氨基酸是蛋白质的基本构建单元，它还可以作为信号分子，在调节信号通路和细胞代谢方面发挥特殊功能[1-2]。因此，氨基酸平衡对动物健康生长至关重要。真核生物(特别是哺乳动物)具有维持机体氨基酸平衡的机制，以保证细胞内氨基酸的正常水平。在氨基酸平衡的感应调节过程中，GCN2和mTORC1这两条信号通路发挥着重要作用。GCN2路径能有效感应胞内氨基酸缺乏，而mTORC1路径则能对胞外氨基酸水平的变化做出响应。本文对这两条信号路径在维持氨基酸平衡过程中的感应及应答机制进行了综述，以加深对氨基酸平衡感应的认识。
1 GCN2信号路径对氨基酸缺乏的感应及其应答机制真核细胞可通过整合应激反应(Integrated stress response，ISR)来应答引起细胞应激信号的环境变化[3]。翻译起始因子2(eIF2) 激酶家族是ISR过程中的重要感应体，该家族包含4个成员，它们在不同组织中被不同的应激信号激活，但有一个共享靶点(eIF2α的Ser51)，都能激活eIF2α[4]。一般性调控阻遏蛋白激酶2(General control non-derepressible 2，GCN2) 作为该家族成员之一，能感知细胞内氨基酸缺乏[5]。当细胞处于氨基酸缺乏状态时，该酶会被激活并通过相关信号通路调节机体代谢，以减缓细胞内氨基酸缺乏的危害。
1.1 GCN2对氨基酸缺乏的感应机制脑是采食行为的中枢组织者，它可以控制食物摄入的质与量，以满足机体组织的营养需求[6-7]。氨基酸是构成机体蛋白的基础物质，平衡氨基酸的摄入对动物健康来说至关重要[8-9]。为了确保适宜的氨基酸平衡，动物往往会拒绝采食缺乏一种或多种必需氨基酸的食物，而去寻找氨基酸平衡性更好的食物。在感应某些氨基酸缺乏的过程中，GCN2发挥着重要作用。蛋白合成时，各种氨基酸之间不能相互替代，因此细胞必须能有效检测任何一种氨基酸的缺失，以避免肽链合成过程中可能的失败[10]。氨基酸特异性氨酰基tRNA合成酶(aaRSs)可完成氨基酸与它们的各自的tRNA的装载，即形成氨酰基tRNA(aa-tRNA)的形式，该形式给氨基酸和tRNA反密码子的关联提供了物理基础，而空载的tRNA会在游离氨基酸处于很低的水平时积累[11]。GCN2可以检测到任何空载的tRNA，它对所有的空载tRNA具有高结合力。例如，用化学抑制的方法造成组氨酸、色氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸以及支链氨基酸的tRNA空载积累时，都会引起GCN2的激活，某一氨基酸的缺失还能引起其他氨基酸tRNA的脱酰基，如亮氨酸饥饿除了引起亮氨酸空载tRNA积累外，还会引起丝氨酸和苏氨酸的空载tRNA积累[12]。这说明各氨基酸缺乏的感应可能存在互作现象。当GCN2和空载tRNA结合后，GCN2的构象发生改变，从而被激活[13]。活化的GCN2会引发许多细胞应答，包括eIF2α磷酸化引起的翻译起始阻碍及同时发生的特异性转录程序的激活[14]。
1.2 GCN2路径对氨基酸缺乏的应答机制真核细胞含有应激激活蛋白激酶，它们能使细胞降低大部分蛋白质的合成，同时激活编码应激管理蛋白的基因转录。这些激酶的靶点是翻译起始因子2的α亚基(eIF2α)Ser-51位点。GCN2作为一种能直接感应胞内氨基酸饥饿的应激激活蛋白激酶，理论上可以检测任何一种氨基酸，包括必需氨基酸和非必需氨基酸[15]。当动物摄入氨基酸失衡饲粮(引发氨基酸饥饿)时，被激活的该酶会磷酸化eIF2α的Ser-51位点，进而降低eIF2在招募蛋氨酰起始子tRNA到40S核糖体亚基方面的功能。因为eIF2α磷酸化会抑制鸟苷酸交换因子eIF2B的活性，阻碍eIF2B催化eIF2-GDP到eIF2-GTP的循环，从而降低胞内eIF2·GTP·Met-tRNAiMet三元配合物的浓度[16-17]。该三元配合物的装配抑制会降低全局蛋白翻译的速率，从而减少胞内氨基酸消耗。
GCN2通过eIF2α抑制全局蛋白翻译的同时，会促进某些在5′UTRs处有上游开放阅读框(uORF)的mRNA翻译，例如激活转录因子4(ATF4)。GCN2对ATF4的翻译促进作用也是通过前面提到的三元配合物实现的：低浓度的该配合物能使翻译转录起始复合物避开ATF4 mRNA前导序列中的多个“诱饵”AUG起始密码子，并翻译ATF4 mRNA编码序列[18]。ATF4是一种控制适应性功能的关键基因转录的重要调控子，它通过结合到涉及代谢、营养素吸收(氨基酸转运体表达)以及凋亡和自噬的调控的特定靶基因的C/EBP(CCAAT/增强子结合蛋白)-ATF应答元件(CARE)序列上，从而增强这些特定基因的转录[19]，以缓解氨基酸缺乏对细胞的危害。
氨基酸缺乏诱导的GCN2/eIF2α/ATF4路径激活可以提高质膜上氨基酸转运体的表达，从而促进氨基酸吸收。E. Timosenko等[20]发现，在完整培养基中，野生型Hela细胞的ATF4蛋白几乎无法检测到，而当缺乏色氨酸或谷氨酰胺时，ATF4表达量则显著增加，同时氨基酸转运体SLC1A5表达也增加；把Hela细胞的ATF4敲低后，色基酸的缺乏则不会引起SLC1A5表达的上调。这说明色氨酸的缺乏会引起一些ATF4依赖性氨基酸转运体表达的上调，这反过来会促进色氨酸和谷氨酰胺的吸收。
氨基酸缺乏诱导的GCN2/eIF2α/ATF4路径激活也可以通过促进一些氨基酸合成酶的转录来增加胞内特定氨基酸的合成量。研究表明，当氨基酸处于缺乏状态时，GCN2/eIF2α/ ATF4信号路径的激活可以使ATF4结合到天冬酰胺合成酶(ASNS)启动子区的营养感应应答元件1(NSRE-1，一种CARE)序列上，从而增强该酶的转录活性[21]。这种ASNS转录活性的增强不仅受到天冬酰胺缺乏的诱导，也受到亮氨酸、异亮氨酸和谷氨酰胺缺乏的诱导，而且ASNS mRNA和蛋白表达的增加无论是在所有氨基酸缺乏还是单一氨基酸缺乏的情况下都会发生。ASNS可催化ATP依赖型的天冬氨酸和谷氨酰胺向天冬酰胺和谷氨酸的转化[22]，这是真核细胞氨基酸应答(Amino acid response，AAR)的一种重要方式。
氨基酸缺乏诱导的GCN2/eIF2α/ATF4路径激活还可以启动自噬基因转录，从而启动自噬过程而增加胞质中的氨基酸含量。当细胞处于氨基酸饥饿状态时，敲除抗原呈递细胞或肠上皮细胞中的GCN2基因都会降低自噬反应[23]。由GCN2信号路径激活的ATF4既可以直接启动一些自噬基因转录，如Atg16l1、Map1lc3b、Atg12、Atg3、Becn1及Gabarapl2，也可以协同CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)完成对一些自噬基因的转录启动，如p62/Sqstm1、Nbr1和Atg7[24]。自噬是一个进化上高度保守的细胞过程，起始于对细胞组分糖原、脂质、可溶性蛋白、核糖体和细胞器的吞噬，随后开始酶解，生成基础营养素(如糖、脂质、氨基酸和核苷)，接着排出到细胞质中。这些由自噬产生的营养素可以参与到细胞器更新过程中及维持能量水平、蛋白质合成和关键代谢过程中[25-26]。当氨基酸饥饿时，自噬的启动可以通过循环利用氨基酸来补充细胞内氨基酸的不足。
此外，在多巴胺神经元中，GCN2路径激活的ATF4还能通过与γ-氨基丁酸受体1亚基(GABA(B)R1) 直接互作，介导脑中前梨状皮层的多巴胺神经元的γ-氨基丁酸(GABA)信号通路抑制，同时促进多巴胺的释放，从而抑制采食[27]。这有助于动物停止采食氨基酸失衡饲粮，进而寻求更加理想的氨基酸平衡饲粮，以缓解氨基酸缺乏。
2 mTORC1信号通路对氨基酸缺乏的感应及其应答机制mTOR蛋白激酶包含于2种离散复合物中，即mTORC1和mTORC2，这2个复合物除了共有mTOR外，还含有不同的蛋白组件，能磷酸化不同的底物[28]。mTORC1核心组件包括mTOR、调控相关蛋白Raptor和复合物组装及稳定性所需的mLST8。mTORC1能调控大量有关细胞生长和代谢的过程，它是以信号传递结点的方式发挥功效，这种结点可以整合细胞营养素和应激状态，并诱导适当的细胞应答。mTORC1通过下游效应物S6K1、4E-BP1和ULK1来控制核糖体的生物合成、蛋白质翻译和自噬等过程[29]。当氨基酸水平充足时，mTORC1信号路径会被激活从而增加胞内氨基酸的消耗，以维持胞内氨基酸平衡。
2.1 mTORC1信号路径对氨基酸水平的感应机制前文提到的GCN2主要是在机体氨基酸缺乏时通过增加氨基酸来源的同时减少氨基酸消耗来维持机体的氨基酸平衡，而mTORC1则是在机体氨基酸摄入充足条件下，主要通过增加氨基酸去路(消耗)的方式来维持氨基酸平衡。
mTORC1活性受到来自包括营养素在内的多种信号调节，从而影响转录、翻译和自噬等生长相关的多种细胞过程。在营养素信号中，氨基酸是一类重要的物质，它既可以作为信号分子向胞内传递胞外氨基酸水平的信息，又能作为mTORC1应答氨基酸充足信号而启动蛋白质合成的底物，从而快速减少胞内氨基酸含量。mTORC1对胞外氨基酸水平的感应需要位于细胞膜上的氨基酸转运体协助，因为胞外氨基酸水平会影响膜上的相关氨基酸转运体表达，这些转运体的表达水平一定程度上会影响进入胞内的氨基酸水平。研究已证实，mTORC1能有效应答胞外亮氨酸[30-31]、精氨酸[32]和谷氨酰胺[33]的水平，但mTORC1的充分活化除了以上3种氨基酸外还需要其他氨基酸的参与[34]。这可能是因为一些膜上的氨基酸转运体需要额外的氨基酸来激活相应的协同转运机制[35]，且氨基酸转运体的表达丰度在mTORC1活化过程中也发挥着重要作用[36]。由此推测，各氨基酸可能在激活mTORC1过程中都发挥着一定作用，有些氨基酸主要是通过激活相应氨基酸转运体而协助其他氨基酸的有效转运，有些氨基酸则直接发挥激活mTORC1的作用。这可能是mTORC1感应胞外各种氨基酸水平的机制。
mTORC1对胞外氨基酸水平的感应受到多个因子的调节，如Ras相关鸟苷三磷酸酶(Rag GTPases)、脑富含的Ras同系物(Rheb)[37]和丝裂原激活蛋白激酶-3(MAP4K3) 等。在该感应过程中，氨基酸与这些调节子具有互作关系。
mTORC1位移到胞质溶酶体膜上是它活化并应答胞外氨基酸水平的第一步[38]，该过程受到Rag GTPases的调控。Rag GTPases的活化需要Rag蛋白的调控子复合物(Ragulator)和液泡ATP酶(v-ATPase)这2种物质的参与，它们能辅助Rag完成mTORC1在溶酶体膜上的空间定位[39]。研究表明，v-ATPase、Ragulator和Rag GTPases三者是以复合物的形式发挥功效，而氨基酸则对该复合物具有调节作用。当氨基酸水平很低时，v-ATPase-Ragulator-Rag GTPases复合物处于非活性构象，无法与mTORC1形成关联，从而使得mTORC1定位于胞质中。当氨基酸充足时，Rag GTPases通过v-ATPase-Ragulator复合物首先定位到溶酶体膜上。这就说明v-ATPase-Ragulator-Rag复合物作为一种氨基酸介导的mTORC1在溶酶体表面的停泊位点而发挥功能[38]。有研究发现，特定氨基酸在介导mTORC1完成空间定位时存在一定差异，亮氨酸引起mTORC1位移到溶酶体表面时需要v-ATPase-Ragulator-Rag复合物，但谷氨酰胺则仅需要v-ATPase[40]。当mTORC1完成空间定位后，相关的激活子才能将它激活。Rheb作为一种mTORC1的上游介质，是氨基酸充足时mTORC1活化所必需的物质[41]。跟其他小GTPases一样，Rheb的活性形式也是GTP结合型，因此mTORC1可直接被Rheb-GTP激活。氨基酸能通过一种独特的GTPase激活蛋白(GAP)或GTPase交换因子(GEF)调控Rheb的GTP装载。当氨基酸缺乏时，Rheb则无法装载GTP[42]。MAP4K3也是一种调控氨基酸诱导mTORC1激活的因子，该调节过程需要一种PP2A靶点亚基PR61的参与。当氨基酸缺乏时，PP2A/PR61与MAP4K3发生互作，以促进MAP4K3激活片段中的Ser170位点去磷酸化并抑制MAP4K3激活；氨基酸充足时，它可以直接刺激MAP4K3的快速激活[38, 43]。以上提到的mTORC1在感应胞外氨基酸水平过程中的几种调控因子并不完全孤立。目前研究发现，MAP4K3和Rag蛋白在介导mTORC1感应胞外氨基酸的过程中存在一定的互作关系，但两者也存在各自的独立性[44]。mTORC1除了能感应胞外氨基酸水平而调控胞内氨基酸的消耗外，它还能监控胞内溶酶体腔的氨基酸池，从而控制它的释放，这可能对调节胞内氨基酸平衡也具有重要意义[45]。
2.2 mTORC1路径对氨基酸充足的应答mTORC1控制了核糖体的生物合成、蛋白质翻译和自噬等过程。这些过程则由mTORC1下游的底物所介导，如p70核糖体蛋白S6激酶(S6K1)、真核起始因子4E(eIF4E)结合蛋白1(4E-BP1) 和Unc-51样自噬激活激酶1(ULK1) 等。
mTORC1可通过磷酸化下游物质，如4E-BP1和S6K1，进而正向调控蛋白质合成和细胞生长[38]，这也是胞内氨基酸的重要去路。4E-BP1是一种翻译起始抑制子，而S6K是一种能控制广泛的核糖体生物合成基因转录的激酶，mTORC1可在抑制4E-BP1的同时激活S6K[46]。当氨基酸(特别是支链氨基酸)充足时，由mTORC1介导的这条蛋白合成路径被激活，促进蛋白质合成及细胞生长，而当氨基酸被去除后，mTORC1活性则会迅速消除，以减少氨基酸的消耗，这种对氨基酸水平的快速响应机制利于维持细胞内氨基酸的平衡。
自噬是溶酶体依赖性的细胞降解过程，它能在营养饥饿时产生营养物质(如氨基酸)及能量以维持基本的细胞活性。ULK1激酶是诱导自噬起始的关键激酶[47]，mTORC1对该激酶具有抑制作用[48-49]。当氨基酸饥饿时，mTORC1活性受到抑制，解除了对ULK1激酶的抑制，从而引起自噬启动[47]，这是对GCN2信号路径介导自噬的补充。
3 总结与展望机体对氨基酸平衡的调节主要包括两方面。当氨基酸充足时，mTORC1信号通路会被激活，磷酸化下游的4E-BP1和S6K1，促进基因转录及翻译，从而正向调控蛋白合成及细胞生长，增加氨基酸的去路。当氨基酸饥饿(缺乏)时，GCN2路径的信号通路会被激活，一方面通过eIF2α磷酸化路径抑制全局mRNA翻译，以减少氨基酸的消耗，另一方面会激活ATF4：① 引起氨基酸转运体和氨基酸合成酶表达的增加，以提高细胞对氨基酸的摄入与生成；② 抑制脑中前梨状皮层的多巴胺神经元的γ-氨基丁酸(GABA)信号通路而抑制采食，以避免采食氨基酸失衡饲粮，从而寻求更好的氨基酸平衡食物源；③ 启动自噬基因的转录，通过增加自噬过程而降解溶酶体蛋白来补充细胞内氨基酸的不足。除了ATF4路径激活自噬外，氨基酸饥饿也会通过抑制mTORC1活性，解除mTORC1对其下游自噬起始的关键激酶ULK1的抑制作用，从而启动细胞自噬，也同样达到补充细胞内氨基酸不足的目的。
GCN2和mTORC1控制着细胞内氨基酸的来源和去路，在调节机体氨基酸平衡过程中发挥着重要作用，而氨基酸(特别是支链氨基酸)与这2条路径又具有双向交流的关系。那么，为了更加高效的对动物进行氮营养调控，如何通过外界干预手段来调控氨基酸在细胞内的释放速率，进而合理有效地调控GCN2和mTORC1信号路径，以提高氨基酸的利用率，如何通过额外补充特定氨基酸才能在保证机体生理功能正常的前提下最大化促进蛋白质合成与细胞生长，从而达到降低氮排放和促进动物健康的目的，这些问题有待进一步研究。
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