卵泡颗粒细胞的生长和凋亡，对卵泡的发育起着重要作用。卵泡发育是受颗粒细胞分泌的各种因子调节的复杂生物过程，尤其是类固醇激素如雌激素(E2) 和孕酮(P)[1-2]。类固醇激素的合成受一系列酶的控制，其中CYP19、CYP11和3β-HSD是其合成通路的关键酶[3-4]。抑制素是卵巢颗粒细胞中类固醇激素合成的重要调节因子[5-6]，它可以通过调节类固醇激素合成相关基因(CYP11、3β-HSD和CYP19) 的表达或活性调控类固醇激素的合成，参与调控卵泡的生长发育与排卵，进而调节动物的繁殖性能[7-8]。
抑制素主要是卵泡颗粒细胞分泌的，它是由α、β两个不同的亚基组成，其中β亚基有A、B两种形式，α和βA亚基构成抑制素A(InhibinA)，α和βB形成抑制素B(InhibinB)。抑制素的结合位点和受体位于垂体、卵泡膜细胞和卵泡颗粒细胞中[9-11]，它可以通过内分泌和局部作用的方式调节卵泡发育[12-16]。许多研究表明，抑制素通过内分泌作用调节E2的分泌，从而调控垂体FSH的分泌[17-21]。另外，抑制素可通过局部调节作用增强LH刺激膜细胞雄激素的合成效应，促进雄激素的合成[22-23]。但是，颗粒细胞来源的抑制素对E2和P局部调节的影响结果还存在争议。研究发现，添加抑制素抗体促进牛和猪颗粒细胞分泌E2[24-26]。但是B.K.Campbell等[27]研究表明，抑制素的添加促进绵羊颗粒细胞产生E2，C.D.Smyth等[22]在大鼠卵泡中发现，免疫中和内源性的抑制素导致E2分泌的降低和P的增加，当抗体处理的卵泡中补充外源性抑制素时，E2分泌得到恢复，并且P减少。抑制素通过改变CYP11和CYP19的表达影响E2和P的分泌[25, 28]。另外，抑制素对灵长类动物颗粒细胞基础水平和促性腺激素诱导的E2的分泌没有影响[29]。抑制素对E2和P有重要的调节作用，但针对绵羊颗粒细胞的研究结果还比较少，且颗粒细胞来源的抑制素对E2和P局部作用的调控结果还不清楚。
本实验室已构建了靶向抑制素α亚基(Inhibin α-subunit, INHα)基因的siRNA，干扰效率达85%以上，并通过RNA干扰INHα的表达后对绵羊颗粒细胞的增殖和凋亡进行了大量研究，但关于RNA干扰INHα的表达及添加InhibinA后，对绵羊颗粒细胞E2和P的分泌及相关基因的变化还需要进一步研究。本研究以原代绵羊颗粒细胞为模型，通过siRNA干扰内源性INHα基因的表达和添加外源InhibinA两种处理，研究抑制素对绵羊颗粒细胞E2和P的分泌及相关基因(CYP11、3β-HSD和CYP19) 表达的影响，为研究卵泡抑制素对绵羊卵泡发育的局部调节作用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料从唐县屠宰场采集1.0~1.5岁小尾寒羊的卵巢，立即放入含双抗的37 ℃生理盐水的保温瓶中，并在3 h内运回实验室。
1.2 方法 1.2.1 绵羊卵巢颗粒细胞的分离与培养根据J.Y.Peng等[30]的颗粒细胞分离方法，从绵羊卵泡分离并收集颗粒细胞，加入含10% FBS(Gibco)和1%青链霉素混合液的DMEM/F12(Gibco)培养液重悬细胞。调整细胞密度，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后, 更换为含有1%的青链霉素混合液(Gibco)、0.2% BSA(Sigma)、1%的ITS(胰岛素-转铁因子-硒补充剂，Gibco)和0.1 μmol·L-1雄烯二酮(美伦)的DMEM/F-12培养液培养12 h后，添加InhibinA(200 ng·mL-1，ProSpec)对细胞进行刺激，并以未处理的细胞为空白对照(Control)，每组设3个重复孔。
1.2.2 siRNA的设计合成和转染在GenBank上搜索绵羊INHα基因mRNA序列(NM_001308579.1)，设计合成针对INHα基因的siRNA干扰序列(siINHα)和阴性对照(siNC)，采用转染试剂LipofectamineTM RNAiMAX(Invitrogen)，按说明书转染siINHα和siNC至绵羊颗粒细胞，每组设3个重复孔。处理48 h后, 提取总RNA进行检测。
1.2.3 雌激素和孕酮的测定RNA干扰组和InhibinA添加组分别处理细胞48 h后，收集培养液上清。采用P和E2 ELISA试剂盒(北京华英生物技术研究所)检测细胞培养液中E2(灵敏度 < 4 pg·mL-1，批内变异系数 < 15%，批间变异系数 < 15%)和P(灵敏度 < 0.1 ng·mL-1，批内变异系数 < 15%，批间变异系数 < 15%)的浓度，经显色后在酶标仪测定吸光值(OD值)，通过拟合浓度—吸光度曲线，计算出待测细胞培养液中E2和P的含量。
1.2.4 qRT-PCR检测雌激素和孕酮分泌相关基因mRNA的表达干扰组和InhibinA添加组处理细胞48 h后，Trizol(Invitrogen)提取细胞总RNA，利用反转录试剂盒(TaKaRa)，反转录为cDNA。使用荧光定量PCR仪(ABI Step One PlusTM)进行检测(SybrGreen qPCR mastermix试剂购自DBI)。以GAPDH基因为内参，采用2-△△CT的方法计算各检测基因的相对表达量。qRT-PCR检测目的基因INHα、E2和P分泌相关基因(CYP19、CYP11和3β-HSD)的相对表达量。引物序列见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequences |
采用SPSS 19.0的t检验对数据进行分析。试验数据以“平均值±标准差”表示。P＜0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 siRNA的干扰效率siRNA转染颗粒细胞48 h后，与阴性对照相比，颗粒细胞INHα mRNA的水平显著降低(P＜0.05)，抑制率为87%(表 2)。
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表 2 转染后绵羊颗粒细胞INHα基因mRNA的相对表达水平 Table 2 The mRNA expression of INHα in sheep granulosa cells after transfection |
干扰组siRNA转染颗粒细胞48 h后，测定培养液中E2和P分泌量的结果见表 3。在转染48 h时，siRNA干扰组颗粒细胞E2和P的分泌量均显著低于阴性对照组(P < 0.05)。
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表 3 干扰INHα对颗粒细胞中E2和P分泌的影响 Table 3 The effects of silencing INHα on the secretion of E2 (pg·mL-1) and P (ng·mL-1) in granulosa cells |
InhibinA处理颗粒细胞48 h后，E2和P的分泌量均显著高于空白对照组(P < 0.05)(表 4)。
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表 4 InhibinA对颗粒细胞中E2和P分泌的影响 Table 4 The effects of inhibinA on the secretion of E2 and P in granulosa cells |
干扰组E2和P分泌相关基因的相对表达量结果见图 1A。siRNA转染后，干扰组中与E2分泌相关的芳香化酶CYP19基因相对表达量受到抑制，与阴性对照组相比差异显著(P < 0.05)；与P分泌相关的3β-HSD基因相对表达量显著降低(P < 0.05)，而CYP11的表达量显著升高(P < 0.05)。InhibinA添加组E2和P分泌相关基因的相对表达量结果见图 1B。与空白对照组相比，CYP19、CYP11和3β-HSD基因相对表达量均显著升高(P < 0.05)。
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图 1 干扰INH α(A)和InhibinA(B)处理后绵羊颗粒细胞CYP19、CYP11和3β-HSD mRNA的表达 Figure 1 Effect of treatment with silencing INHα gene (A)and inhibinA (B) on the mRNA expressions of CYP19, CYP11 and 3β-HSD in sheep granulosa cells |
卵泡发育是受颗粒细胞分泌的各种因子调节的复杂生物过程，尤其受E2和P的调节。研究表明，抑制素可以调节E2和P的分泌[7, 31]。F.J.Chen等[32]研究发现，干扰鹅颗粒细胞INHα基因的表达后，E2的浓度降低。L.Y.Geng等[33]超表达INHα 48 h后发现，抑制素促进E2分泌，抑制P分泌；而96 h后，E2分泌受到抑制，P分泌量不变。可能是因为超表达的INHα片段能够作为抑制素的对抗物，模拟抑制素亚基对颗粒细胞的作用，对抗颗粒细胞自身分泌的抑制素对E2分泌的负反馈作用，促进颗粒细胞分泌E2。另外，抑制素抗体的添加，同样抑制FSH诱导的绵羊颗粒细胞和未成熟大鼠的整个卵泡中产生E2[22, 27]，说明抑制素对E2有促进作用。本研究得出，干扰绵羊颗粒细胞中INHα基因的表达，抑制了E2和P的分泌，添加InhibinA处理绵羊颗粒细胞，促进了E2和P的分泌。但有研究发现，转基因小鼠过表达INHα，使得小鼠的排卵率降低，E2分泌减少[34-35]。在猪和牛颗粒细胞中添加抑制素抗体，阻断了猪和牛颗粒细胞产生的抑制素对E2的抑制效果，促进E2的分泌，说明抑制素对颗粒细胞产生的E2具有负反馈效应[24-26]。还有研究表明，抑制素对灵长类动物和大鼠颗粒细胞基础水平和FSH诱导的E2的分泌没有影响[29, 36]。以上研究结果不一致的原因，可能是由于物种、处理方法、培养基中添加的成分以及培养的时间不同造成的，也可能与颗粒细胞的分化阶段不同有关。
3.2 抑制素对颗粒细胞雌激素和孕酮分泌相关基因表达的影响E2和P在动物的生殖、发育、生长等方面起着重要作用，它的合成主要受CYP19、CYP11和3β-HSD的控制。研究表明，芳香化酶CYP19是雄激素向E2转化的关键酶，P的产生与3β-HSD和CYP11的表达有关[3]。L.P. Cai等[25]研究表明，添加INHα抗体，通过上调CYP19促进猪颗粒细胞E2的分泌。C.L.Lu等[28]研究发现InhibinA本身对大鼠颗粒细胞的CYP19和CYP11 mRNA基础水平没有影响，但抑制了FSH诱导的类固醇生成相关基因CYP19和CYP11 mRNA的表达，从而降低了E2和P的合成，这种抑制作用发生在cAMP通路的上游。本研究表明，干扰绵羊颗粒细胞中INHα基因的表达，显著下调CYP19和3β-HSD mRNA的表达，抑制E2和P的分泌；InhibinA处理颗粒细胞，显著上调CYP19、CYP11和3β-HSD的表达，促进E2和P的分泌，与以上研究结果一致。但干扰颗粒细胞中INHα基因的表达，CYP11 mRNA的表达上调与P分泌的变化不一致。M.Sahmi等[37]研究表明，3β-HSD对P的分泌起决定性作用，而CYP11的表达与P的分泌无关。研究表明，添加INHα抗体，免疫中和内源性抑制素的生物学活性，促进猪颗粒细胞分泌E2，但CYP19的表达上调不显著，认为E2的合成和分泌可能还涉及CYP19以外的因子[24]。抑制素对E2和P的调控作用涉及多因子参与，其调控机制比较复杂，造成以上基因表达差异的原因还需进一步的研究。
4 结论RNA干扰INHα基因的表达后，抑制了绵羊颗粒细胞E2和P的分泌，显著下调CYP19和3β-HSD mRNA的表达，上调CYP11 mRNA的表达；InhibinA的添加，促进了绵羊颗粒细胞E2和P的分泌，显著上调CYP19、CYP11和3β-HSD mRNA的表达。抑制素通过改变类固醇生成相关基因的表达，进而调控绵羊颗粒细胞类固醇激素的分泌。
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