2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
2. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
禽类异嗜性粒细胞(heterophil,H细胞)是机体抵御外界致病微生物的一道重要防线,它广泛存在于禽类外周血液中,在机体特异性免疫系统未发育成熟的时候,对于杀灭外来致病微生物起到决定性的作用[1]。禽类的异嗜性粒细胞类似于哺乳动物的中性粒细胞,但是H细胞与中性粒细胞在行使功能上差别显著,H细胞的颗粒不分泌过氧化物酶和碱性磷酸酶,所以H细胞抗菌是通过非氧化性脱氨机制和一些细胞因子的激活[2-3]。H细胞表面的模式识别受体(pattern-recognition receptors, PRRs)与细菌的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)相互作用,识别并进行吞噬作用,并且能够分泌大量细胞因子和趋化因子,如β防御素、白三烯B4等,并且能够激活其他免疫途径发挥免疫作用[4-6]。
H/L值(heterophil/lymphocyte)是异嗜性粒细胞和淋巴细胞的比值。研究表明,当机体受到外界刺激(病毒、细菌、环境刺激等)后,异嗜性粒细胞数量增多,淋巴细胞和巨噬细胞的数量减少[7-8]。在一定的时期内H/L值持续升高,随后逐渐降低,而后趋于稳定。H/L值可以作为反映机体一般抗病能力强弱的指标[9-10]。前期研究中,胡耀东估计H/L值的遗传力为0.28±0.042[11],J. L. Campo等估计36周龄鸡H/L值的遗传力为0.59[12],表明H/L值这一指标具有中等遗传力,表型能够稳定遗传。目前研究中很多学者都以H/L值作为动物福利[13-15]和机体抗应激强弱的指标来进行研究,以H/L值为抗病指标进行研究的报道较少。本试验以低H/L值为选择指标的选择系为研究对象,将高低H/L值个体分组进行沙门菌感染,检验不同H/L值的群体对沙门菌的抵抗能力的差异。
1 材料与方法 1.1 实验动物及样品采集京星黄鸡H系来自于中国农业科学院北京畜牧兽医研究所昌平基地。该系已经选育H/L比值8个世代。用于试验的亲本均用选择系中H/L值极高和极低个体,以公母比例1:3进行家系组建(表 1),繁种前均进行鸡白痢检测(鸡白痢平板凝集抗原,中国兽医药品监察所),阴性个体进行家系组建,繁育后代,试验分组为高H/L值(HG组)和低H/L值(LG组)两组,分别为70只和72只。雏鸡用胎粪进行鸡白痢检测,阴性个体在无菌隔离舱中饲养(IPQ-3型负压隔离器,中国农业大学),自由采食和饮水。SPF雏鸡饲料购于北京科奥饲料有限公司,饮水用高压灭菌水(121 ℃,15 min)。通过预试验,得出肠炎沙门菌50041的20%致死率所对应的菌液浓度为5×109CFU(colony-forming units)·mL-1,雏鸡7日龄经口服感染肠炎沙门菌菌液,感染剂量为0.5 mL·只-1。感染后1、2、4、7、13 d(dpi)进行样本采集,每个采样时间点HG组和LG组分别采集10只鸡的血液、肝、盲肠组织。血液室温放置,自然析出血清,用于检测血清炎症介质。肝和盲肠置于无菌离心管中用于组织载菌量的测定。
肠炎沙门菌50041标准菌株购于中国工业微生物菌种保藏中心(CICC),按照CICC提供的操作说明进行细菌复苏传和传代培养。亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)传代培养至4代菌液,利用倍比稀释的方法将原菌液稀释后涂布于亚硫酸铋琼脂(BS)和SS(Salmonella Shigella agar)培养基进行培养,计算菌落数。获得的菌液浓度为5×109 CFU·mL-1,用作感染菌液。
1.3 死亡率的统计感染后开始死亡率的统计,包含死亡个体和濒死个体,濒死个体为感染症状非常明显的个体,不能站立,精神极度沉郁,羽毛蓬乱、采食废绝、嗜睡、腹泻严重[16]。
1.4 血清炎症介质的测定用ELISA方法检测血清炎症介质(北京冬歌生物有限公司),测定指标包括白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白三烯B4(LTB-4) 在血清中的浓度。
1.5 组织载菌量的测定取新鲜试验动物盲肠和肝组织各0.1 g置于无菌离心管中,分别加入无菌生理盐水1 mL,用组织破碎仪进行破碎后,倍比稀释10、100、1 000倍后分别取稀释液100 μL涂布于亚硫酸铋琼脂平板上,每个梯度3组重复,培养48 h后,对平板上的菌落数进行统计,然后计算出1 g组织所含的活菌数。
1.6 数据处理与分析所有数据采用Excel 2007计算,使用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析,以P<0.05为差异显著的判断标准。利用GraphPad Prism 6软件制图。
2 结果 2.1 肠炎沙门菌感染鸡的死亡率统计由表 2可知,亲本繁育后代分为两组,分别为LG组(72只)和HG组(70只),感染后LG组死亡2只,HG组死亡8只。根据鸡群感染后状态判定LG组濒死数为10只,HG组濒死数为8只。两组死亡率(含濒死组)分别为16.7%和22.9%。HG组死亡率大于LG组。
感染后分别测定1、2、4、7、13 dpi的肝组织载菌量和盲肠组织载菌量。由图 1可知,感染后HG组和LG组肝组织载菌量均呈现先上升后下降的趋势,并且在2 dpi达到最大值。各个测定时间点HG组的肝组织载菌量均大于LG组,且在1、2、4、7 dpi达到显著差异(P<0.05),13 dpi HG组的肝组织载菌量高于LG组,但差异不显著(P>0.05);由图 2可知,1 dpi HG组盲肠组织载菌量呈现下降趋势;LG组呈现先上升后下降的趋势,并在感染后第2天达到最大值。各测定时间点HG组盲肠组织载菌量均大于LG组,但差异不显著(P>0.05)。
由图 3可知,感染后HG组和LG组血清IL-6浓度呈现先上升后下降的趋势,且上升速度快,下降速度慢。在2 dpi达到最大值,峰值浓度为谷值浓度(感染后1 d)的两倍左右,之后逐渐降低,至感染后7 d血清IL-6浓度值与感染后1 d相当。每个采样时间点LG组血清IL-6浓度均大于HG组,两组峰值之间相差1.5倍左右。经统计软件分析,在1、2、4 dpi两组血清IL-6浓度差异达到显著水平(P<0.05),7和13 dpi未达到显著水平(P>0.05)。
感染后血清LTB-4浓度变化见图 4,HG组和LG组血清LTB-4浓度在前2 d均维持较高水平,2 d后逐渐降低,7~13 dpi水平最低。其中HG组血清LTB-4峰值浓度约为谷值浓度的2倍,LG组峰值浓度约为谷值浓度的3倍。感染后每个采样时间点LG组血清LTB-4浓度均大于HG组,且在1、2 dpi时差异倍数约为2倍。在感染后1、2 d两组血清LTB-4浓度差异达到显著水平(P<0.05),4、7、13 dpi未达到显著水平(P>0.05)。
由图 5可知,感染后HG组和LG组血清TNF-α浓度呈现先上升后降低的趋势,在感染后2 d达到最大值,峰值浓度约为谷值浓度(感染后1 d)的两倍,之后逐渐降低,至感染后7 d血清TNF-α浓度值与感染后1 d相当。每个采样时间点LG组血清TNF-α浓度均大于HG组,两组峰值之间相差1.5倍左右。经统计软件分析,在感染后1、2 dpi两组血清TNF-α浓度差异达到显著水平(P<0.05),4、7和13 dpi未达到显著水平(P>0.05)。
沙门菌病是一种人畜共患病,不仅对家禽业造成巨大经济损失,还对生物公共安全造成危害。由于其传播途径广泛,造成预防的困难。沙门菌疾病的预防和治疗在世界范围内都很棘手。对沙门菌病的治疗主要有疫苗和抗生素两种方法,但均存在一些问题。所以,利用遗传选育的方法提高机体自身抵抗力必然是最好的抗沙门菌病的方法。H/L值作为机体抗应激能力的指标已经被广泛研究[7, 12]。病原分子入侵机体也是对机体的刺激,所以,以H/L值为指标来研究机体一般抗病力是非常重要的。
禽类受到病原感染发生炎症反应时,H细胞表面的模式识别受体与细菌的病原相关分子模式发生相互作用。例如,TLR识别细菌PAMP后,可以发生自身的二聚化,富集带有TIR结构域的接头蛋白髓样分化初始反应蛋白88(myeloid differentiation primary-response protein 88, MyD88)、包含TIR结构域的诱导干扰素β产生的适配体蛋白等,通过激活下游多种激酶,可以诱导NF-κB和干扰素调节因子的激活,介导异嗜性粒细胞细胞内容物颗粒产生脂肪氧化酶-5和环氧合酶-2[17],这两种酶是机体内花生四烯酸代谢主要途径的关键酶,可以催化花生四烯酸代谢成为各种前列腺素(prostaglandin, PGs)和白细胞三烯(leukotrienes, LTs),这两大类介质都具有杀菌作用,对大肠埃希菌和沙门菌等多种细菌具有杀灭作用[18]。其中LTB-4和PGE-2对很多细菌的繁殖有强烈的抑制和杀灭作用,从而达到保护机体的作用,可以作为内源性消炎药。同时,机体受到外源特别是细菌感染后,巨噬细胞能够分泌大量的IL-6,IL-6又能刺激机体其他免疫细胞(单核细胞、肥大细胞等)分泌TNF-α,炎症状态下TNF-α可以抑制H细胞的凋亡,并且能够使H聚集在炎症反应处,促进机体的免疫应答反应[19]。本试验中测定了血清中IL-6、TNF-α、LTB-4的含量,且高低H/L组间在感染后48 h内存在显著差异,也提示高低H/L组对肠炎沙门菌的抗性不同,LG组抗性优于HG组。
组织载菌量是机体受到细菌感染后反应机体与细菌相互作用的一个重要指标。有研究表明,雏鸡在受到肠炎沙门菌感染后,盲肠、脾、肝等组织的组织载菌量差异显著,且组织载菌量低的群体对沙门菌的抗性更高[20]。本试验中测定了肝和盲肠组织载菌量,盲肠载菌量各时间点HG组均大于LG组,且变化趋势一致,但差异不明显,分析可能是因为细菌进入机体首先侵袭肠道,并且肠道菌群复杂,个体间选择性清除的能力不同造成的。感染后肝组织载菌量各时间点HG组均大于LG组,且差异显著。提示H/L值低的群体肠炎沙门菌的抗性优于H/L值高的群体。
在前期研究中,H/L值作为一个反应机体抗应激的指标,被广泛研究[21-22]。机体受到外界应激(冷、热、饥饿等)和病原侵入,均可以导致H细胞的聚集增多和H/L值的增大。据报道,鸡群体中不同H/L值个体对热应激表现出的抗性不同,H/L值低的群体在热应激后,产蛋率、蛋重、体重等方面的表现均优于H/L值高的群体,其后代对传染性贫血、气囊炎和马立克病的抗性也有差异,在证明H/L值是一个可以遗传的指标,且具有较高的遗传力[12, 22]。本研究结果表明H/L值低的群体在感染肠炎沙门菌的时候表现出更好的抗性,结合其他研究,相关的指标还包括H/L值的变化率、血清抗体滴度、皮质醇浓度以及体重等[23]。同时,在机体受到寄生虫感染的时候H/L值的变化与细菌感染时的变化相同,提示异嗜性粒细胞对机体抵抗寄生虫感染可能也有重要的作用。
4 结论具有高低H/L比值亲本繁殖的雏鸡当受到沙门菌感染后,低H/L值组雏鸡成活率显著高于高H/L值组,并具有较低的组织载菌量和较高的血清炎性介质水平,说明低H/L值的雏鸡在沙门菌感染时免疫反应更为明显,具有更强的沙门菌抵抗能力。
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