CHANG S W, HSU M F, WANG C H. Gene detection, virus isolation, and sequence analysis of avian leukosis viruses in Taiwan country chickens[J]. Avian Dis, 2013, 57(2): 172–177. DOI: 10.1637/10387-092612-Reg.1 |
[17] | IWATA N, OCHIAI K, HAYASHI K, et al. Avian retrovirus infection causes naturally occurring glioma:Isolation and transmission of a virus from so-called fowl glioma[J]. Avian Pathol, 2002, 31(2): 193–199. DOI: 10.1080/03079450120118702 |
[18] | OCHI A, OCHIAI K, KOBARA A, et al. Epidemiological study of fowl glioma-inducing virus in chickens in Asia and Germany[J]. Avian Pathol, 2012, 41(3): 299–309. DOI: 10.1080/03079457.2012.684373 |
[19] | FADLY A M, PAYNE L N. Leukosis/sarcoma group[M]//SAIF Y M, BARNES H J, GLISSON J R, et al. Diseases of poultry[M]. Ames:Iowa State Press, Blackwell Publishing Company, 2003:465-516. |
[20] |
钱琨, 沈海玉, 金文杰, 等. 苏皖地区规模化鸡场禽白血病净化的初步研究[J]. 中国家禽, 2012, 34(5): 8–11.
QIAN K, SHEN H Y, JIN W J, et al. Preliminary eradication effect of avian leukosis for large scale chicken farms in Jiangsu and Anhui province[J]. China Poultry, 2012, 34(5): 8–11. (in Chinese) |
[21] | CAI L M, SHEN Y W, WANG G H, et al. Identification of two novel multiple recombinant avian leukosis viruses in two different lines of layer chicken[J]. J Gen Virol, 2013, 94(10): 2278–2286. |