2. 河南农业大学现代实验技术与管理中心, 郑州 450002
2. Advanced Experimental Techniques and Managing Centre, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
褪黑素(Melatonin,MT)是哺乳动物脑部的松果体细胞在黑暗环境中分泌的一类吲哚类激素[1-2],具有改善睡眠、抗氧化、抗衰老、改善动物神经疾病、提高免疫力等功能,在营养代谢方面,MT还具有降低基础代谢率、提高食物消化率、调节营养代谢和分配等多方面的作用[3]。对于毛皮动物,MT还具有促进绒毛生长,增加饲料中氮向绒毛方向分配,调节动物体内脂肪的分配等作用[4-5]。MT的分泌主要与光照有关,自然条件下,随着光照的昼夜和季节性变化,MT的分泌表现为昼低夜高和春夏低、秋冬高的变化规律[6-8]。许多野生动物,如熊、獾、羊、貂、狐、田鼠、牦牛等在秋季会出现的秋肥和长绒现象,均与动物体内MT的分泌增加有关[9-10]。因此,研究MT对动物脂肪代谢与分配的影响,对动物生产有重要的意义。王林枫等[11]以绒山羊为动物模型研究表明,皮下埋植MT可以增加绒山羊体脂肪的比例,改变绒山羊的体成分组成,但其研究没有涉及内脏器官脂肪的含量与分配。另有研究表明,高剂量褪黑素处理后大鼠体重和附睾周围脂肪明显降低[12]。王林枫等[13]发现,MT对动物体内组织和器官的脂肪沉积有明显的影响。研究证明,脂质主要储存在脂滴中,大多数以甘油三酯(TG)形式存在。MT通过降低机体胆固醇的合成来减少血脂的含量,通过受体介导机制降低细胞内TG的合成和沉积[14-15]。最近的研究表明,MT对各种哺乳动物和体外成熟期间细胞的脂质代谢具有明显的调节作用[16-17]。肝是动物脂肪代谢的中心,MT所引起的动物体内脂肪的变化对肝脂肪代谢有何影响则很少报道,更缺乏深层次的机理研究。
本试验以雄性大鼠为动物模型,运用基因芯片、ELISA、实时荧光定量PCR等现代分子生物学技术研究MT对肝脂肪代谢相关酶的影响。探索MT对肝脂肪代谢的影响,为人类科学地利用MT,改善动物和人类的健康提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与饲养管理选取6周龄、平均体重100 g左右的SD雄性大鼠20只,随机分为2组,每组10只,分别为正常饲粮组(ND)、褪黑素处理组(ND+MT)。试验大鼠经过10 d适应性饲喂后进入正试期,正试期内各组自由采食,自由饮水,MT处理组除饲喂正常饮水外,每天定时(16:00) 灌服10 mg·kg-1 BW的MT溶液[18],同时ND组则按照10 mg·kg-1 BW的剂量灌服2%的酒精蒸馏水溶液。鼠房环境温度为24~26 ℃[19],12 h光照,12 h黑暗,试验期限为60 d。
褪黑素(Solarbio公司)溶液的配制方法:称取一定量的褪黑素溶解于适量的酒精中,然后用蒸馏水定容至所需要的浓度。
1.2 样品采集与处理饲养试验结束后,用颈部脱臼法处死大鼠剪断颈静脉,分别用肝素锂抗凝采血管和促凝采血管收集血液。抗凝管立即离心(2 500 r·min-1,15 min,湘仪离心机厂,TDZS-WS),分离血浆,移入EP管中,-40 ℃保存,待测。促凝管静置30 min后离心(1 500 r·min-1,离心15 min,仪器同上),分离血清,同上保存。
采血完毕后,迅速解剖大鼠,摘取肝并分离大网膜、肾周脂肪、附睾脂肪等部位的脂肪组织,称重。肝组织分为2部分:一部分放入-20 ℃冰箱保存,备用;另一部分放入液氮内保存,待测。
1.3 检测指标与计算方法 1.3.1 不同器官(组织)及脂肪的含量计算。肝指数(%)=肝重/体重×100%;
大网膜指数(%)=大网膜重/体重×100%;
肾周脂肪指数(%)=肾周脂肪重/体重×100%;
附睾脂肪指数(%)=附睾脂肪重/体重×100%。
1.3.2 血液生化指标及激素检测用全自动生化分析仪(Olympus AU640) 检测血浆,分析脂质代谢指标:甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL);用酶联免疫法(上海蓝基生物科技有限公司试剂盒)检测血清中相关指标:极低密度脂蛋白(VLDL)、游离脂肪酸(NEFA),血清检测生长激素(GH)、瘦素(Leptin)、胰岛素(INS)、三碘甲腺原氨酸(T3) 等激素指标。
1.3.3 基因芯片检测用基因芯片技术检测肝组织中的差异性基因,芯片检测试验由联川生物技术有限公司完成。QIAGEN RNeasy® Kit纯化总RNA,由总RNA反转录合成cDNA,aa UTP标记cRNA合成,取4 μg cRNA样品,使用荧光染料(Cy3) 进行荧光标记,标记后的片段化cRNA 65 ℃滚动杂交17 h。杂交反应完成后,软件扫描显示信噪比高,所有芯片信号背景清晰,同时为减少芯片系统的误差,每组样本做4个重复,以确保分析的准确性。基因芯片表达谱采用Gene Pix pro 6.1软件处理原始图像和原始数据,用Agilent-analyze-V1.0进行Quantile标准化和后续分析。
1.3.4 脂代谢相关酶(因子)的检测在GenBank数据库查询脂代谢相关的关键酶和相关转录因子的基因序列。根据基因序列信息用Primer5软件设计RT-PCR引物序列(上海生工合成引物),引物序列见表 1。
迅速从液氮中取出肝组织,剪下0.5 g左右,用RNAisoPlus抽提总RNA,经紫外分光光度计测定光密度,计算OD260 nm/OD280 nm(代表RNA的浓度)和OD260 nm/OD230 nm(代表RNA的纯度)。用反转录试剂盒(大连TaKaRa公司,PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)反转录为cDNA,使用荧光定量PCR仪(德国Eppendorf公司Mastercycler nexus)进行RT-PCR,检测RNA表达丰度,SYBRGreen法荧光定量PCR反应,参数设置:95 ℃预变性2 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40个循环。
1.3.5 数据分析采集的原始数据用Graphpad prism 5.0统计软件进行分析,组间差异采用单因素方差分析(One way ANOVA),当有显著差异(P < 0.05) 时,再采用Turkey氏法进行多重比较,认为P < 0.05表示差异有统计学意义。结果用“平均值±标准差(mean±SD) ”表示。
2 结果 2.1 MT对大鼠脂代谢相关生化指标和激素的影响大鼠血液相关生化指标和激素的检测结果见表 2。与ND组相比,ND+MT组LDL的含量显著降低(P < 0.05),HDL、TC含量降低,VLDL、NEFA含量升高。激素水平,ND+MT的Leptin、INS、T3含量升高,GH含量降低,但均未达到显著水平。
不同组织器官脂肪含量见表 3。与ND相比,ND+MT组肝重、肝指数、肝长链脂肪酸含量、大网膜重、大网膜指数、附睾脂肪重显著下降(P < 0.05),肾周脂肪重、肾周脂肪指数、附睾脂肪指数均降低。
芯片试验扫描图像结果如图 1所示,基因芯片表达谱进行Quantile标准化后,对标准化的数据进行过滤,利用差异倍数变化值和P值进行差异基因筛选,筛选出上调或者下调倍数变化值≥1.5且P值≤0.05的基因,火山图可在一张图中非常直观且合理的筛选出在两样本间发生差异表达的基因。从图 1可以看出,MT处理后,2组样品基因表达出现较大的差异,其中289个上调差异基因,293个下调差异基因。
为进一步筛选出2组样本中的差异表达基因,选取P < 0.05且差异倍数最大的top200的基因做聚类分析。如图 2所示,本研究筛选出16个显著差异表达基因。每列代表一个样本,每行代表一个基因,颜色代表基因的相对表达量。
生物体内不同基因相互协调发挥生物学功能,为揭示所获取的差异表达基因的生物学功能,本研究对所获取的差异表达基因进行KEGG富集分析。KEGG是有关通路的主要公共数据库,通过通路显著性富集确定差异基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径。KEGG富集分析结果如表 4所示,差异基因主要归属于在ko00010、ko00071、ko00250、ko00240、ko00010、ko00040、ko00051这7个通路,这些通路与脂类代谢和脂肪细胞分化密切相关。由表 4可知,与脂肪分解相关的酶ALDH3a2在ko00010通路中显著升高,与脂肪合成相关的酶ACSL3、ACSL5在ko00071通路中显著下降。
为验证上述基因芯片中的检测结果,从上述差异性基因中选取2个与脂代谢密切相关的关键基因通过实时荧光定量PCR进行验证,这2个基因分别为长链乙酰辅酶A合成酶3(ACSL3)、乙醛脱氢酶(ALDH3a2)。ACSL3是脂肪合成的重要酶,ALDH3a2是促进脂肪分解的重要酶。RT-PCR结果如图 3所示,在mRNA水平上,ND+MT的ACSL3mRNA显著降低(P < 0.05),ALDH3a2升高,说明MT促进脂肪分解酶的转录,抑制脂肪合成酶的转录,其检测结果与基因芯片检测结果一致,说明本试验中芯片检测结果可靠。
为进一步证实脂肪代谢的变化,从脂代谢通路中另选2个有代表性的关键酶:脂肪酸合成酶(FAS)、肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1),通过实时荧光定量检测其mRNA丰度的变化。结果见图 4,从结果可以看出,ND+MT的FAS mRNA显著下降(P < 0.05),CPT1 mRNA显著升高(P < 0.05)。FAS是脂肪合成的重要酶,CPT1是脂肪β氧化的关键限速酶。本试验结果可以进一步说明,MT可抑制肝脂肪的合成,促进脂肪的分解。
大量研究表明,MT对脂肪的分配和代谢有显著的影响,可减少脂肪沉积[20-21]。X.Chen等[17]研究表明,每周5 d连续12周,通过饮水方式给大鼠饮用50 μg·mL-1的MT,可显著降低大鼠内脏间的脂肪含量,Y.Liu等[22]研究表明,高剂量褪黑素处理后大鼠体重和附睾周围脂肪含量明显降低。本试验中,ND+MT组肝、大网膜、附睾、肝指数、大网膜指数等处脂肪含量均显著下降(P < 0.05),说明MT可减少大鼠腹腔内主要组织(器官)脂肪的沉积。在脂肪酸的含量上,MT处理组大鼠肝中肝长链脂肪酸的含量显著减少,说明肝脂肪酸的合成受到了抑制,从而减少了脂肪的沉积和肝的重量。
3.2 MT对大鼠脂肪代谢的影响MT对脂肪代谢的影响还表现在血脂的变化。研究表明,MT通过降低肝总胆固醇来改善高脂肪饮食大鼠的甘油三酯[23]。郭英振等[24]用MT处理辽宁绒山羊可以降低TG、TC的含量。血液中TG、TC、VLDL、LDL水平是反映机体脂肪代谢水平的重要指标。VLDL的主要功能是运输肝中合成的内源性TG,TG与胆固醇等结合形成VLDL并释放入血,ND+MT组VLDL水平升高表明肝向外运输TG的量增加,同时血液中的TG水平降低,VLDL与TG含量成负相关,这与本试验MT处理后,血液检测TG含量下降,VLDL含量升高结果一致。LDL来自VLDL的分解,VLDL将肝内合成的胆固醇转运至肝外组织参加代谢。本试验中,ND+MT组LDL和TC水平降低,表明肝内胆固醇的沉积减少。VLDL释放入血液分解产生的TG被分解生成NEFA,导致血液中NEFA显著升高。
MT对脂肪代谢的影响与激素的变化有关,MT处理后生长激素(GH)血浆水平显着增加,GH可以促进动物和人的发育以及细胞的增殖,低剂量的GH作用于动物肝组织可以引起机体的脂肪分解,减少体内脂肪含量[25-26]。在褪黑激素治疗的鸽子中,三碘甲状腺原氨酸(T3) 含量升高[27]。T3与GH具有协同作用,GH作用的发挥需要有适量T3的存在,T3对甘油三酯和胆固醇的分解作用大于合成作用,T3与GH共同促进脂肪分解的作用,较高水平的GH也可以促进脂肪分解[28]。INS主要作用于肝、肌肉及脂肪组织,可以促进脂肪的合成和贮存,抑制脂肪分解[29]。Leptin是由白色脂肪细胞分泌的蛋白质类激素,可作用于下丘脑体重调节中枢,主要生理功能是调节动物食欲,降低采食量,并可通过提高能量消耗抑制脂肪沉积和体重的增加[30-31]。本研究中,灌服MT后leptin的含量升高不显著,说明MT大鼠的白色脂肪细胞数量没有发生显著的变化,MT对leptin的作用不大,脂肪的减少可能是通过其他因素作用。本试验中,ND+MT组大鼠的GH降低,T3水平升高,促进脂肪的分解;尽管ND+MT组的INS稍有升高,在一定程度上促进脂肪合成,但是在T3、leptin均升高情况下,其作用被抵消,分解作用强于合成作用,综合作用结果是MT降低了大鼠腹腔和肝脂肪的含量。MT本身是否对脂肪的代谢有影响,通过何种途径发挥作用还有待进一步研究。
3.3 MT对大鼠肝脂肪代谢相关酶的影响肝是脂肪代谢的中心,可在一定程度上反映机体脂肪的代谢状况。为进一步探究MT对脂肪酸代谢的影响,本试验在分子水平上研究其对脂肪代谢酶的作用。脂肪代谢分2个过程:脂肪合成和脂肪分解,因此,分别选取与脂肪合成和脂肪分解密切相关的酶进行研究。结果表明,MT处理后,与脂肪合成相关的酶ACSL3、FAS mRNA表达量降低,与脂肪分解有关的酶及转录因子CPT1、ALDH3a2表达量升高,该结果进一步证实了MT对脂肪代谢的影响与其对不同代谢酶的作用不同有关。许多研究证明,MT对脂肪代谢和沉积的影响与MT对脂肪代谢酶的影响有关,褪黑激素处理哺乳动物细胞显著减少LD的数量,降低与脂肪生成相关基因的表达(FAS、PPARγ和SREBP1),上调与脂肪酸β-氧化相关基因CPT 1的表达进而抑制脂肪生成,促进脂肪氧化,减少体内脂肪沉积[32]。
相关文献报道,ACSL3促进脂肪合成,褪黑素可降低FAS和ACSL3活性,提高肉毒碱脂酰转移酶和酰基辅酶A氧化酶活性,降低血液和肝中脂肪含量,抑制脂肪沉积[33]。ALDH3a2可以清除掉机体内脂质氧化过程当中所产生的醛类物质,褪黑素减弱脂质过氧化产物清除机体内丙二醛的作用[34-35]。对2组大鼠肝样品进行mRNA丰度检测。由图 3可知,在mRNA水平上,ACSL3的表达在ND+MT组显著降低,提示褪黑素可以抑制肝脂肪酸合成途径,减少肝脂肪含量;而与脂肪分解相关的酶ALDH3a2的表达在试验组明显的上升,促进脂质氧化过程中丙二醛的消除,加速脂质氧化。RT-PCR检测结果与基因芯片检测结果一致。
研究表明,CPT 1是肝中脂肪酸β氧化的限速酶,CPT 1的表达量增加,血液中的游离脂肪酸含量升高改善脂肪代谢[36]。FAS是调控脂肪合成的关键酶,参与长链脂肪酸合成,最后生成棕搁酸。动物机体脂肪合成的脂肪酸大部分都来源于脂肪酸的从头合成,脂肪合成的原料是乙酰CoA,FAS促进乙酰CoA和丙二酸单酰CoA在脂肪酸合成酶的催化下合成脂肪酸,从而在脂肪代谢中发挥关键作用。因此通过调控FAS的活性和基因表达就可以调控脂肪酸的合成速度,影响脂肪的沉积。FAS活性降低势必影响组织中脂肪酸的合成,导致脂肪沉积减少[37]。FAS的活性与腹腔脂肪质量呈很强的正相关性;抑制FAS活性可以降低体脂含量[38]。正常小鼠注射FAS抑制剂,可导致小鼠食欲下降,减少体重和脂肪组织质量[39]。抑制FAS的活性是减少脂肪合成的有效方法[40]。本研究中,ND+MT与ND组相比FAS显著降低,FAS活性受到抑制,这是造成肝脂肪减少的主要原因之一。
综上所述,MT对雄性大鼠脂肪代谢的整体调节如图 5所示,在组织/器官水平MT调节动物内脏脂肪的含量,在血液中影响脂代谢指标的含量及相关激素的含量,在分子水平调节脂代谢合成及分解相关基因,MT对雄性大鼠的脂代谢调节从外周循环到分子水平均有显著影响。MT对脂肪组织本身是否产生影响及其调节脂肪代谢的机制等还不清楚,还有待一进步研究。
MT可以显著影响大鼠腹腔组织、器官和肝内脂肪的沉积。
4.2MT显著影响大鼠体内的脂肪代谢,显著降低TG、LDL的含量,改变血脂含量。
4.3MT通过影响肝内脂代谢相关基因的表达调节脂肪的代谢,其调节与不同类型的脂肪代谢酶(因子)对MT的不同反应有关。
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