2. 华中农业大学动物医学院, 武汉 430070
2. College of Veterinary Medicine, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
支原体(Mycoplasma)是一种可以通过除菌滤器、无细胞壁、能自我复制的最小原核生物,其基因组介于0.58与2.2 Mb之间,G+C含量23%~35%,分类学上属于柔膜菌纲支原体科支原体属[1-3]。已有研究发现,支原体致病与细胞黏附[4]、产生毒性次级代谢产物[5]、竞争宿主细胞营养、诱导免疫抑制和免疫损伤[6]、膜表面的相变运动等有关[7],但整体说来其致病机制不清楚。
分泌蛋白(secretory protein)直接参与细菌与外界的交流,一般是毒素、黏附素和决定毒力的酶,与细胞黏附、侵袭、增殖以及抑制宿主防御机制等过程相关[8],因而在感染及致病中起关键作用[9],如产气荚膜梭菌和炭疽杆菌的毒素蛋白均是分泌蛋白[10-11]。产气荚膜梭菌的β毒素可通过引起细胞膜穿孔,造成一些离子选择性进入细胞,从而发生细胞病变、黏膜血管充血、组织水肿及炎性病变等,临床上表现为坏死性肠炎[12]。分泌蛋白常具有良好的免疫原性,如结核分枝杆菌的ESTA-6/CFP-10是分泌蛋白,能诱导良好的细胞和体液免疫反应;同时这些蛋白质也与细菌毒力相关,缺失ESTA-6/CFP-10的突变体,在细胞间的扩散速度、在巨噬细胞内的生长速度以及对巨噬细胞的细胞毒性等均大大降低[13];同时该蛋白质也是毒力型牛分枝杆菌与卡介苗(BCG)间的重要差异蛋白质[14]。
由此推测,支原体分泌蛋白的研究或许是解开支原体致病机制的一条新路径。然而支原体分泌蛋白的研究刚刚起步,至今只有零星报道,解析支原体分泌蛋白功能的研究更少。所以本文综述了近年来已发现的支原体分泌蛋白及研究方法,以期为支原体分泌蛋白的深入研究提供参考。
1 支原体分泌蛋白尽管分泌蛋白是细菌发挥致病作用与诱导免疫反应的重要活性成分,但支原体分泌蛋白的研究刚刚起步,只在少数几种支原体有报道。
1.1 人支原体(Mycoplasma hominis)P80人支原体P80[15]是首个被证明具有Ⅰ型信号肽序列的支原体分泌性蛋白。该蛋白质属于两型蛋白,既是膜蛋白,也是分泌性蛋白。根据这一现象,学者们提出了支原体分泌蛋白的分泌模式,即通过Ⅰ型信号肽序列将前体蛋白嵌入到细胞膜上,当信号肽被信号肽酶Ⅰ切割后则从膜上释放,成为分泌性蛋白[16]。
1.2 发酵支原体(Mycoplasma fermentans)MALP-404在发酵支原体中存在一类分泌蛋白,起初是一种膜表面脂蛋白,如MALP-404,大小约为41 ku,当被某种肽酶截断时,游离到上清中的肽段即成为分泌性蛋白,其中包括选择性相关脂质蛋白(selective lipoprotein associated, SLA);留在膜上的N端残基结构部分MALP-2可以通过识别TLR2激活宿主免疫反应[17]。
1.3 牛支原体(Mycoplasma bovis)MbovNase张慧(H.Zhang)等[18]用二维电泳和质谱分析发现了牛支原体第一个分泌蛋白,即一种牛支原体核酸酶(MbovNase),由基因MBOV_RS02825编码。该蛋白质也是一种两型蛋白,同时具有分泌蛋白和膜蛋白双重特征。功能研究证实该核酸酶不仅可以降解中性粒细胞的胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)[19-20],而且具有黏附素功能,能介导牛支原体侵袭宿主细胞,并可诱导细胞损伤和细胞凋亡。
1.4 无乳支原体(Mycoplasma agalactiae)多糖-蛋白质复合物P. Gaurivaud等[21]通过比较基因组学分析,发现无乳支原体和丝状支原体亚种可以分泌一种多糖-蛋白质复合物,这种复合物的形成和分泌与一种参与聚合和分泌的合酶基因(Gsm)编码蛋白有关。而在无乳支原体中,通过体外纯化方法证明这种表面多糖为β-(1→6)-葡聚糖,决定无乳支原体对抗血清抑菌作用的敏感性。而决定GsmA基因表达的开关(on/off)受该基因编码区不同长度的重复G序列的高频相变所调控。
1.5 丝状支原体亚种(Mycoplasma mycoides subsp)甘油磷酸酯氧化酶在丝状支原体亚种小菌落型培养基物上清中,可以鉴定出甘油磷酸酯氧化酶[22],该酶具有介导宿主细胞损伤和诱导免疫反应的功能。丝状支原体丝状亚种小菌落型活菌诱导血液白细胞凋亡的能力明显强于灭活菌,可能存在胞外囊泡或者分泌蛋白的参与[23]。
2 支原体分泌蛋白的分泌方式一般说来,分泌蛋白的合成和转运主要通过两种途径,即大部分分泌蛋白依赖内质网/高尔基体的经典分泌途径[24]和少数真核细胞蛋白不依赖内质网/高尔基体的非经典分泌途径[25]。
传统上认为,依赖内质网/高尔基体分泌途径是基于有完整的内质网-高尔基体分泌系统。分泌蛋白在N端有信号肽序列,牵引分泌蛋白到位于内质网膜的核糖体上合成,进入内质网加工后从外排点排出,在COP Ⅱ被膜小泡的包裹下运送至高尔基体,最后通过分泌小泡与质膜融合,分泌到细胞外[26]。
在细菌中不依赖内质网/高尔基体的非经典分泌途径比较常见,能够分泌不具有典型信号肽的蛋白质。非经典分泌蛋白有以下特点:不具有功能的信号肽;没有依赖于内质网和高尔基体的翻译后修饰;不被经典分泌途径抑制剂布雷菲尔德菌素和莫能菌素阻断;该类蛋白质的分泌依赖于温度和能量,也是可调控的[27]。在枯草杆菌中发现分泌蛋白RDPE没有信号肽,不依赖Sec[28]、Tat[29]分泌途径和细胞溶解,试验证明是通过非经典途径分泌的蛋白质[30]。
研究发现,支原体分泌蛋白的分泌方式存在类似于经典分泌途径(具有信号肽)和胞外囊泡的形式。
2.1 肽段截断模式支原体有些分泌蛋白,其前体蛋白通过类似于Ⅰ型信号肽的结构被牵引到细胞膜上进行锚定。当遇到外界环境改变时,前体蛋白的肽段或信号肽会被肽酶截断,一部分从细胞膜上释放进入上清成为分泌蛋白,发挥毒力或免疫相关功能等;而仍然存在于细胞膜上的部分则继续发挥其他生物学功能,例如黏附、激活病原体模式分子的识别或介导细胞免疫等。这种分泌模式可能是支原体的进化策略:作为膜蛋白有利于适应环境改变,作为分泌蛋白有利于发挥其致病作用和免疫诱导功能。例如前文提到的人支原体P80蛋白[15]和发酵支原体的MALP-404脂蛋白[17]等,MALP-404脂蛋白N端锚定在细胞膜上,C段暴露于细胞外,其酶解位点位于距N端残基第十四或第十五个氨基酸的位置;在发酵支原体不同毒株中,被肽酶降解时会出现不同长度的游离片段。猪肺炎支原体的纤毛黏附相关蛋白P216和P102也可能存在同样的分泌方式[31]。
2.2 胞外囊泡模式胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)又称囊泡状小体、颗粒体、凋亡小体、微泡和外泌体等,它的合成机制尚未清楚。它是一类球状双层蛋白脂质结构,囊内富集了大量的生物活性成分和毒力因子,包括分泌蛋白、核酸和糖类等,是与宿主细胞交流的主要方式之一,从而影响或者决定病原菌的致病性[32-34]。肿瘤细胞、中性粒细胞以及衰老的红细胞等脱落的微泡或颗粒体,都为胞外囊泡,其直径介于50~1 000 nm[35];一些由内囊泡胞吐形成的外泌体,其直径介于40~100 nm[36];一些程序性死亡或凋亡细胞产生的凋亡小体,也是胞外囊泡的一种,其直径为50~500 nm[37]。在支原体中,V. M. Chernov等[38]通过利用透射电子显微镜法、原子力显微技术、扫描电子显微镜等超显微观察和质谱分析法(LC-ESI-MS/MS),鉴定了支原体目无胆甾原体科成员——无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii) PG8胞外囊泡的97种分泌蛋白,其中37种是和细菌毒力相关的分泌蛋白。莱氏无胆甾原体的胞外囊泡,其直径介于70~120 nm;但也存在直径小于70 nm和超过120 nm的囊泡,约占5%。
3 分泌蛋白的研究方法支原体体外培养需要很丰富的培养基营养,常在培养基中添加马血清等成分以满足其需求。因此,支原体分泌蛋白研究的最大困难之一是去除培养基中大量杂蛋白质对分泌蛋白提取的干扰。
3.1 分泌蛋白的提取 3.1.1 减血清培养对培养基进行优化处理,即降低血清浓度而又不影响支原体正常生长。通过测定相同时间点不同血清浓度的培养基对支原体生长的影响来判断支原体最低血清需求,而支原体浓度的测定可以通过测定OD值估算以及菌落计数方法进行更准确的判断。J. A. Paes等[39]降低血清浓度至5%后,将猪肺炎支原体与絮状支原体(Mycoplasma floccular)培养48 h后,发现虽然两种支原体的生长稍微缓慢和菌量减少,但是生长曲线基本没有变化。对其分泌蛋白质组进行研究,分别鉴定了猪肺炎支原体62种分泌蛋白和絮状支原体26种分泌蛋白。其中猪肺炎支原体分泌蛋白中,有15种与毒力相关,而絮状支原体中有4种与毒力相关。
3.1.2 无血清培养在完全培养基中先将支原体培养到对数期,然后转移至无血清培养基中,一定时间后再收集支原体的分泌蛋白。无血清培养基需要满足细菌的基本生长,以维持细菌正常的生理活动。M.S.R. Couto等[40]利用改良的无血清Frey培养基培养滑液支原体(Mycoplasma synoviae),培养48 h后提取分泌蛋白质组,鉴定了27种分泌蛋白,其中8种是在常规培养基培养条件下没有检测到的新蛋白质。此外,发现一些在支原体细胞质中很常见的功能蛋白,可以在细胞表面暴露甚至分泌到细胞外,例如乙酸激酶、延伸因子G和Tu、酰基载体蛋白酶、醛缩酶、硫氧还蛋白还原酶、DnaK、丙酮酸脱氢酶E1的α和β亚单位和烯醇化酶等。
3.1.3 差异离心与微孔滤膜过滤支原体分泌蛋白的提取主要利用差速离心与微孔滤膜过滤相结合的方式,这样可以提取纯度高的分泌蛋白,减少杂蛋白质的干扰。虽然在不同支原体提取过程中离心转速和微孔滤器直径存在差异,但是基本步骤相似。第一步,通过低速离心去除支原体。在猪肺炎支原体分泌蛋白的提取中以4 000×g离心15 min除去支原体细胞[39];而在无胆甾原体则以5 000×g离心20 min[38];第二步,通过滤器过滤,进一步去除支原体碎片;第三步,超速离心,收集分泌蛋白。
3.2 分泌蛋白的分离 3.2.1 SDS-PAGE和质谱方法利用SDS-PAGE分离分泌蛋白,再用质谱分析鉴定分泌蛋白,而鉴定出的分泌蛋白可用免疫血清进行Western blot验证。相对于二维电泳,SDS-PAGE更加简洁、迅速,但是对分泌蛋白的丰度要求高,同时,没有去除足够的杂蛋白质以及对分泌蛋白样品的不当处理会影响结果的准确性。
3.2.2 蛋白质组学方法利用蛋白质组学技术研究分泌蛋白的技术,称为分泌蛋白质组,是分析一个细胞或病原菌分泌的所有基因产物的高通量技术[41]。目前常用的分离方法主要是二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)[42]和高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)[43]。这两种方法都可以和质谱仪联合使用,使结果更加准确、可靠[44]。M.S.R.Couto等[40]分离鉴定滑液支原体的分泌蛋白质组是采用2DE和质谱的方法;郑彦[45]采用SDS-PAGE和HPLC、2D-HPLC分离结合质谱检测技术对不同代数的永生化支气管上皮细胞MP49和MP188的分泌蛋白分布加以研究,发现2D-HPLC/MS的结果更为敏感,能够检测低丰度的功能性蛋白质。对于在复杂的生物体中参与多种重要生理活动的分泌蛋白质组的研究,研究方法的选择更为重要。
分泌蛋白的分离还可以利用蛋白质组学中蛋白质非标记定量技术(label-free quantitation)[46],其基本原理:通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析,使用稳定的同位素做内部标准,比较不同样品中相应肽段的信号强度,从而对肽段相应的蛋白质进行相对定量。J. R. Chapman等[47]利用label-free分析金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)不同突变株(即Δagr、Δsae、Δrot和野毒株)分别在富营养和贫营养的生长条件下毒力蛋白分泌的差异,总共鉴定出595个分泌蛋白,并且其中65%(385个)的分泌蛋白在上清中检出;同时发现失活阻遏物rot可以导致分泌蛋白增多。这些方法为支原体分泌蛋白研究提供了思路和方法。
3.2.3 生物信息学预测及重组表达通过生物信息学预测分泌蛋白,再对相应基因进行克隆和重组表达验证,也是研究分泌蛋白的重要方法之一。任冬梅[48]通过对168株猪肺炎支原体基因组进行生物信息学预测和BLAST比对,得出4种蛋白质可能为分泌蛋白或胞外蛋白,即Mhp168_116、Mhp168_322、Mhp168_341、Mhp168_549;然后对这些蛋白质进行了基因克隆和表达,确定这些蛋白质具有良好的免疫原性和反应原性,可望作为疫苗的候选抗原;李玲婷等[49]利用跨膜区TMpred及Target P等程序,预测海南木豆丛枝植原体PPWB-Hn存在由一个完整质粒编码的4种分泌蛋白,通过克隆和重组表达,发现其中一种蛋白能分泌至膜外,同时定位到细胞膜上;彭忠等[50]通过Signal P、Phobius等生物信息学软件对多株多杀性巴氏杆菌HN06进行分泌蛋白预测,共预测到373个分泌蛋白。
4 瓶颈与展望支原体分泌蛋白和分泌蛋白质组学的研究是剖析支原体致病与免疫机制的方法之一,也是研究新型疫苗和药物靶标的重要手段。目前,研究支原体分泌蛋白可以通过强弱菌株或种属相近的菌株分泌蛋白的差异表达,例如,无乳支原体和丝状支原体亚种相同培养条件下差异分泌蛋白的比较,挑选差异的分泌蛋白,进行重要蛋白质的研究。然而,该类研究面临如下严重挑战:
4.1 分泌蛋白在自然条件和特殊培养条件下生长可能存在差异如前所述,支原体分泌蛋白的分泌与环境应激有关。因此,体外少蛋白质或无蛋白质培养环境对支原体本身是一种应激刺激,这种状态下获得的支原体分泌蛋白可能与自然培养条件和感染状态下的分泌蛋白间存在较大差异。
4.2 分泌蛋白在体外培养和体内自然感染状态下存在差异目前,大部分实验研究是体外培养支原体,提取分泌蛋白,这有异于体内自然感染状态下支原体分泌蛋白的分泌。回归动物体内,研究支原体分泌蛋白也是需要解决的。
4.3 支原体分泌蛋白的功能鉴定由于多种支原体缺少有效的实验动物模型,确定支原体分泌蛋白的毒力和致病相关功能难度很大。
总之,支原体分泌蛋白的研究虽然刚刚起步,但关注度大,可望不久将来成为破解支原体致病和免疫机制未解之谜的一条有效途径。同时,由于支原体生长代谢的独特性,其分泌蛋白的研究也将遭遇比细菌更大的挑战。
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