2002年，美国遗传治疗公司(Genetic Therapy Inc.)的科研人员在利用人胚胎视网膜细胞(PER.C6) 培养腺病毒过程中发现存在未知病原体污染[1]。经病原分离与鉴定得知该病原体具有微RNA病毒科(Picornaviridae)家族成员的形态特征和分子结构[1]；系统进化分析表明，该病原与心病毒属(Cardiovirus)相关病毒的亲缘关系较近，但两者也存在许多不同之处(如IRES类型、2A蛋白长度等)。据此，将该病原划归微RNA病毒科的一个新属，并以其为原型毒株命名为“塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)”[1]。随后研究发现，SVV具有溶瘤特性而被应用于人类癌症的治疗[2-4]。2015年，国际病毒分类委员会(ICTV)将SVV更名为“A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)”，其所在的属命名为“塞内卡病毒属(Senecavirus)”[5]。尽管早期的SVA分离株对猪无明显的致病性[2-3]，但近年来越来越多的研究表明，SVA与猪原发性水疱病(PIVD)和新生仔猪死亡率升高密切相关[6]。尤其2014年以来，巴西、美国等国家猪群暴发水疱疫情[7-8]，SVA对养猪业的危害才逐渐引起人们的广泛关注。
1 病原学 1.1 分类SVA归属微RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)，与心病毒属(Cardiovirus)成员的亲缘关系相对较近[1, 9]，如脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)和泰勒病毒(Theilovirus)。
1.2 形态与结构SVA病毒粒子呈二十面体结构，无囊膜，直径为25~30 nm[9]。基因组为单股正链RNA，全长7.3 kb左右，由5′端非编码区(5′ UTR)、一个编码多聚蛋白的开放阅读框(ORF)和3′端非编码区(3′ UTR)组成。其中，5′ UTR包含基因组连接蛋白(VPg)序列和Ⅳ型内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES)，3′ UTR下游含有一个poly (A)尾巴(图 1)。SVA基因组只有一个ORF，具有微RNA病毒科病毒基因组的共同特点，即呈L-4-3-4分布(图 1) [1, 9]。虽然SVA的5′ UTR没有“帽”结构，但其内部却存在poly (C)结构和IRES。IRES是存在于5′ UTR与起始密码子AUG之间的一个调控内部翻译起始的顺式作用元件，它可以有效地引导核糖体进入病毒途径起始mRNA翻译而非细胞途径[10]。在IRES的引导下，核糖体将SVA唯一的ORF翻译成“多聚蛋白”，然后在病毒编码的特定蛋白酶的作用下，多聚蛋白首先被裂解成先导蛋白(L)和P1、P2、P3三个蛋白中间体，P1又进一步裂解成1A、1B、1C和1D (分别对应于VP4、VP2、VP3和VP1) 四种结构蛋白，而P2裂解成2A、2B和2C三种非结构蛋白，P3则裂解成3A、3B、3C和3D四种非结构蛋白(图 1)。其中，2A蛋白的C端存在微RNA病毒科病毒的保守基序NPG↓P，3B蛋白(即VPg蛋白)充当病毒RNA合成的引物，3D蛋白组成RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，参与病毒复制[1, 9, 11]。
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A. A型塞内卡病毒基因组结构；B.病毒粒子平面结构(http://viralzone.expasy.org/697?outline=all_by_species)；C.病毒粒子三维结构[11] A. Genomic structure of SVA; B. Planar structure of SVA (http://viralzone.expasy.org/697?outline=all_by_species); C. Three-dimensional structure of SVA[11] 图 1 A型塞内卡病毒基因组与病毒粒子结构 Figure 1 Structure schematic diagrams of the genome and virion of Senecavirus A |
SVA衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构蛋白组成，其中VP1和VP3是主要的抗原表位区域，而VP1蛋白的抗原性强、相对保守[6]，并且可以刺激机体产生中和抗体，为塞内卡病毒病的诊断提供了重要保障[6, 12-14]。有研究表明，VP1和VP2蛋白与SVA的细胞嗜性有关，VP2和VP4蛋白的某些区域参与病毒核酸的包装[11]。SVA的非结构蛋白与基因组复制紧密相关，参与形成病毒的复制复合物[1]。
1.4 培养特性SVA在人胚胎视网膜细胞(PER.C6)、人肺癌细胞(NCI-H1299) 等癌细胞系，以及猪睾丸细胞(ST)、猪肾细胞(PK-15、SK)和幼龄仓鼠肾细胞(BHK-21) 等细胞系上生长良好[1, 15-18]，能够产生明显的细胞病变，可以利用上述细胞对SVA进行分离与培养。
1.5 理化特性鉴于SVA与口蹄疫病毒(FMDV)均属于微RNA病毒科，推测两者应具有相似的理化特性，可以采用相同的消毒剂(次氯酸钠、氢氧化钠、碳酸钠、0.2%柠檬酸等)和消毒方法对SVA污染的猪舍、环境、运输工具等进行消毒。近来有研究表明，过氧化氢可以有效杀灭SVA、FMDV和猪水疱病病毒(SVDV)[19]；次氯酸盐类消毒剂(5.25%次氯酸钠)可以有效杀灭铝、不锈钢、橡胶、水泥和塑料表面污染的SVA，其杀毒效果明显优于季铵盐类消毒剂(26%烷基二甲基苄基氯化铵和7%戊二醛)和酚类消毒剂(12%邻苯基苯酚、10%邻苯基对氯苯酚和4%对叔戊基苯酚)[20]。
2 流行病学 2.1 传染源处于病毒血症期的感染猪是主要传染源，包括患病猪和隐性感染猪。病猪口、鼻、舌和蹄冠等部位的水疱病灶中含有大量病毒[8]。近来，有研究从美国明尼苏达州和巴西圣卡塔琳娜州某些患病猪的水疱、病变组织、环境样本、老鼠粪便及鼠小肠中检测并分离到了SVA[21]。值得关注的是，在感染猪场和无水疱病史的猪场采集到的苍蝇中均检测到了SVA核酸[21]。从老鼠和苍蝇样本中检出SVA核酸，并从老鼠粪便和小肠样本中成功分离到了SVA活病毒，表明这些生物在SVA的流行病学中发挥一定的作用。
2.2 传播途径与SVA同病毒科的多数病毒既可以直接接触传播，也可以间接接触传播(如污染的饲料、饮水和器具等)，FMDV还可以通过气溶胶传播。虽然目前尚不清楚SVA是否也可以通过上述方式传播，但人工感染试验证实，鼻内接种SVA可以使健康猪发病[16, 22]。
2.3 易感动物SVA主要感染猪，不同性别、年龄阶段的猪(断奶前仔猪、保育猪和育肥猪等)均易感[8, 23-24]。国外有研究发现，猪、牛和鼠的血清中存在SVA中和抗体，揭示这些物种可能是SVA的自然宿主[25]。值得关注的是，通过对60份健康人血清的检测发现1份SVA中和抗体阳性血清(中和效价1:8)，表明人类也可能是SVA的自然宿主[25]。
2.4 流行特征本病发生无明显的季节性，但春秋两季发病率偏高[26]。
2.5 发生与分布自20世纪80年代起，澳大利亚、新西兰、意大利、加拿大和美国等国家的猪群经常发生病因不明的PIVD，且多数情况下排除了FMDV、SVDV和水疱性口炎病毒(VSV)感染的可能，但具体病因当时并未确诊[9, 27-28]。2002年，L. M. Hales等成功分离与鉴定了SVA的原型毒株SVV-001，并将其归类于微RNA病毒科塞内卡病毒属[1]。2006年，N. J. Knowles等分析了12株从美国不同州具有水疱症状的猪体内分离到的微RNA病毒样(Picorna-like)病毒，借助中和试验、RT-PCR检测发现这些毒株与SVV-001具有相同的抗原性，提示SVA感染可能导致猪发病[25]。由于该项研究仅对病毒的VP1、2C和3′ UTR基因进行了测序与分析，却并未进行全基因组测序，因此这12株病毒是否均为SVA，抑或是心病毒属的新成员尚有待于进一步证实。2007年6月，美国明尼苏达州某屠宰场的部分猪出现跛行症状、口鼻和蹄冠部出现水疱和溃疡，经RT-PCR检测证实猪发生了SVA感染。追溯性调查发现，病猪来源于加拿大Manitoba省的7个养猪场[27]。自2007年以来，加拿大、美国零星发生的PIVD逐渐被证实与SVA感染有关[27-28]。2014年11月以来，巴西暴发与SVA有关的PIVD，造成30%~70%新生仔猪急性死亡[8, 24]。几乎同一时期，美国十几个州的猪群确诊暴发SVA感染，导致严重的新生仔猪发病和死亡，给养猪业造成了较大的经济损失[14, 23, 29]。2015年夏季，我国广东省某些猪场首次被证实暴发SVA疫情，病猪出现水疱症状、新生仔猪大量死亡[30-31]。2016年3月，湖北省某养猪场也被确诊发生SVA感染[18]。
3 临床症状与病理变化早期的SVA分离株对猪无明显的致病性，感染猪不出现临床症状[17, 25]。近年来，越来越多的SVA分离株可以导致猪发病，成年猪感染初期出现厌食、嗜睡和发热等症状，随后鼻镜部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位的皮肤、黏膜产生水疱，继而发生继发性溃疡和破溃现象，严重时蹄冠部的溃疡可以蔓延至蹄底部，造成蹄壳松动甚至脱落(图 2)，病猪出现跛行现象。新生仔猪(7日龄以内)死亡率显著增加(高达30%~70%)，偶尔伴有腹泻症状[8, 16, 22-24]。
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A.猪鼻背侧出现水疱[9]；B.猪鼻前端的水疱破裂后形成皮肤溃疡[9]；C.猪后蹄冠状带周围形成水疱[27]；D.猪后蹄冠状带周围水疱破裂后形成溃疡和结痂[9]；E.猪蹄趾间水疱破裂后形成溃疡和糜烂[22]；F.足底垫上的水疱破裂后形成溃疡[31] A. A large vesicle on the dorsal aspect of the snout [9]; B. Ulcerated skin on the tip of snout after rupture of a vesicle[9]; C. Vesicles along the coronary band of hind limbs[27]; D. Ulceration and crusting of coronary bands on both hind limbs [9]; E. A ruptured vesicle with ulceration and erosion in interdigital space [22]; F. Formed ulceration on the plantar foot pad after rupture of a vesicle[31] 图 2 A型塞内卡病毒感染猪的临床症状 Figure 2 The clinical symptoms of Senecavirus A-infected pigs |
截至目前，SVA感染猪的特异性病理变化尚不清楚。Q. Wu等[31]通过剖检具有水疱症状的母猪发现，下颌和腹股沟淋巴结水肿、出血，肺气肿和小叶性肺炎，心脏充血、出血，肝和肾表面有白斑；组织病理学检查进一步发现，大脑中病变的神经细胞周围出现“卫星现象”和“噬神经现象”，肺气肿，心肌充血、出血，局灶性肝细胞坏死，肾局灶性淋巴细胞浸润和单核细胞浸润，小肠黏膜严重坏死和脱落，小肠黏膜、单核细胞和浆细胞中出现淋巴细胞浸润，肝小叶和肾间质中也存在局灶性的淋巴细胞和单核细胞浸润。剖检发病仔猪发现，全身性淋巴结肿大、出血，局灶性间质性肺炎，心瓣膜、小脑和肾表面出血；组织病理学检查发现，局灶性间质性肺炎，肠黏膜脱落，猪蹄真皮和表皮中存在化脓性炎症、上皮细胞坏死和损伤，小脑存在非化脓性脑膜炎。此外，K. Singh等[28]研究发现，SVA感染除了产生水疱症状之外，还可以诱发浆液性纤维素性腹膜炎和心包炎，局部广泛性出血性空肠炎和局灶性胃溃疡；显微观察可见病猪四肢末端皮肤损伤部位发生表皮角化和角化不全的角化过度症、表皮增生，以及由中性粒细胞混合纤维蛋白等形成的局部溃疡。
4 检疫与诊断 4.1 检疫目前，世界动物卫生组织(OIE)尚未将塞内卡病毒病列入法定报告疾病名录，国内外针对该病尚无任何检疫标准可供参考。
4.2 诊断 4.2.1 临床诊断根据临床症状与病理变化可对本病作出初步诊断，但确诊还需要实验室诊断。
4.2.2 鉴别诊断应该注意与口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎和猪水疱性疹等具有相似临床症状的疫病进行鉴别诊断。
4.2.3 实验室诊断 4.2.3.1病原学诊断：包括病毒分离鉴定、荧光定量RT-PCR和免疫组化等。
① 病毒分离与鉴定：可以利用PER.C6、NCI-H1299、ST、PK-15、SK和BHK-21等细胞系从患病动物血清、水疱液及拭子等样品中分离SVA[1, 14-15, 18, 21]。借助电子显微镜、中和试验、免疫组化和荧光定量RT-PCR等技术对病毒进行鉴定[1]。
② 荧光定量RT-PCR：美国农业部动植物卫生检疫服务局(APHIS)的外来动物疫病诊断实验室针对VP1基因设计引物，建立了SVA的SYBR Green荧光定量RT-PCR检测方法[14]；美国堪萨斯州立大学和爱荷华州立大学的科研人员分别针对3D基因和5′ UTR设计引物和探针，建立了SVA的TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法[6, 32]。相关引物和探针见表 1。
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表 1 A型塞内卡病毒荧光定量RT-PCR引物和探针 Table 1 The primers and probes used for the detection of Senecavirus A |
③ 免疫组化：利用SVA特异的单克隆抗体对患病动物的组织切片进行染色，藉此观察SVA的组织嗜性及其在组织中的分布情况[17, 33-34]。
4.2.3.2血清学诊断：包括ELISA、间接免疫荧光试验和病毒中和试验等。
① ELISA：M. Yang等利用二乙烯亚胺(BEI)灭活的SVA包被ELISA板，分别建立了可以检测SVA抗体的间接ELISA和竞争ELISA，临床检测结果表明，竞争ELISA的特异性略优于间接ELISA[17]。L. G. Gimenez-Lirola等利用原核表达的SVA VP1蛋白包被ELISA板，建立了可检测SVA血清抗体的间接ELISA[6]；C. M. T. Dvorak等利用原核表达的SVA VP1、VP2和VP3蛋白分别包被ELISA板，或者用3种蛋白质的混合物包被ELISA板，分别建立了可检测SVA血清抗体的间接ELISA，通过对大量临床猪血清样品的检测发现，单独包被VP2蛋白的ELISA和包被3种蛋白质混合物的ELISA的检测效果(敏感性和特异性)相近，但均优于单独包被VP1和VP3蛋白的ELISA[13]。
② 间接免疫荧光试验：利用SVA感染的细胞(如NCI-H1299) 对患病动物的血清抗体进行间接免疫荧光检测[12-13, 21]。
③ 病毒中和试验：利用已知数量的SVA (通常为100TCID50)测定待检血清中是否存在中和抗体，进而测定其效价[12, 17]。
5 防控措施目前，针对该病尚无疫苗可用，也没有有效的治疗手段，可以采取如下措施予以应对：
5.1 加强检疫工作目前，塞内卡病毒病尚未被OIE列入通报性疫病名录，也未被纳入《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》，该病随生猪及其产品国际贸易传播的风险较高。应加强对来自疫区的货物、携带物、邮寄物、运输工具的查验和防疫消毒工作。同时，应考虑对从疫区国家进口的生猪及其遗传物质进行检验检疫，必要时可以采取暂停进口的措施。
5.2 做好疫情处置工作鉴于该病与口蹄疫、猪水疱病、水疱性口炎和猪水疱性疹具有非常相似的临床症状而难以区分，美国农业部规定，一旦发现具有水疱的病猪，官方认证兽医应立即向州或联邦动物卫生官员通报疫情，并采取预防措施防止疫情蔓延，在得到国家外来动物疫病诊断实验室(FADDL)确诊之前暂停生猪转运[35]。由于我国尚未将该病列入官方动物疫病监控计划，缺乏相应的应急预案，发生SVA疫情时，建议参考口蹄疫的防控预案，实施严格的封锁捕杀策略，追溯疫情来源，防止疫情进一步扩散。
5.3 开展疫情监测和检测技术储备工作虽然我国已经出现了SVA感染病例[18, 30-31]，但是目前该病主要集中在广东和湖北两省区，未见其他省份出现临床感染的报道。因此，有必要在全国范围内开展SVA的流行病学调查，做到“早发现、早报告、早隔离、早诊断、早扑灭”，及时控制和扑灭疫情。此外，应尽快开展该病的检测技术研究，开发快速、灵敏、特异的病原学和血清学检测方法，增强我国口岸对该病的检疫把关能力，从容应对塞内卡病毒病疫情，切实保护我国养猪业。
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