畜牧兽医学报  2017, Vol. 48 Issue (8): 1505-1510. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2017.08.015    PDF    
一株牛源污蝇杆菌的分离鉴定、耐药性及耐药基因检测
李雪嵩, 张喜庆, 董文龙, 王羽, 张红伟, 田佳琪, 马红霞, 高云航     
吉林农业大学 动物科学技术学院, 长春 130118
摘要:污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica)是一类新出现的罕见的人畜共患致病菌。2016年10月,吉林省某肉牛场一头育肥牛眼睑出现化脓病灶,使用多种抗菌药物治疗效果不佳。无菌采集病牛眼睑分泌物,进行细菌分离培养。分离菌株经培养特性、染色镜检、生化试验、16S rRNA序列分析,确定为污蝇杆菌,其对小鼠有致病性。分别用20种抗生素对分离到的菌株使用K-B纸片扩散法测定其耐药性,结果显示对青霉素、头孢拉定、红霉素耐药,对其余17种药物敏感。分别对β-内酰胺类耐药基因(TEMADCOXA-23、OXA-51)、大环内酯类耐药基因(ermAermX)以及四环素耐药基因(tetKtetW)进行检测,结果均显示阴性。
关键词污蝇杆菌    分离鉴定    耐药性    耐药基因    
Isolation, Identification, Drug Resistance and Detection of Drug Resistance Genes of Bovine Wohlfahrtiimonas chitiniclastica
LI Xue-song, ZHANG Xi-qing, DONG Wen-long, WANG Yu, ZHANG Hong-wei, TIAN Jia-qi, MA Hong-xia, GAO Yun-hang     
School of Animal Science & Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract: Wohlfahrtiimonas chitiniclastica is a kind of emerging, rare zoonotic pathogen. In October of 2016, a head of fattening cattle from a beef cattle farm of Jilin Province showed appear purulent lesions in the eyelid, and a variety of antimicrobial treatments are not effective. Eyelid secretion of diseased cattle were collected to isolate and culture bacteria. According to culture, staining, biochemical test and 16S rRNA sequence analysis, the isolated strain was identified as Wohlfahrtiimonas chitiniclastica, and it was pathogenic to mice. The resistance of the isolate was determined by K-B disk diffusion method using 20 antibiotics. The results showed that the isolate was resistant to penicillin, cefradine and erythromycin, and it was sensitive to the other 17 drugs. Then the β-lactam resistance gene (TEM, ADC, OXA-23, OXA-51), macrolide resistance genes (ermA, ermX) and tetracycline resistance genes (tetK, tetW) were detected, respectively, and the results were negative.
Key words: Wohlfahrtiimonas chitiniclastica     isolation and identification     drug resistance     resistance gene    

污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica)首次由匈牙利E. M. Tóth等[1]于2008年在黑须污蝇第三期幼虫体内分离得到。2009年在法国东南部以及2013年在阿根廷[2]引起人类个体脓毒症的发生。2012年我国上海出入境检疫检验局首次报道关于污蝇杆菌进入我国境内的信息[3]。至今只有十余篇关于人类和野生动物分离株的报道。2016年,山东农业大学于一头患蹄冠炎的病灶内分离得到一株污蝇杆菌[4]。这也表明这种新型的人畜共患病原菌在我国部分地区已经出现零星散发的趋势。

作者于吉林省某肉牛场患病牛眼睑部分离得到1株细菌,命名为NY2,通过鉴定,确定为污蝇杆菌。对分离得到的污蝇杆菌进行耐药性分析,并对相关耐药基因进行检测,以期对由该菌引起的化脓性感染的治疗和预防起到一定的指导作用。

1 材料与方法 1.1 病料来源及背景

吉林省某肉牛场出现一头眼部有化脓病灶的病牛,无菌取得脓汁,进行细菌分离培养。通过对畜主的询问,得知该患病牛在平时饲养中身体较弱,喜静,发病前夕正处炎热的夏季,蚊蝇叮咬较严重。该牛患病后,畜主对其使用了青霉素和头孢曲松,肌肉注射,效果不佳。

1.2 培养基及试剂

TSA固体培养基、麦康凯琼脂培养基、胎牛血清、TSB液体培养。DNA Marker DL2000、10×Buffer、dNTP Mixture、Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T vector、切胶回收试剂盒购自宝生物工程技术服务公司,细菌生化微量鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司。抗菌药物药敏纸片(20种)购自杭州微生物试剂有限公司。

1.3 实验动物

16只健康昆明小鼠购自吉林大学实验动物中心,体重30 g±5 g。

1.4 细菌的分离培养

在超净工作台里无菌分离病原菌,分别接种于麦康凯琼脂培养基和TSA固体培养基(含5%胎牛血清)上,置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,观察细菌生长状态及菌落形态。

1.5 涂片镜检

用接种环挑取上述培养得到的单个菌落进行革兰染色,随后镜检。

1.6 动物致病性试验

挑取TSA固体培养基(含5%胎牛血清)上纯培养物的单个菌落,接种于TSB液体培养基(含5%的胎牛血清),37 ℃摇菌18~24 h。取5 mL菌液12 000 r·min-1离心10 min,弃上清,所得沉淀中加入生理盐水稀释至原有菌液浓度。将所得菌液分别接种8只健康试验小鼠,腹腔注射菌悬浮液0.2 mL·只-1。选用8只健康小鼠腹腔注射0.2 mL TSB液体培养基(含5%的胎牛血清),作为阴性对照。观察死亡情况,剖检死亡小鼠,观察病变,采集病变组织并进行细菌分离培养。

1.7 生化试验

将纯化后的细菌培养物分别进行葡萄糖氧化、苹果酸、甘露醇等19类生理生化试验。试验结果参照《伯杰氏细菌鉴定手册》进行比对。

1.8 分离菌株16S rRNA基因序列测定及建立系统进化树

取1.6 mL培养菌液12 000 r·min-1离心10 min,收集菌体,按照Ezup柱式细菌基因组DNA提取试剂盒(购自生工生物工程股份有限公司)提取DNA,提取到的基因组作为16S rRNA基因PCR扩增模板。根据GenBank数据库查询,选用通用16S rRNA引物,由生工生物工程(上海)有限公司合成。

上游引物:5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′;下游引物:5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′。反应体系:DNA模板0.5 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTP 2.0 μL,Ex Taq 0.2 μL,上下游引物各1 μL,dd水补充至25 μL。

取2.5 μL PCR扩增产物与0.4 μL 6×Loading Buffer(购自生工生物工程公司)混合后经1%琼脂糖凝胶电泳检测。随后将得到的PCR产物切胶回收,连接,转化,提取质粒,将纯化质粒送往生工生物工程(上海)技术服务有限公司进行核苷酸序列测定。

将16S rRNA测序结果与GenBank数据库中已知的相关核酸序列进行Blast分析比对,并采用MEGA 5.05软件构建系统进化树。

1.9 药敏试验

用药物药敏纸片盒中的药敏片,分别为氨苄西林、苯唑西林、丁胺卡那、多黏菌素B、多西环素、呋喃唑酮、复方新诺明、红霉素、环丙沙星、克林霉素、氯霉素、诺氟沙星、庆大霉素、青霉素、氨苄西林、四环素、头孢拉定、万古霉素、新霉素、氧氟沙星。按照K-B纸片扩散法测定其抑菌圈大小。结果参照美国临床和实验室标准协会的标准[5],判定其耐药情况。

1.10 耐药基因检测

采用常规PCR法检测三种耐药基因,耐药基因引物及参考文献见表 1。反应体系:DNA模板4 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTP 2.0 μL,Ex Taq 0.3 μL,上下游引物各1 μL,双蒸水补充至25 μL。按照各引物对应退火温度进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

表 1 耐药基因PCR引物序列及终产物长度 Table 1 Primer sequence and final product length of PCR gene
2 结果 2.1 细菌的分离培养特点

在麦康凯琼脂培养基上生长缓慢,在TSA固体培养基(含5%胎牛血清)上生长出淡灰色、圆形、光滑、隆起且边缘整齐的菌落。

2.2 涂片镜检菌体形状

油镜下观察为革兰阴性,杆状,两端光滑的菌体形状(图 1)。

图 1 革兰染色镜检结果(1 000×) Figure 1 Gram staining results(1 000×)
2.3 小鼠致病性试验

试验组8只小鼠在接种该病原菌12 h内发病,主要表现为精神萎靡,食欲下降,体温升高,呼吸困难,咳嗽,皮肤、黏膜潮红;24 h后接连出现死亡,共死亡6只,72 h后两只小鼠情况开始转归,死亡率75%。对照组无任何异常。剖检试验组死亡小鼠,肠壁出现纤维素样渗出,同时可见大量内脏出现针尖状出血点,以脾、肾最为严重;肺出现淤血性坏死。用无菌棉签沾取纤维素样渗出物,进行实验室分离培养,通过镜检及分子生物学鉴定,确定与原分离菌株一致。

2.4 生化试验

记录生理生化试验结果,并参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及已经发表过的报道进行比对,其生理生化特性与污蝇杆菌的生理生化特性基本一致(表 2),初步确定为污蝇杆菌,命名为NY2株。

表 2 菌株NY2生理生化特性 Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain NY2
2.5 16S rRNA基因扩增情况

以提取到的DNA为模板,利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增,结果如图 2所示,得到的条带大小约为1 500 bp,与预期结果大小相符,证明扩增成功。将测得序列上传至GenBank,获得基因登录号为MF037998.1。同时比较可得与登录号EU484335.1的污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica)序列相似度为99%,证明该分离菌株为污蝇杆菌。

M. DNA相对分子质量标准;1、2. NY2 16S rRNA的PCR产物 M. DL2000 DNA marker; 1, 2. PCR-amplified 16S rRNA gene from strain NY2 图 2 16S rRNA扩增结果 Figure 2 16S rRNA amplification results
2.6 系统进化树的构建

扩增产物的核苷酸序列大小为1 448 bp,测序结果在GenBank数据库中进行Blast分析比对并与污蝇杆菌的已登记菌株建立进化树(图 3)。结果显示,该分离菌株与污蝇杆菌(登录号EU484335.1) 同在一个分支,序列相似度为99%,同时与污蝇杆菌(登录号AM401582.1) 亲缘性很近,表明该分离菌株为污蝇杆菌。

图 3 NY2株与相关菌株的系统发育树 Figure 3 Phylogenetic tree constructed by NY2 strain and other Wohlfahrtiimonas chitiniclastica strains
2.7 药敏试验

根据K-B纸片扩散法的原理及美国临床和实验室标准协会的规定,使用直尺对各抗生素产生抑菌环大小进行测量,判断其耐药或敏感。结果显示分离到的污蝇杆菌对氨苄西林、苯唑西林、丁胺卡那、多黏菌素B、多西环素、呋喃唑酮、复方新诺明、环丙沙星、克林霉素、氯霉素、诺氟沙星、庆大霉素、氨苄西林、四环素、万古霉素、新霉素和氧氟沙星敏感。对红霉素、青霉素和头孢拉定三种抗生素耐药。

2.8 耐药基因的检测

分别对β-内酰胺类、四环素类和大环内酯类三类抗生素的耐药基因进行检测,共计8种基因皆为阴性,见表 3

表 3 四种抗生素耐药基因扩增结果 Table 3 Amplification results of four antibiotic resistance genes
3 讨论

污蝇杆菌是由匈牙利E. M. Tóth等于2008年在黑须污蝇第三期幼虫肠道中分离得到;2009年在法国有一例女流浪者污蝇杆菌感染的病例;2011年美国一名流浪汉患重症脓毒血症,从中也分离得到了污蝇杆菌;2014年,美国一头野生鹿发生了继发感染细菌性败血症,从病灶中分离得到了污蝇杆菌;2015年[10]也有关于污蝇杆菌引起河豚心内膜炎的报道;我国于2016年首次报道了牛感染污蝇杆菌引起蹄冠炎,笔者于2016年10月从吉林省某患眼睑炎的牛病灶内分离得到了一株污蝇杆菌,这也表明这种新出现的人畜共患病原菌已经在我国东北部地区出现零星散发的趋势。由于这种病原菌的主要传播媒介是蚊蝇等昆虫,这也就提醒各养殖人员应做好平时驱虫灭蝇,加强圈舍消毒工作,为牲畜营造一个健康卫生的生存环境。

2016年我国山东农业大学研究人员分离得到的污蝇杆菌,其药物敏感性测定结果显示对所有测定的抗生素皆敏感,而笔者分离得到的污蝇杆菌对红霉素、青霉素和头孢拉定三种抗生素耐药。这说明饲养人员在病畜患病期间如果不合理使用抗生素,非但不能起到很好的治疗效果,同时可能诱发细菌耐药性的产生,对细菌性感染的治疗造成进一步的威胁。据报道竹鼠源的弗氏柠檬酸杆菌分离菌株对青霉素、头孢唑啉、氟苯尼考、林可霉素、强力霉素等有耐药性[11]。关于耐药机制的研究已进入基因水平[12-13]。但此次分离菌株耐药基因结果皆显示阴性,这可能是由于污蝇杆菌作为革兰阴性菌,细胞膜通透性的原因,对β-内酰胺类产生耐药性[14]。这也提醒养殖人员在病畜患病时应合理使用抗生素,尽早使患病动物恢复健康。

对于细菌病的防治,最重要的是改善饲养管理,严格实行兽医卫生监督,提高动物机体自身的免疫机能,加强圈舍环境卫生,提高饲养员防控意识,完善牛群繁殖过程中的饲养程序,以获取更高的经济价值。

4 结论

于吉林某肉牛场一头眼睑出现化脓病灶的育肥牛分离到一株细菌,通过鉴定确定为污蝇杆菌(Wohlfahrtiimonas chitiniclastica)。分离菌株对小鼠有致病性;对青霉素、头孢拉定、红霉素耐药,但检测β-内酰胺类耐药基因(TEMADCOXA-23、OXA-51)、大环内酯类耐药基因(ermAermX)以及四环素耐药基因(tetKtetW)结果均为阴性。

参考文献
[1] TÓTH E M, SCHUMANN P, BORSODI A K, et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera:Sarcophagidae)[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2008, 58(4): 976–981. DOI: 10.1099/ijs.0.65324-0
[2] REBAUDET S, GENOT S, RENVOISE A, et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman[J]. Emerg Infect Dis, 2009, 15(6): 985–987. DOI: 10.3201/eid1506.080232
[3] 曹晓梅, 陈拓, 祁军, 等. 上海浦东机场口岸媒介新病原菌的分离鉴定[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2013, 36(4): 228–231.
CAO X M, CHEN T, QI J, et al. Isolation of a new vector-borne pathogenic bacteria and molecular identification[J]. Chinese Frontier Health Quarantine, 2013, 36(4): 228–231. (in Chinese)
[4] QI J, GAO Y, WANG G S, et al. Identification of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica isolated from an infected cow with hoof fetlow, China[J]. Infect Genet Evol, 2016, 41: 174–176. DOI: 10.1016/j.meegid.2016.04.008
[5] 彭黎明, 周林涛. 美国临床实验室标准化委员会更名为临床和实验室标准协会[J]. 中华检验医学杂志, 2005, 28(8): 875–876.
PENG L M, ZHOU L T. Nationla committee for clinical laboratory standards was renamed Clinical and Laboratory Standards Institute[J]. Chinese Journal of Laboratory Medicine, 2005, 28(8): 875–876. (in Chinese)
[6] 邢丽丹, 糜祖煌, 徐鑫鑫, 等. 多重耐药鲍曼不动杆菌中β内酰胺酶基因的检测[J]. 中国感染与化疗杂志, 2014, 14(1): 54–57.
XING L D, MI Z H, XU X X, et al. Detection of β-lactamase genes in multidrug-resistant strains of Acinetobater baumannii[J]. Chinese Journal of Infection and Chemotherapy, 2014, 14(1): 54–57. (in Chinese)
[7] BOCHNIARZ M, ADASZEK Ł, DZIEGIEL B, et al. Factors responsible for subclinical mastitis in cows caused by Staphylococcus chromogenes and its susceptibility to antibiotics based on bap, fnbA, eno, mecA, tetK, and ermA genes[J]. J Dairy Sci, 2016, 99(12): 9514–9520. DOI: 10.3168/jds.2016-11723
[8] YAGÜE GUIRAO G, MORA PERIS B, MARTÍNEZ-TOLDOS M C, et al. Implication of ermX genes in macrolide-and telithromycin-resistance in Corynebacterium jeikeium and Corynebacterium amycolatum[J]. Rev Esp Quimioter, 2005, 18(3): 236–242.
[9] AALI R, NIKAEEN M, KHANAHMAD H, et al. Occurrence of tetracycline resistant bacteria and resistance gene (tetW) in hospital and municipal wastewaters[J]. Fresenius Environ Bull, 2014, 23(10A): 2560–2566.
[10] CAMPISI L, MAHOBIA N, CLAYTON J J. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia associated with myiasis, United Kingdom[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21(6): 1068–1069. DOI: 10.3201/eid2106.140007
[11] 唐海波, 陈凤莲, 饶桂波, 等. 竹鼠源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及致病性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(5): 922–929.
TANG H B, CHEN F L, RAO G B, et al. Isolation and identification of Citrobacter freundii from the diseased bamboo rats and analysis of the pathogenicity of the isolate[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(5): 922–929. (in Chinese)
[12] 彭志锋, 高冬生, 刘红英, 等. 鸭源鸡杆菌整合子及其与耐药性的相关性分析[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(8): 1676–1681.
PENG Z F, GAO D S, LIU H Y, et al. Gallibacterium anatis Integron and its correlation with the drug resistance[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(8): 1676–1681. (in Chinese)
[13] 葛琳, 郭大伟, 何方, 等. PmrA-PmrB二元调控系统介导大肠杆菌对黏杆菌素耐药的机制研究[J]. 畜牧兽医学报, 2016, 47(4): 812–819.
GE L, GUO D W, HE F, et al. Resistance mechanism of Escherichia coli to colistin mediated by PmrA-PmrB[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2016, 47(4): 812–819. (in Chinese)
[14] 高春明. 革兰氏阴性杆菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制和防治策略[C]//安徽省第十二次传染病与寄生虫病学术年会论文集. 黄山: 安徽省医学会, 2008: 91-94.
GAO C M.Resistance mechanisms of gram negative bacilli to beta lactam antibiotics and strategies for prevention and treatment[C]//The Twelfth Annual Academic Meeting of Infectious Diseases and Parasitic Diseases of Anhui Province. Huangshan:Anhui Province Medical Association, 2008:91-94. (in Chinese)