2. 中国农业大学动物医学院, 北京 100193
2. College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China
伪狂犬病(pseudorabies, PR)是由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus, PRV)引起的家畜和多种野生动物共患的传染病。临床上以发热、奇痒和脑脊髓炎为主要特征。猪感染后无奇痒症状,感染猪的临床症状因日龄而异。伪狂犬病病毒基因组为线状双股DNA,长约150 kb。伪狂犬病呈全球分布[1]。
微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)是近年发展起来的新一代的PCR技术[2-3]。其原理是在反应前将反应体系进行微滴化处理形成几万至几十万个油包水的液化微滴,核酸分子分布于每个微滴中,经过PCR扩增后,经过微滴检测器检测,根据泊松分布原理和阳性微滴数即可计算出核酸初始拷贝数。与实时荧光定量PCR相比,该方法灵敏度高,特异性好,并实现了真正意义的绝对定量。
微滴数字PCR已应用于拷贝数变异研究[4-5]、转基因成分检测[6-7]、核酸的绝对定量[8-12]和病原微生物的检测[13-19]等领域。我国学者建立了检测阴沟肠杆菌[20]、大肠杆菌O157:H7[21]和鲤疱疹病毒2型[22]的ddPCR定量检测方法。
本研究在之前建立的荧光定量PCR方法[23]的基础上,建立和优化了可用于定量检测伪狂犬病病毒的ddPCR方法。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病毒猪细小病毒(PPV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒C株(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病病毒Bartha株(PRV)由本实验室保存。
1.1.2 仪器TISSUELYSER Ⅱ组织研磨仪由QIAgen生产、SCIENTIFIC KINGFISHER自动化核酸提取仪由THERMO生产、ABI 7500 fast荧光PCR仪由Life公司生产、QX200微滴式数字PCR仪由伯乐公司生产、普通PCR仪。
1.1.3 试剂5×MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit购自LIFE公司、GoTaq® Probe qPCR Master Mix购自Promega公司,T3克隆载体购自全式金公司,引物探针由英潍捷基有限公司合成。ddPCRTM Supermix for Probes、Droplet Generation oil for Probes购自伯乐公司。
1.1.4 样品样品为本实验室保存, 于2016—2017年度从全国19个猪场采集获得,所有样品均来自有神经症状的疑似伪狂犬病发病仔猪的脑和肺组织,总计134份。
1.2 试验方法 1.2.1 引物和探针的设计采用文献[23]合成引物和探针序列,扩增PRV gB基因保守区。上、下游引物分别为5′-ACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC-3′、5′-GTCYGTGAAGCGGTTCGTG AT-3′,扩增片段的长度94 bp;探针序列为5′-FAM-ACGTCATCGTCACGACC-BHQ-3′。
1.2.2 病毒核酸的提取采用5×MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit试剂盒按说明书提取核酸,将核酸进行10倍倍比稀释,提取好的核酸置于-80 ℃备用。
1.2.3 PRV标准品制备以PRV病毒核酸为模板,使用“1.2.1”引物进行扩增,扩增片段长94 bp。将扩增产物连接至pEASY-T3载体,然后转化至Trans T1感受态细胞。筛选出含有阳性重组质粒的细菌,送测序鉴定。序列正确含有PRV全长基因的质粒即为标准品。应用分光光度计测定质粒浓度,计算其拷贝数,进行10倍梯度稀释备用。
1.2.4 PRV qPCR方法建立采用设计好的引物和探针建立实时qPCR方法,qPCR反应体系: GoTaq Probe qPCR Master Mix (2×) 10 μL; 上下游引物(10 μmol·L-1)各0.9 μL; 探针(10 μmol·L-1) 0. 5 μL; 模板2 μL; ddH2O 5.7 μL。扩增条件为:95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 共40个循环。将构建的标准品进行10倍梯度稀释,检测后用于绘制qPCR标准曲线。
1.2.5 反应条件的优化ddPCR反应包括四个步骤:反应体系配制、微滴生成、PCR扩增、微滴读取。以伪狂犬病病毒核酸为模板。ddPCR设置引物浓度0.5~0.9 μmol·L-1、探针浓度0.1~0.3 μmol·L-1、退火温度55~65 ℃。加入2×ddPCR supermix for Probes 10 μL,模板2 μL,用水补足20 μL,进行普通PCR扩增,扩增条件:95 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,55~65 ℃ 1 min,40个循环;98 ℃ 10 min;4 ℃ 60 min,升降温速率2 ℃·s-1。通过比较ddPCR的微滴生成数,微滴分布状态、微滴荧光信号的强度等来确定优化的结果。
1.2.6 标准曲线的绘制将10倍倍比稀释的已制备好的含有PRV gB基因的质粒和病毒核酸分别进行qPCR和ddPCR检测,比较两种方法线性范围和检测限。
1.2.7 与其他病毒的交叉反应试验提取本实验室保存的PPV、TGEV、CSFV、PCV2核酸,稀释到103 copies·μL-1,然后用优化好的方法进行ddPCR的检测,验证是否与其他病毒有交叉反应。
1.2.8 重复性试验以浓度约为1×103 copies·μL-1的伪狂犬病病毒核酸为模板,用已经优化好的ddPCR方法,进行重复性试验。在20 μL的反应体系中加入2 μL稀释好的模板,重复3次ddPCR试验。
1.2.9 临床样品检测用已经建立的ddPCR和qPCR的方法,分别对临床采集的疑似为伪狂犬病发病猪场的脑和肺样品进行检测。将临床的脑和肺样品剪约0.5 g,用组织研磨仪进行研磨。然后提取核酸。组织研磨液使用BHK-21细胞进行病毒分离。用qPCR对所有样品进行检测,将Ct值在22以下的样品进行稀释,然后用ddPCR进行检测。
2 结果 2.1 qPCR方法建立将1.00×1010 copies·μL-1的PRV质粒进行10倍倍比稀释,1.00×109~1.00×101 copies·μL-1为模板作荧光定量PCR,得到荧光定量PCR扩增曲线,见图 1。
确定最佳ddPCR引物探针浓度和扩增条件:引物的浓度为0.90 μmol·L-1,探针浓度为0.25 μmol·L-1。ddPCR扩增条件:95 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 1 min,40个循环;98 ℃ 10 min;4 ℃ 60 min,升降温速率2 ℃·s-1。
2.3 数字PCR扩增ddPCR扩增的微滴生成数目在12 000以上,表明微滴反应正常,可以对其进行后续的定量分析。经过优化的ddPCR反应体系对PRV的扩增结果良好,微滴散点图中阴阳性微滴分界明显,且中间弥散的微滴数量很少,见图 2A微滴散点图。微滴频率分布图阴阳性微滴峰显著分开,中间无杂峰,见图 2B微滴频率分布图。当样品DNA模板拷贝数高于约20 000时,阳性微滴数与生成总微滴数接近,不满足泊松分布,无法实现ddPCR的准确定量。DNA初始模板量为8 250 copies·μL-1,随着DNA模板浓度降低,阳性微滴数量相应减少,见图 3。由图可知,经过优化的反应条件适合进行PRV ddPCR的定量分析。
ddPCR和qPCR的标准曲线分别见图 4和图 5,ddPCR的R2值为0.998,斜率为-0.935 1,最低检测限为6.1 copies·μL-1。qPCR的R2值为0.997,斜率为-3.349,扩增效率98.90%,最低检测限为28.6 copies·μL-1。结果表明,ddPCR和qPCR的线性关系均较好。ddPCR最低检测限低于qPCR。
采用PPV、TGEV、CSFV、PCV2进行ddPCR方法特异性验证。结果表明,除了PRV特异性扩增,其他检测均为阴性。说明该方法与所验证病毒无交叉反应。
2.6 重复性分析3次重复试验得到ddPCR的结果分别为920、930、970 copies·μL-1,变异系数为2.81%。说明该方法重复性好、准确度高,检测结果稳定、可靠。
2.7 临床样品的检测利用本试验建立的ddPCR、qPCR方法和病毒分离的方法分别对134份从临床收集的组织样品进行检测。结果显示,134份样品中,qPCR检出的PRV阳性样品为28份(Ct值小于30),可疑为4份(Ct值30~37),阴性102份;ddPCR方法检出的PRV阳性样品为32份,阴性为102份。用病毒分离方法从28份样品中分离出PRV。详细结果见表 1。结果表明,与病毒分离方法比较,ddPCR的敏感性为87.5%,特异性为96.2%,符合率为97%。对于病毒含量较高的样品ddPCR和qPCR两种方法检测结果一致;对于低拷贝的样品,qPCR只能给出可疑的结果无法进行确认,使用ddPCR可以精确地检测出样品中病毒核酸的拷贝数,结果更加可靠和精确。对于低拷贝病毒样品可能由于病毒含量较低或病毒活性差等原因,无法分离到病毒。
郑敏等[24]建立的猪伪狂犬病病毒Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达22.3 copies·μL-1,朱淑芬等[25]建立的检测伪狂犬病病毒gB基因荧光定量PCR方法最低检测极限可达150 copies·μL-1,而本研究建立的ddPCR检测方法最低检测限为6.1 copies·μL-1。本研究使用qPCR检测的方法最低检测限为28.6 copies·μL-1,高于ddPCR的6.1 copies·μL-1。ddPCR灵敏度高于qPCR。与qPCR相比,ddPCR可以检测到单个拷贝样品;不需依赖标准曲线对样品初始拷贝数进行定量;对反应条件的要求比qPCR低;PCR反应中抑制剂对ddPCR影响较qPCR小。
但是ddPCR也存在一些不足,例如仪器设备昂贵,每一份的检测成本较qPCR高;微滴读取速度慢导致检测时间是qPCR的2~3倍;荧光通道少(目前只有FAM和VIC两通道);样品需稀释到一定浓度方可检测;目前尚无成熟的ddPCR商品化试剂盒可供使用等。但是,随着未来数字微滴PCR仪器成本的下降,技术更加成熟,该技术具有广阔的应用前景。
总之,本研究建立的PRV ddPCR方法敏感性、特异性高,重复性好,灵敏度高,可进行PRV低含量样品检测和定量检测。为PRV的监测、流行病学调查、净化等提供了一个切实可行的解决方案。
4 结论以伪狂犬病病毒gB基因为靶基因,建立伪狂犬病病毒(PRV)微滴数字PCR(ddPCR)的定量检测方法,ddPCR的最佳引物浓度为0.9 μmol·L-1,探针浓度为0.25 μmol·L-1,退火温度为60 ℃,检测限为6.1 copies·μL-1,与其他常见猪病毒无交叉反应。经临床检测,新建立的ddPCR方法,敏感性高、特异性强,可用于伪狂犬病病毒的定量检测。
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