2. 黑龙江省动物细胞与遗传工程重点实验室, 哈尔滨 150030;
3. 新疆农垦科学院畜牧兽医研究所, 石河子 832000
2. Key Laboratory of Animal Cellular and Genetic Engineering of Heilongjiang Province, Harbin 150030, China;
3. Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science, Shihezi 832000, China
细胞周期素Y (Cyclin Y, CCNY)又称cyc-Y、cyclin-box carrying protein 1、cyclin box protein 1或cyclin fold protein 1,属于Cyclins家族,是一个新发现的细胞周期蛋白。Cyclins家族成员结构上高度保守[1],目前已知Cyclin Y参与细胞周期[2-4]和神经系统发育[5]的调控。在非洲爪蟾胚胎细胞中,CCNY可通过与周期依赖性蛋白激酶调节因子Cdk14(Eip63E)结合,促进低密度脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6) 磷酸化,从而活化Wnt/β-catenin信号通路,使细胞从G2期进入M期[6]。利用RNA干扰技术干扰CCNY基因的表达可显著降低H1299和95D 2种肺癌细胞的增殖及其在小鼠体内成瘤的效率,并导致肺癌细胞停滞于G1/S期,显著降低肺癌细胞在体内外的增殖[7-8]。在直肠癌的研究中发现,CCNY基因在人直肠癌细胞系中显著高表达,且高表达的CCNY能促进直肠癌瘤细胞的增殖、迁移与侵袭,同时CCNY在直肠癌细胞的黏附、凋亡及肿瘤的免疫等方面也发挥重要的作用[9]。研究还发现,CCNY能促进脑胶质瘤细胞的增殖,抑制CCNY基因的表达可显著抑制脑胶质瘤细胞的生长[10]。基因敲除试验显示,当敲除CCNY基因后,果蝇的胚胎发育、幼虫的发育和变态过程都会出现缺陷[11]。一项德国人群克罗恩疾病(Crohn’s disease)的全基因组关联分析显示,CCNY基因的一个SNP (rs3936503) 与克罗恩疾病具有相关性[12]。
本实验室前期对中国美利奴羊羊毛品质性状的全基因组关联分析(Genome-wide association study, GWAS)发现,绵羊CCNY基因是一个与羊毛品质性状相关的基因,它与羊毛细度显著相关[13]。为了证实这一结果,本研究开展了中国美利奴羊CCNY基因多态性与羊毛性状的关联分析和功能分析。
1 材料与方法 1.1 试验材料CCNY基因多态性检测试验是以744只中国美利奴羊(新疆军垦型)为试验材料,其中包含超细毛品系181只、毛用多胎品系138只、肉用多胎品系134只、A品系152只、B品系103只和U品系36只,各品系个体均为母羊。采集绵羊耳组织,-20 ℃保存,用于基因组提取。组织表达谱分析是选择5只1周岁中国美利奴超细毛绵羊为材料,处死后分别采集胃、小肠、脂肪、睾丸、心、肾、肝、肌肉、胰、脾、皮肤、淋巴结、膀胱、肺和大脑共15种组织,置于液氮中速冻后,-80 ℃冰箱冻存。免疫荧光表达检测分析则是选取3只中国美利奴超细毛绵羊,分别采集新鲜的羊体侧皮肤组织,固定于4%多聚甲醛中。人表皮永生化细胞系(HaCaT)、绵羊胎儿成纤维细胞(Sheep fetal fibroblasts, SFF)、293T细胞、Wnt信号通路报告基因载体TOP-Flash和FOP-Flash均为实验室保存。
1.2 方法 1.2.1 绵羊羊毛性状测定及基因组DNA的提取采集绵羊体侧部羊毛(300根毛样),根据国家纤维检验标准并参考国际毛纺织组织(International Wool Textile Organisation, IWTO)纤维检测标准[14],进行羊毛品质性状测定。采用常规苯酚/氯仿法提取绵羊耳组织基因组DNA[15],-20 ℃保存备用。
1.2.2 绵羊CCNY基因的多态性检测针对CCNY基因的第七内含子进行多态性检测(CCNY-P1引物序列见表 1)。取60只羊的基因组DNA,等量混合,利用特异引物CCNY-P1扩增,PCR产物纯化测序,根据测序所发现的CCNY基因SNP,委托北京毅新兴业公司采用MALDI-TOF-MS (基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)方法对744只绵羊进行基因型鉴定。
利用Trizol试剂提取羊组织或细胞的总RNA,并用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。按照Promega Improm-Ⅱ (Promega, USA)反转录试剂盒说明书,将提取的总RNA反转录为cDNA。利用FastStart Universal SYBR Green Master (Roche, Switzerland)试剂进行real-time PCR,反应体系:FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) 5 μL,cDNA模板1 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL,水3.6 μL,总体积为10 μL。反应条件:95 ℃预变性10 min;95 ℃变性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环。以GAPDH基因为内参,ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH,利用2-ΔCt法将原始Ct值转换为相对基因表达量。绵羊和人细胞CCNY、Ki67、PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)和CyclinD1表达检测引物见表 1。
1.2.4 皮肤组织CCNY免疫荧光分析绵羊皮肤组织经4%多聚甲醛固定、酒精梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡包埋于石蜡中,具体步骤参照文献[16]进行。切片厚度为5 μm。石蜡切片经常规脱蜡水化后利用柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 高压修复10 min,3% H2O2 室温浸泡10 min,5% BSA室温封闭1 h,兔源CCNY多克隆抗体(武汉三鹰,1:50稀释)4 ℃孵育过夜,经PBST清洗后,利用Cy3标记的山羊抗兔IgG (碧云天,1:5 000稀释)室温孵育1 h,再经PBST清洗后,滴加Hoechst 33342染色液避光孵育5 min,最后再经PBST清洗,滴加抗荧光淬灭封片液,在荧光显微镜下观察并进行图像采集。
1.2.5 绵羊CCNY基因真核表达载体的构建和Western blot验证根据绵羊CCNY基因序列(GenBank登录号:XM_004014208.1),设计CCNY基因全长CDS区的扩增引物对CCNY-P2,其中上游引物CCNY-P2-F引入Sal Ⅰ酶切位点,下游引物CCNY-P2-R引入Kpn Ⅰ酶切位点(见表 1下划线处)。以绵羊皮肤组织cDNA为模板,进行PCR扩增,产物纯化回收后与pEASY-T1 simple载体连接。将pEASY-T1 simple-CCNY质粒和pCMV-Myc空载体,分别做Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切,纯化回收后连接,转化感受态细胞,挑取单菌落,提取质粒并进行测序,获得阳性重组质粒pCMV-Myc-CCNY。利用Lipofectamine 2000将构建好的pCMV-Myc-CCNY转染HaCaT细胞,转染72 h之后,收集细胞,参照文献[16]方法进行Western blot检测,Myc标签抗体(碧云天)以1:1 000稀释,HRP标记的山羊抗鼠IgG (碧云天)以1:5 000稀释。
1.2.6 细胞增殖检测将HaCaT和SFF细胞分别接种于24孔培养板上,每孔接种约5×104个。待细胞汇合度达到30%~40%时,利用Lipofectamine 2000分别将pCMV-Myc-CCNY和pCMV-Myc转染细胞,转染6 h之后换液。利用CCK-8试剂盒(日本同仁研究所)分别检测转染0、24、48、72、96 h时的细胞吸光值。
1.2.7 绵羊CCNY基因对Wnt/β-catenin信号通路影响的检测将293T细胞接种于24孔培养板上,每孔细胞数约5×104个,待细胞汇合度达到60%~70%时,利用Lipofectamine 2000将pCMV-Myc-CCNY和pCMV-Myc分别与TOP/flash、FOP/flash和内参海肾荧光素酶质粒共转染293T细胞。转染48 h后,参照Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)说明书,检测双荧光素酶报告基因活性。Wnt/β-catenin信号通路活性以TOP/FOP比值表示,其中,转染有TOP/flash和海肾荧光素酶质粒的萤火虫荧光值为F (TOP),海肾荧光值为R (TOP);转染有FOP/flash和海肾荧光素酶质粒的萤火虫荧光值为F (FOP),海肾荧光值为R (FOP)[17]。Wnt/β-catenin信号通路活性:
$\frac{\text{TOP}}{\text{FOP}}\text{=}\frac{\text{F }\left( \text{TOP} \right)\text{/R }\left( \text{TOP} \right)}{\text{F }\left( \text{FOP} \right)\text{/R }\left( \text{FOP} \right)}\text{ }$ |
利用SPSS19软件统计CCNY基因SNPs的最小等位基因频率、基因型频率和杂合度,卡方检验进行哈德-温伯格平衡(Hardy-Weinberg)检测。利用Haploview 4.2软件进行连锁不平衡分析及标签SNP (Haplotypetag SNP, htSNP)分析。利用SAS 9.1.3软件的Genetics过程构建单倍型。
根据中国美利奴羊试验群体的特点构建线性模型:Y=μ+G+L+A+G*L+G*A+A*L+e。其中,Y为性状的观测值,μ为群体均值,G为基因型效应(计算单倍型时为单倍型效应),L为品系效应,A为年龄效应,G*L为基因型与品系的互作效应,G*A为基因型与年龄的互作效应,A*L为年龄和品系的互作效应,e为剩余值效应。关联分析检验利用JMP 4.0统计软件进行,并估计最小二乘均值;显著水平为P<0.05,极显著水平为P<0.01。
2 结果 2.1 绵羊CCNY基因的多态性分析利用特异引物对CCNY-P1扩增绵羊混合基因组DNA,获得与预期大小(1 810 bp)相一致的扩增片段(图略)。PCR产物测序分析显示,PCR扩增区域位于CCNY基因第七内含子。根据测序峰图(图略)结果,共发现3个SNPs位点,分别命名为CCNYSNP1、CCNYSNP2和CCNYSNP3。这3个SNPs均存在于NCBI的SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)中,参考SNP分别为rs613860955、rs622396422和rs611417387(表 2)。
多态性分析结果显示,每个SNP在中国美利奴羊6个品系中都检测到了3种基因型,每个SNP在6个品系中的基因型个数、等位基因频率和基因型频率见表 3。3个SNPs的最小等位基因频率(MAF)范围从37.28%到49.30%(表 4),其中仅CCNYSNP1的位点杂合度小于0.5(表 4)。卡方检测显示,3个SNPs都符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05,表 4)。
由Haploview中的LD Plot分析可知,CCNY基因的这3个SNPs处于强连锁状态,位于一个单倍型模块中(D’>0.85,图 1)。Tagger SNP分析结果显示,CCNYSNP2与CCNYSNP3之间的r2>0.8(r2=0.997),故CCNYSNP2可以代替CCNYSNP2和CCNYSNP3的效应。
将这3个SNPs分型结果与羊毛品质性状进行关联分析,结果显示,CCNYSNP1对羊毛细度和细度标准差有极显著影响(P<0.01,表 5);CCNYSNP2和CCNYSNP3对绵羊羊毛细度有显著影响(P<0.05,表 5)。根据这3个SNPs的LD分析结果,构建CCNY基因单倍型,共得到8种单倍型,将频率小于0.01的单倍型去除,得到3种主要单倍型:CTT、ACA和CCA。用JMP 4.0软件进行单倍型与羊毛品质性状的相关分析,结果表明,单倍型对羊毛细度和细度标准差有极显著影响(P<0.01,表 5)。
对试验群体中3个SNPs的不同基因型个体间的羊毛细度和细度标准差性状分别作进一步多重比较分析,结果表明,CCNYSNP1的AA基因型个体的羊毛细度显著低于CC和CA基因型个体(P<0.05,表 6);就羊毛细度标准差来看,CC基因型个体的羊毛细度标准差显著高于AA型和CA型个体(P<0.05,表 6),而AA与CA基因型个体间没有显著差异。CCNYSNP2的CC基因型个体的羊毛细度显著低于TC和TT基因型个体(P<0.05,表 6),TC和TT型个体间无显著差异。CCNYSNP3的AA基因型个体的羊毛细度显著低于TA和TT基因型个体(P<0.05,表 6),TA和TT型个体间也无显著差异。不同单倍型个体的羊毛细度间和细度标准差之间也都存在显著差异,其中,ACA单倍型个体的羊毛细度和细度标准差均显著低于CTT和CCA个体(P<0.05,表 6)。
为了进一步证实CCNY基因对羊毛品质性状的影响并揭示其可能的作用机制,利用real-time RT-PCR技术检测了CCNY基因在中国美利奴羊超细毛品系多个组织中的表达情况。结果表明,CCNY基因在绵羊的15种组织中都存在着不同程度的表达,其中,在睾丸和肺中高表达,在皮肤、胃、脂肪、肾、淋巴结、膀胱和大脑呈中等程度表达,而在小肠、心、肝、肌肉、胰和脾中呈低表达(图 2A)。羊皮肤组织的CCNY免疫荧光分析显示,CCNY在毛囊内根鞘和毛母质中有较高的表达(图 2B和C)。
由于毛囊内根鞘和毛母质细胞具有有较高的增殖能力,因此上述免疫荧光检测结果提示,CCNY可能参与细胞的增殖。为证明这一猜测,笔者构建了绵羊CCNY真核表达载体。Western blot结果显示,在转染pCMV-Myc-CCNY的HaCaT细胞中检测到一个约36 ku的特异性蛋白,这与预期一致(图 3A),表明已经成功构建了CCNY的过表达载体。将质粒pCMV-Myc-CCNY分别转染HaCaT和SFF细胞,以pCMV-Myc空载体作为阴性对照,利用CCK-8方法检测过表达CCNY基因对细胞增殖的影响。结果显示,HaCaT细胞中,在转染72和96 h后,CCNY过表达组细胞的吸光度值(OD)极显著高于对照组(P <0.01,图 3B),同样,在转染72和96 h后,SFF细胞中CCNY过表达组细胞的吸光度值(OD)显著高于对照组(P<0.05,图 3C)。这些结果表明绵羊CCNY基因促进细胞增殖。
与细胞增殖结果一致,细胞增殖标志基因的表达分析显示,在HaCaT细胞中,CCNY基因过表达组Cyclin D1基因的mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05,图 4),CCNY基因过表达组Ki67和PCNA基因的mRNA表达水平极显著高于对照组(P<0.01,图 4);在SFF细胞中,与对照组相比,CCNY基因过表达组Cyclin D1、PCNA和Ki67基因的mRNA表达水平均极显著升高(P<0.01,图 4)。
目前已知CCNY通过影响Wnt信号通路活性调控细胞周期和细胞增殖[6]。为了确认绵羊CCNY基因是否影响Wnt/β-catenin信号通路的活性,本研究将羊CCNY基因的真核表达载体分别与Wnt/β-catenin信号通路的报告基因载体TOP-Flash和FOP-Flash共转染293T细胞,检测CCNY对Wnt/β-catenin信号通路活性的影响。Wnt/β-catenin信号通路活性以TOP/FOP比值表示。结果显示,与对照组相比,在293T细胞中过表达CCNY基因可以极显著提升Wnt/β-catenin信号通路的活性(P <0.01,图 5)。
本课题组前期的GWAS分析显示,CCNY基因与中国美利奴羊的羊毛细度显著相关[13]。本研究共鉴定出绵羊CCNY基因的3个SNPs位点,关联分析发现,这3个SNPs及其单倍型都与中国美利奴羊羊毛细度和细度标准差呈显著相关(表 5),证实CCNY基因确实是一个影响羊毛品质性状的重要基因,提示,CCNY基因可能在毛囊发育和羊毛品质性状形成中发挥重要作用。
中国美利奴细毛羊培育始于1972年,由于选育目标不同,目前已培育出A品系、B品系、毛用多胎品系、肉用多胎品系、超细毛品系以及U品系共6个品系[18]。这些中国美利奴羊品系虽然都是细毛羊,但是它们的遗传背景和羊毛品质性状并不完全相同,因此,这些中国美利奴羊品系是筛选和鉴定羊毛品质性状关键基因和分子标记的理想遗传材料[19]。本研究利用这6个中国美利奴羊品系,发现CCNY基因的3个SNPs都与羊毛细度显著相关,基因型频率分析显示,CCNY基因的这3个SNPs在超细毛品系羊的等位基因频率均与其他5个品系明显不同(表 3)。我们将超细毛品系中低频等位基因定义为a、高频等位基因定义为b。3个SNPs在超细毛品系中均以b等位基因为优势基因,而在其它5个品系中均以a等位基因为优势等位基因(表 3)。与其他5个品系相比,超细毛品系绵羊的羊毛具有更优良的品质性状[19]。在超细毛品系中b等位基因频率高于a等位基因频率,这可能是长期人工选育导致了b等位基因的富集。目前已有研究报道,一些位于内含子区的SNPs是功能性SNP[20-24]。本研究发现的这3个CCNY基因内含子SNPs都与中国美利奴羊的羊毛细度显著相关,推测这3个SNPs中可能存在功能性SNP,该功能性SNP通过影响毛囊CCNY基因的表达,从而导致羊毛品质性状的差异。但还有一种可能性,是这3个SNPs可能与影响羊毛性状的关键基因或者致因性SNPs呈强连锁。
单点SNP与羊毛品质性状的多重比较结果显示,CCNYSNP1的AA基因型个体、CCNYSNP2的CC基因型个体和CCNYSNP3的AA基因型个体的羊毛细度显著低于其他基因型个体(表 6)。因此,推测,这3个SNPs构建的ACA单倍型个体拥有最小的羊毛细度表型值。单倍型与羊毛品质性状的多重比较结果与我们的预期一致,ACA单倍型个体的羊毛细度显著低于其他单倍型个体(表 6)。CCNY基因3个SNPs构建的ACA单倍型有望作为细毛羊育种的分子辅助选择标记,但未来需要在更大的群体和不同群体中加以验证。
组织表达谱分析显示,CCNY基因在绵羊皮肤中呈中等程度的表达,进一步的免疫荧光分析显示,CCNY定位于毛囊的内根鞘和毛母质细胞。内根鞘和毛母质由具有增殖潜能的细胞构成[25]。CCNY在高增殖细胞中的定位提示,绵羊CCNY基因可能会促进毛囊细胞的增殖。与此推测相一致,细胞增殖检测分析证实,过表达绵羊CCNY基因可以促进HaCaT细胞和SFF细胞的增殖(图 3)。癌症研究证实,CCNY可以促进神经胶质瘤细胞和肺癌细胞的增殖,这与笔者的细胞增殖检测结果一致[7-8, 10]。
毛囊由上皮细胞和真皮细胞构成[26-27],二者通过持续而复杂的相互作用调控毛囊的形态发生和毛囊周期[28]。Wnt/β-catenin信号通路是毛囊发育的重要信号通路[29]。和野生型小鼠相比,皮肤特异性敲除APC基因(Adenomatous polyposis coil,细胞内Wnt/β-catenin信号通路的抑制基因)的小鼠表现出毛囊数目增加[30]。小鼠皮内注射腺病毒介导的wnt 10b基因过表达之后,可以诱导注射部位附近的毛囊从静止期进入到生长期[31]。β-catenin敲除小鼠的毛囊无法进入毛发生长周期从而抑制了毛发的生长[32]。有文献已报道,CCNY可以激活Wnt/β-catenin信号通路,促进细胞增殖[6]。与此报道一致,本研究的Wnt/β-catenin信号通路报告基因分析结果显示,绵羊CCNY基因可以增强Wnt/β-catenin信号通路的活性(图 5)。毛发是毛囊的产物,毛囊决定毛发的表型[33],笔者推测绵羊CCNY基因通过Wnt/β-catenin信号通路调控毛囊的形态发生和毛囊的生长发育,从而影响羊毛的品质性状。
4 结论本研究发现,绵羊CCNY基因第七内含子区存在3个SNPs,关联分析显示,这3个SNPs与羊毛细度呈显著相关。CCNY基因过表达能促进细胞增殖,增强Wnt/β-catenin信号通路活性,这些结果提示,CCNY是控制羊毛品质性状(羊毛细度)的一个重要基因。
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