2. 左云县畜牧兽医服务中心, 左云 037100
, QIAO Li-ying1, JING Jiong-jie1, PAN Yang-yang1, MA Yuan1, GUO Yun-li2, WEI Qiong2, LIU Wen-zhong1
2. Zuoyun Animal Husbandry and Veterinary Service Center, Zuoyun 037100, China
microRNA (miRNA)是广泛存在于动植物中的一类非编码的单链小分子RNAs，长度一般为21~25个核苷酸[1]。miRNA通过与靶基因mRNA进行完全或不完全的结合，对编码基因的转录后调控起重要作用[2]。它们主要通过与靶基因mRNA的3′非翻译区(3′UTR)结合来抑制靶基因的翻译或降解靶基因[3]。miRNA参与大多数生物过程，如细胞增殖、分化、凋亡以及某些疾病的发生发展过程。因此，通过从miRNA与其靶基因的关系方面入手研究，可为解析二者的功能与机制提供思路。
支链氨基酸(Branched-chain amino acid, BCAA)是动物体内不能合成的，必须从食物中获取的氨基酸，包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸[4]。机体通过对BCAA的分解代谢来维持其稳态水平[5]。大多数氨基酸可以在肝中被有效降解，有些则可以在脂肪或肌肉组织中氧化[6]。肝氧化是通过线粒体脱氢酶和支链α-酮酸脱氢酶复合体(Branched-chain α-ketoacid dehydrogenase complex, BCKDH)催化BCAA分解[7]。BCKDH是催化BCAA分解代谢的一个关键限速酶，由支链α-酮酸脱羧酶(E1)、二氢脂乙酰基转移酶(E2)、二氢脂乙酰脱氢酶(E3) 3个催化元件及BCKD激酶和BCKD磷酸酶2种特殊的调节酶组成[4]。其中，E1由α、β 2个亚基(E1α、E1β)组成，分别称为BCKDHA、BCKDHB。只要其中一种组件发生异常就可使BCKDH复合体功能发生障碍。BCKDH复合体的活性由2种调节酶对BCKDHA 293位点的可逆磷酸化和去磷酸化调控。去磷酸化激活BCKDH，催化BCAA分解；而磷酸化过程则失活BCKDH[4, 8]。缺乏BCKDH导致BCAA及其代谢产物在体内聚集，进而降低丙酮酸和脂肪酸的运输和利用[9]。BCAA浓度的升高可促进糖原合成，严重时可导致高血糖[10]。BCAA代谢异常可使2型糖尿病的发病率增加5倍[11]，因而与胰岛素抵抗密切相关[12]。可见，BCKDHA对于能量代谢至关重要。
BCKDHA由BCKDHA基因编码。人、小鼠和牛等物种该基因的编码序列已在NCBI数据库中公布。已有的研究表明，人BCKDHA基因的低表达会引起BCAA代谢异常，并对神经系统造成一定伤害[13]。在小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化过程中，BCKDHA的表达受能量水平的影响和调控[14]。基因的表达受miRNA的调控已是不争的事实，而且大量的研究已证实miRNA与功能基因之间存在靶标关系。然而，BCKDHA的miRNA调控机制尚未见报道。
本研究旨在对BCKDHA基因的候选miRNA进行预测，并根据在体外培养脂肪细胞中的表达量，在细胞水平上验证二者间的靶标关系，以解析BCKDHA基因及其调节miRNA在脂肪细胞分化中的作用机理。
1 材料与方法 1.1 3T3-L1细胞培养3T3-L1与293T细胞在37 ℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养。所用培养基为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基(山西赛奥生物科技有限公司)。
3T3-L1细胞的分化诱导也在同样环境的培养箱中进行。所用培养基是在上述培养基中加入终浓度分别为5 μg·mL-1、1 μmol·L-1和0.5 mmol·L-1的Insulin、DEX和IBMX储存液。
1.2 miRNA生物信息学预测及靶基因引物设计利用TargetScan[15]、miRanda[16]和DIANA-microT[17]共3个在线软件，预测与BCKDHA基因具有一定靶标关系的miRNAs。其中，在DIANA-microT的高级选项中将评分阈值设为0.6。用Venny2.0.2 [18]在线软件对3个靶基因预测软件得出的结果做韦恩图，进一步聚焦调节BCKDHA的miRNAs。
根据NCBI数据库中小鼠的BCKDHA mRNA序列，利用Primer3 plus软件设计小鼠BCKDHA编码区(Coding sequence, CDS)荧光定量的PCR引物，选用18S rRNA和β-actin基因为内参基因。miRNA的引物采用手动设计，以U6为内参基因。所有引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。引物序列见表 1。
|
表 1 实时荧光定量PCR和载体构建所用引物序列及内参引物序列 Table 1 Primer sequences for qPCR, plasmid constructing and reference genes |
利用Trizol试剂盒(大连TaKaRa有限公司)给出的方法从3T3-L1细胞中提取总RNA，并检测其浓度和纯度。
1.4 miR-194-5p与BCKDHA基因mRNA的表达量检测利用实时荧光定量PCR方法检测miR-194-5p及BCKDHA基因mRNA在3T3-L1细胞分化期间(2、4、6、8、10 d)的表达量。
1.4.1 miR-194-5p表达量的检测根据037A反转录试剂盒PrimeScript® RT reagent kit (Perfect real-time，大连TaKaRa有限公司)的说明书对3T3-L1细胞分化期的RNA样品进行反转录获得cDNA。RT-PCR反应体系:Specific primer (10 μmol·L-1) 0.5 μL，U6 Reverse primer (10 μmol·L-1) 0.5 μL，5×PrimeScript Buffer (for real-time) 2 μL，RNA≤500 ng，计算上样量并加样，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，加水(RNase free dH2O)至总体积为10 μL。反应程序:37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。
将反转录得到的cDNA产物稀释到50 ng·μL-1，用做荧光定量PCR (qPCR)的模板。qPCR反应的总体系为20 μL:SYBR® Premix Ex TaqTM (2×) 10 μL，miRNAs Specific primer (10 μmol·L-1) 0.8 μL，Universal primers (10 μmol·L-1) 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL，cDNA产物2 μL，ddH2O 6 μL。反应程序:(1) 预变性阶段95 ℃ 30 s；(2) PCR反应阶段95 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，共进行45个循环；(3) 熔解曲线分析阶段95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。
1.4.2 BCKDHA mRNA的表达量检测根据047A反转录试剂盒PrimeScript® RT reagent kit with gDNA Eraser (Perfect real-time)(大连TaKaRa有限公司)的说明书对3T3-L1细胞分化期间的RNA样品进行反转录获得cDNA。反转录分为2个反应体系。
体系1:5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，RNA≤1 ng。计算上样量，加RNase free dH2O至总体积为10 μL。PCR反应程序:42 ℃ 2 min，4 ℃保存。
体系2:在体系1反应结束液中加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL，5×PrimeScript Buffer (for real-time) 4 μL，RT Prime mix 1 μL，RNase free dH2O 4 μL。反应程序:37 ℃ 13 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。
将反转录得到的cDNA产物稀释到50 ng·μL-1，用做qPCR的模板。qPCR总体系为20 μL:SYBR® Premix Ex TaqTM (2×) 10 μL，miRNAs Specific primer (10 μmol·L-1) 0.8 μL，Universal primers (10 μmol·L-1) 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ (50×) 0.4 μL，cDNA产物2 μL，ddH2O 6 μL。反应程序:预变性:95 ℃ 30 s；qPCR:95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共45个循环。
1.5 双荧光素酶报告载体的构建根据靶基因预测结果，设计出包含miR-194-5p与BCKDHA结合区域的BCKDHA mRNA 3′ UTR序列引物。在引物中加入Xho Ⅰ和Xba Ⅰ两种限制性内切酶的酶切位点及各自的保护碱基，具体序列见表 1，其中下划线标出的序列为Xho Ⅰ、Xba Ⅰ两个酶切位点，粗体序列为保护碱基。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。以cDNA为模板，利用表 1中BCKDHA基因3′ UTR的引物进行扩增。将得到的产物利用琼脂糖凝胶电泳检测分析，将目的条带与分子量标准进行比对，然后进行胶回收纯化得到目的DNA。利用Xho Ⅰ、Xba Ⅰ内切酶对BCKDHA基因3′ UTR的PCR产物以及pmir-GLO载体进行双酶切。胶回收BCKDHA基因3′ UTR的酶切产物，与pmir-GLO载体的质粒连接、转化。然后，进行菌落的培养和菌液的测序，构建3′ UTR双荧光素酶报告载体pmir-BCKDHA。
1.6 转染及双荧光素酶检测 1.6.1 miR-194-5p mimic单转染接种3T3-L1细胞于6孔板中，待细胞密度达70%~90%时，按照Lipofectamine 3000(北京康为世纪生物科技有限公司)转染试剂说明书进行转染。转染分为试验组和阴性对照组。试验组将miR-194-5p mimic转入细胞中，以超表达miR-194-5p；对照组将miR-194-5p negative control (NC)转入细胞。转染后24 h收集细胞，提取总RNA。利用qPCR检测超表达后miR-194-5p和BCKDHA基因mRNA的表达量，方法同1.4。
1.6.2 载体pmir-BCKDHA与miR-194-5p mimic共转染接种293T细胞在24孔板，待细胞密度达70%~90%时，按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书进行转染。转染分为试验组(miR-194-5p mimic与pmir-BCKDHA载体共转染)和阴性对照组(miR-194-5p NC与pmir-BCKDHA载体共转染)。每组设置4个重复。
1.6.3 双荧光素酶检测对293T细胞转染48 h后，利用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System试剂盒进行双荧光素酶检测。过程为:弃培养基，用PBS (pH 7.4) 清洗3遍。在培养板的每孔中加100 μL细胞裂解缓冲液1×PLB，室温轻摇培养板15 min裂解细胞。每孔取出20 μL裂解好的细胞液加入检测板中，再向检测板的每孔中加入100 μL LAR Ⅱ，在GloMax-96 Microplate Luminometer (Promega)中检测萤火虫荧光素酶活性。然后，每孔中再加入100 μL Stop & Glo® Reagent试剂，检测海肾荧光素酶活性。2次检测，每孔均设3个重复。
1.7 数据分析采用相对定量分析的方法，以18S rRNA、β-actin和U6为内参基因，以2-ΔΔCt法计算基因mRNA和miRNA的相对表达量。用SPSS 17.0软件中的一般线性模型对表达量进行单变量(分化时间)方差分析:
yij=μ+Ti+eij
式中，yij为第i个分化时间miRNA或mRNA的表达量，μ为总体均值，Ti为第i个分化时间(i=1, 2, …, 5)，eij为残差效应。
双荧光素酶检测结果以萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值计算出荧光值。然后利用SPSS 17.0软件中的一般线性模型对荧光值进行方差分析。
2 结果 2.1 预测的靶基因用TargetScan、miRanda和DIANA-microT 3个软件预测出与BCKDHA具有靶标关系的miRNAs分别有96、6和23个。用Venny2.0.2软件对3个结果取交集，如图 1所示。TargetScan与miRanda和DIANA-microT分别共同预测出5和13个miRNAs；miRanda与DIANA-microT共同预测出2个miRNAs；3个软件共同预测的miRNAs为miR-194-5p和miR-124-3p。从DIANA-microT软件的评分来看，miR-194-5p高于miR-124-3p；而且，miR-194-5p种子序列(2~8) 碱基与BCKDHA 3′ UTR第190~196位碱基完全互补，而miR-124-3p只以六聚体匹配。这些结果在理论上说明miR-194-5p与BCKDHA具有靶标关系，即BCKDHA为miR-194-5p的靶基因。
|
图 1 预测的与BCKDHA基因具有靶标关系的miRNAs Figure 1 Predicted miRNAs targeting BCKDHA |
miR-194-5p在3T3-L1细胞分化期的表达如图 2A所示。可见，miR-194-5p在细胞分化第2天的表达量显著高于其后各阶段的表达量(P＜0.05)，第6天的表达量则显著低于第2和第8天的表达量(P＜0.05)。细胞分化第4、8和10天间miR-194-5p的表达量无显著差异(P>0.05)。由此说明，miR-194-5p在细胞分化初期处于高表达状态。
|
不同字母表示差异显著(P＜0.05)。下同 The different letters show significant difference (P < 0.05). The same as below 图 2 miR-194-5p (A)和BCKDHA(B) mRNA在3T3-L1细胞分化期的表达量 Figure 2 Expressions of miR-194-5p (A) and BCKDHA (B) mRNA during differentiation of 3T3-L1 cell |
BCKDHA基因在3T3-L1细胞分化期的表达如图 2B所示。方差分析表明，BCKDHA mRNA在细胞分化各阶段的表达量差异显著(P＜0.05)。总体来说，BCKDHA的表达量随分化时间而增加，分化前期(2~6 d)表达量较低，后期(8~10 d)较高。
比较而言，miR-194-5p与BCKDHA的表达趋势相反。也就是说，miR-194-5p的高表达与BCKDHA的低表达密切相关，即miR-194-5p负调控BCKDHA的表达。
2.3 超表达miR-194-5p后miR-194-5p和BCKDHA mRNA的表达量超表达miR-194-5p后miR-194-5p的表达如图 3所示。转染miR-194-5p mimic的试验组与转染miR-194-5p NC的阴性对照组中miR-194-5p的表达量差异显著(P＜0.05)。试验组中miR-194-5p的表达量为(1.00±0.05)，对照组的表达量为(0.03±0.00)。由此说明，miR-194-5p mimic成功转入了3T3-L1细胞。
|
图 3 3T3-L1细胞转染后miR-194-5p及BCKDHA基因的表达量 Figure 3 The expression of miR-194-5p and BCKDHA after transfecting of 3T3-L1 cell |
转染miR-194-5p mimic的试验组中BCKDHA的表达量(0.60±0.20) 极低；与之相比，阴性对照组中BCKDHA的表达量(6.24±0.57) 显著升高(P＜0.05)，约是试验组的10倍。
从miR-194-5p和BCKDHA两者表达量结合来看，miR-194-5p的超表达导致BCKDHA显著低表达。也就是说，miR-194-5p直接负调控BCKDHA基因的表达。
2.4 miR-194-5p调控BCKDHA基因的机制为了验证BCKDHA与miR-194-5p间的靶标关系，将miR-194-5p mimic+pmir-BCKDHA(试验组)、miR-194-5p NC + pmir-BCKDHA(对照组)2组载体分别转入293T细胞。转染48 h后检测细胞荧光活性的变化，结果见图 4。试验组的荧光活性显著低于对照组(P＜0.05)，说明miR-194-5p与BCKDHA基因3′ UTR靶位点的结合抑制了荧光信号的产生。所以推测，miR-194-5p调控BCKDHA的作用机制是:miR-194-5p的种子区与BCKDHA基因3′ UTR靶位点的完全结合下调BCKDHA表达。
|
图 4 pmir-BCKDHA-3′ UTR分别与miR-194-5p mimic和miR-194-5p NC共转染293T细胞后48 h的荧光表达量 Figure 4 Relative luciferase units after cotransfecting pmir-BCKDHA-3′ UTR with miR-194-5p mimics and miR-194-5p NC into 293T cell, respectively |
关于功能基因的miRNA调节机制研究通常包括理论预测和试验证实2个方面。现有的miRNA靶基因预测软件主要依据参数有种子匹配、保守性、自由能和位点可访性(Site accessibility)，有些软件还包括了靶-位点丰度(Target-site abundance)、机器学习(Machine learning)等[19]。本研究利用了其中的3个软件反向预测调控BCKDHA基因的miRNAs。各软件所得结果不尽相同，这主要与各软件的理论依据或算法特性有关。miRanda是依据miRNA与靶基因3′ UTR的匹配、miRNA和mRNA双链间的热稳定性以及保守性3个方面[20]进行预测。与多数靶基因预测软件不同的是，miRanda可考虑整个miRNA序列的匹配，且在miRNA种子区与3′ UTR匹配中允许出现G:U摆动[19]。由此预测出BCKDHA基因的miRNAs有6个。TargetScan可通过miRNA或基因或物种间广泛保守的、保守的或不太保守的miRNA家族来搜索预测[19]，依据的是种子匹配和保守性[21]。预测出BCKDHA基因的miRNAs有96个，因而敏感性较低。DIANA-microT[22]包括了所有6个方面的依据或特性，而且它可预测3′ UTR和CDS序列上的靶位点[19, 21]。因而预测出BCKDHA的miRNAs较miRanda多。这也提示人们在预测miRNA与基因间的靶标关系时，一定要考虑所用软件的理论依据和算法特性，降低预测的片面性和盲目性。
由于靶基因预测软件的理论依据和算法特性有差异，预测出的miRNAs也不尽相同。3个软件预测出2个共同的miRNAs，即miR-124-3p和miR-194-5p。已有研究表明，过表达miR-124-3p可降低iGluR2和iGluR3的表达，进而抑制胰高血糖素的分泌，促进糖原合成[23]。miR-194可通过调控Sox5抑制脂肪源性干细胞向软骨细胞定向分化[24]。肥胖小鼠中，miR-194表达异常会引起代谢紊乱，因而与血糖和脂肪代谢有关[25]。可见，二者均与能量代谢有关。本试验重点研究了miR-194-5p在前脂肪细胞分化中的功能机制。
体内研究表明，人、牛、小鼠和绵羊4个物种的BCKDHA基因高度同源，而且绵羊BCKDHA 基因高表达于肝、大肠、肺和肌肉中，但脂肪组织中表达量较低[26]。肥胖大鼠脂肪组织中BCKDHA蛋白的表达量也较低[27]。为此，本研究利用体外培养的小鼠3T3-L1前脂肪细胞进行研究，发现细胞分化的第2天，miR-194-5p表达量极高。随后明显下降，而第6天时表达量最低。相似的趋势已有报道[28]。本研究中，BCKDHA的表达量随分化时间而增加。A.Kitsy等[14]同样利用小鼠3T3-L1前脂肪细胞，不仅发现BCKDHA mRNA的表达随细胞分化时间增加，而且BCKDHA蛋白的表达也呈同样趋势。这说明，在分化后期，细胞对能量的需求增加，BCKDHA及其蛋白表达量提高，加快对BCAA的分解以响应大量细胞对能量的需求。
miRNA通常以负调控的方式作用于靶基因[29]。本研究中，miR-194-5p与BCKDHA随细胞分化的表达趋势以及超表达miR-194-5p后的结果均说明，miR-194-5p下调BCKDHA的表达。
大部分miRNAs的靶位点位于3′ UTR，但也可能位于5′ UTR[30]或CDS区[31]。miR-10a通过与RPS 5′ UTR的互作提高了该基因的翻译效率[32]。在牡蛎中，cgi-miR-92d被注释为miR-17-92家庭的一员，靶向调控CgLITAF3的CDS区，抑制其表达[33]。本研究中，miR-194-5p种子序列(2~8) 碱基与BCKDHA 3′ UTR序列中第190~196位碱基完全互补，并负调控BCKDHA的转录，证实miR-194-5p通过与BCKDHA基因3′ UTR结合抑制其表达。
关于microRNA在遗传改良中的应用，已提出了基于miRNA的遗传修饰技术(miRNA-based GM tech)[34]。该技术可以从miRNA和靶基因2个方面进行遗传操作。对于正向调控靶基因的miRNA，对该miRNA进行组成型过表达(Constitutive overexpression)或对其靶基因进行RNA干扰；对于负向调控靶基因的miRNA，对该miRNA进行人工靶mimic处理或对其靶基因进行过表达。在此基础上，结合转基因技术可用于分子育种中。本研究已阐明了miR-194-5p调控BCKDHA基因表达的机制，利用人工靶mimic或对BCKDHA进行过表达再结合转基因技术有望用于动物的遗传改良。
4 结论本研究利用基于不同原理和特性的软件预测出miR-194-5p与BCKDHA基因具有靶标关系。根据前脂肪细胞分化中和超表达miR-194-5p后二者的表达情况，证实了miR-194-5p靶向BCKDHA基因3′ UTR，负调控其表达。
| [1] | ZHOU P, XU W Y, PENG X L, et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs[J]. PLoS One, 2013, 8(7): e68204. DOI: 10.1371/journal.pone.0068204 |
| [2] | LAU N C, LIM L P, WEINSTEIN E G, et al. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans[J]. Science, 2001, 294(5543): 858–862. DOI: 10.1126/science.1065062 |
| [3] | PACZYNSKA P, GRZEMSKI A, SZYDLOWSKI M. Distribution of miRNA genes in the pig genome[J]. BMC Genet, 2015, 16: 6. |
| [4] |
史仍飞, 袁海平. 支链氨基酸代谢与运动[J]. 上海体育学院学报, 2003, 27(5): 65–67.
SHI R F, YUAN H P. Branch chain amino acid metabolism and exercise[J]. Journal of Shanghai Physical Education Institute, 2003, 27(5): 65–67. (in Chinese) |
| [5] | HUANG Y, ZHOU M Y, SUN H P, et al. Branched-chain amino acid metabolism in heart disease:an epiphenomenon or a real culprit?[J]. Cardiovasc Res, 2011, 90(2): 220–223. DOI: 10.1093/cvr/cvr070 |
| [6] | SPARKS L M, XIE H, KOZA R A, et al. A high-fat diet coordinately downregulates genes required for mitochondrial oxidative phosphorylation in skeletal muscle[J]. Diabetes, 2005, 54(7): 1926–1933. DOI: 10.2337/diabetes.54.7.1926 |
| [7] | XU M, NAGASAKI M, OBAYASHI M, et al. Mechanism of activation of branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex by exercise[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 287(3): 752–756. DOI: 10.1006/bbrc.2001.5647 |
| [8] | SHIRAKI M, SHIMOMURA Y, MIWA Y, et al. Activation of hepatic branched-chain α-keto acid dehydrogenase complex by tumor necrosis factor-α in rats[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 328(4): 973–978. DOI: 10.1016/j.bbrc.2005.01.047 |
| [9] | NISHIMURA J, MASAKI T, ARAKAWA M, et al. Isoleucine prevents the accumulation of tissue triglycerides and upregulates the expression of PPARα and uncoupling protein in diet-induced obese mice[J]. J Nutr, 2010, 140(3): 496–500. DOI: 10.3945/jn.109.108977 |
| [10] | BURNS S P, COHEN R D. To:Krebs M, Brehm A, Krssak M, et al. (2003) Direct and indirect effects of amino acids on hepatic glucose metabolism in humans. Diabetologia 46:917-925[J]. Diabetologia, 2004, 47(1): 141. DOI: 10.1007/s00125-003-1254-x |
| [11] | WANG T J, LARSON M G, VASAN R S, et al. Metabolite profiles and the risk of developing diabetes[J]. Nat Med, 2011, 17(4): 448–453. DOI: 10.1038/nm.2307 |
| [12] | TAI E S, TAN M L S, STEVENS R D, et al. Insulin resistance is associated with a metabolic profile of altered protein metabolism in Chinese and Asian-Indian men[J]. Diabetologia, 2010, 53(4): 757–767. DOI: 10.1007/s00125-009-1637-8 |
| [13] | FERNÁNDEZ-GUERRA P, NAVARRETE R, WEISIGER K, et al. Functional characterization of the novel intronic nucleotide change c.288+9C>T within the BCKDHA gene:understanding a variant presentation of maple syrup urine disease[J]. J Inherit Metab Dis, 2010, 33(S3): 191–198. DOI: 10.1007/s10545-010-9077-7 |
| [14] | KITSY A, CARNEY S, VIVAR J C, et al. Effects of leucine supplementation and serum withdrawal on branched-chain amino acid pathway gene and protein expression in mouse adipocytes[J]. PLoS One, 2014, 9(7): e102615. DOI: 10.1371/journal.pone.0102615 |
| [15] | LEWIS B P, BURGE C B, BARTEL D P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J]. Cell, 2005, 120(1): 15–20. DOI: 10.1016/j.cell.2004.12.035 |
| [16] | BETEL D, WILSON M, GABOW A, et al. The microRNA.org resource:targets and expression[J]. Nucleic Acids Res, 2008, 36(S1): D149–D153. |
| [17] | PARASKEVOPOULOU M D, GEORGAKILAS G, KOSTOULAS N, et al. DIANA-microT web server v5.0:service integration into miRNA functional analysis workflows[J]. Nucleic Acids Res, 2013, 41(W1): W169–W173. DOI: 10.1093/nar/gkt393 |
| [18] | LIN G L, CHAI J, YUAN S, et al. VennPainter:a tool for the comparison and identification of candidate genes based on Venn diagrams[J]. PLoS One, 2016, 11(4): e0154315. DOI: 10.1371/journal.pone.0154315 |
| [19] | PETERSON S M, THOMPSON J A, UFKIN M L, et al. Common features of microRNA target prediction tools[J]. Front Genet, 2014, 5: 23. |
| [20] | HUANG Y, ZOU Q, SONG H T, et al. A study of miRNAs targets prediction and experimental validation[J]. Protein Cell, 2010, 1(11): 979–986. DOI: 10.1007/s13238-010-0129-4 |
| [21] |
夏伟, 曹国军, 邵宁生. MicroRNA靶基因的寻找及鉴定方法研究进展[J]. 中国科学C辑:生命科学, 2009, 39(1): 121–128.
XIA W, CAO G J, SHAO N S. Progress in miRNA target prediction and identification[J]. Science in China Series C:Life Sciences, 2009, 39(1): 121–128. (in Chinese) |
| [22] | KIRIAKIDOU M, NELSON P T, KOURANOV A, et al. A combined computational-experimental approach predicts human microRNA targets[J]. Genes Dev, 2004, 18(10): 1165–1178. DOI: 10.1101/gad.1184704 |
| [23] | ZHANG H Y, LIU R, DENG T, et al. The microRNA-124-iGluR2/3 pathway regulates glucagon release from alpha cells[J]. Oncotarget, 2016, 7(17): 24734–24743. DOI: 10.18632/oncotarget.v7i17 |
| [24] | XU J, KANG Y, LIAO W M, et al. miR-194 regulates chondrogenic differentiation of human adipose-derived stem cells by targeting Sox5[J]. PLoS One, 2012, 7(3): e31861. DOI: 10.1371/journal.pone.0031861 |
| [25] | HICKS J A, TRAKOOLJUL N, LIU H C. Discovery of chicken microRNAs associated with lipogenesis and cell proliferation[J]. Physiol Genomics, 2010, 41(2): 185–193. DOI: 10.1152/physiolgenomics.00156.2009 |
| [26] | LIU G Y, GAO S Z. Molecular cloning, sequence identification and tissue expression profile of three novel sheep (Ovis aries) genes-BCKDHA, NAGA and HEXA[J]. Biol Res, 2009, 42(1): 69–77. |
| [27] | SHE P X, VAN HORN C, REID T, et al. Obesity-related elevations in plasma leucine are associated with alterations in enzymes involved in branched-chain amino acid metabolism[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2007, 293(6): E1552–E1563. DOI: 10.1152/ajpendo.00134.2007 |
| [28] | JEONG B C, KANG I H, HWANG Y C, et al. MicroRNA-194 reciprocally stimulates osteogenesis and inhibits adipogenesis via regulating COUP-TFⅡ expression[J]. Cell Death Dis, 2014, 5(11): e1532. DOI: 10.1038/cddis.2014.485 |
| [29] | KHAN A A, BETEL D, MILLER M L, et al. Transfection of small RNAs globally perturbs gene regulation by endogenous microRNAs[J]. Nat Biotechnol, 2009, 27(6): 549–555. |
| [30] | HAFNER M, LANDTHALER M, BURGER L, et al. Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP[J]. Cell, 2010, 141(1): 129–141. DOI: 10.1016/j.cell.2010.03.009 |
| [31] | RECZKO M, MARAGKAKIS M, ALEXIOU P, et al. Functional microRNA targets in protein coding sequences[J]. Bioinformatics, 2012, 28(6): 771–776. DOI: 10.1093/bioinformatics/bts043 |
| [32] | ØROM U A, NIELSEN F C, LUND A H. MicroRNA-10a binds the 5'UTR of ribosomal protein mRNAs and enhances their translation[J]. Mol Cell, 2008, 30(4): 460–471. DOI: 10.1016/j.molcel.2008.05.001 |
| [33] | CHEN H, JIANG S, WANG L, et al. Cgi-miR-92d indirectly regulates TNF expression by targeting CDS region of lipopolysaccharide-induced TNF-α factor 3(CgLITAF3) in oyster Crassostrea gigas[J]. Fish Shellfish Immunol, 2016, 55: 577–584. DOI: 10.1016/j.fsi.2016.06.036 |
| [34] | ZHOU M, LUO H. MicroRNA-mediated gene regulation:potential applications for plant genetic engineering[J]. Plant Mol Biol, 2013, 83(1-2): 59–75. DOI: 10.1007/s11103-013-0089-1 |