2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009
, SUN Kai1, XIANG Zi-lai1, WANG Ling1, ZOU Hui1, GU Jian-hong1, YUAN Yan1, LIU Xue-zhong1, LIU Zong-ping1,2, BIAN Jian-chun1,2
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEA)是饲料中常见的霉菌毒素之一，又称F-2毒素，是由镰刀菌产生的一种霉菌毒素。ZEA主要产毒菌株为禾谷镰刀菌，此外，粉红镰刀菌、尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、串珠镰刀菌、黄色镰刀菌以及雪腐镰刀菌等也能产生ZEA。玉米、小麦、燕麦和大麦等作物易受到ZEA污染[1]。近几年来，ZEA在我国的检出率和检出范围不断增加，严重危害了我国仓储粮食以及动物仓储饲料的食用安全[2]。ZEA可降低饲料的营养价值，导致动物生长性能和繁殖性能下降，还具有免疫抑制作用，降低动物尤其是猪[3]对传染性疾病的抵抗力，导致慢性感染或降低疫苗接种和药物治疗的效果[4]。我国近几年来发生的猪无名高热病，就可能是霉菌毒素影响疫苗的免疫应答所导致的[5]。T细胞作为细胞免疫作用的主要免疫作用细胞，活化是其发挥免疫功能的重要前提条件。没有活化的T细胞在体内处于静息期，当其受到抗原或者淋巴细胞有丝分裂原刺激后，会活化成淋巴母细胞同时发挥相应的免疫效应[6]。目前，有关于ZEA对机体免疫系统毒性作用的体内外试验报道[7-11]，但其作用机制尚未阐明。本研究以小鼠原代T淋巴细胞为模型，利用CCK-8法、流式细胞术等技术评价ZEA对小鼠T淋巴细胞活化，增殖等行为的影响，为ZEA机体免疫系统毒性作用的机制研究和临床防控提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物清洁级BALB/c小鼠，雄性，6~8周龄，体重(20±2) g，购自扬州大学实验动物中心。
1.2 试验仪器CyAn ADP7流式细胞仪(Beckman Couiter，USA)；CO2培养箱(Thermo，USA)；Tecan Sunrise光吸收酶标仪(Tecan, Austria)；5810R台式高速冷冻离心机(EPPendorf, Germany)；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台(苏州净化)。
1.3 主要试剂玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEA)、刀豆蛋白A(concanavalin A, Con A)购自美国Sigma公司；CD3-Percp、CD69-FITC、CD4-FITC、CD25-PE流式抗体购自美国BD公司；RPMI-1640完全培养液：含10%胎牛血清(Gibco)、L-谷氨酰胺(2 mmol·L-1, sigma)、二巯基乙醇(50 μmoL·L-1，sigma)、1%青链霉素、RPMI-1640培养基粉末(Gibco)；Cell Counting Kit-8(日本同仁)；红细胞裂解液购自碧云天生物技术公司。
1.4 脾和胸腺淋巴细胞悬液的制备将BALB/c小鼠断颈处死，无菌摘取脾和胸腺，用组织研磨棒在200目滤网上研磨过滤，制备单细胞悬液。加入红细胞裂解液进行处理后，用无菌PBS液洗涤细胞2次，1 500 r·min-1离心10 min。将细胞稀释一定比例后重悬于1 mL 10%胎牛血清RPMI-1640完全培养液中，台盼蓝染色计数活细胞数(活细胞数占细胞总数95%以上)，最终调整细胞密度为3×106·mL-1的淋巴细胞悬液。
1.5 CCK-8法检测ZEA对小鼠T淋巴细胞增殖的影响分别设细胞对照组(Blank组)、Con A组、Con A+ZEA 10 μmol·L-1组(10 ZEA + Con A组)、Con A+ZEA 20 μmol·L-1组(20 ZEA+Con A组)、Con A+ZEA 40 μmol·L-1组(40 ZEA+Con A组)，将制得的淋巴细胞悬液接种于6孔板中，每孔2 mL，于药物处理组中加入相应浓度ZEA工作液各5 μL，除对照组外，每组加入Con A(终质量浓度为5 mg·L-1)[12-16]。之后在37 ℃、5% CO2培养箱继续培养48、72、96 h后混匀每孔中的培养液，分组加入96孔板中，每组设8个重复，100 μL·孔-1，同时设立空白对照孔(不加细胞)。加入CCK-8试剂，10 μL·孔-1，于37 ℃ CO2培养基中培养4 h后，立刻用酶标仪在450 nm处测定吸光度。
1.6 T细胞CD69、CD25表达情况检测采用直接免疫荧光标记法染色，细胞培养6 h后，取样离心2次后将细胞悬液浓缩至100 μL，分别加入CD69-FITC、CD3-Percp单克隆抗体各1 μg；细胞培养30 h后，分别加入CD25-PE、CD4-FITC单克隆抗体各1 μg，室温下避光孵育30 min，用冷PBS离心洗涤1次，重悬于500 μL的PBS中，立即上流式细胞仪(FACSCalibur)检测。
1.7 统计学分析所有数据以“x±s”表示，用GraphPad PrismV5.0软件进行单因素方差分析，组间比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 ZEA对小鼠T淋巴细胞增殖的影响CCK-8法检测ZEA对小鼠T淋巴细胞增殖影响的结果见表 1，在Con A刺激48、72、96 h后，Con A组与细胞空白组相比均产生了明显的刺激增殖效应(P＜0.01)；与Con A对照组相比，ZEA染毒可明显抑制Con A刺激引起的T淋巴细胞的增殖作用，除10 μmol·L-1 ZEA组在72和96 h时间段差异显著外(P＜0.05)，其余染毒组在各时间段均差异极显著(P＜0.01)，并呈浓度-效应关系。T淋巴细胞培养结果见图 1，细胞分组在96孔板培养72 h后，可见不加Con A细胞对照组(图 1A)几乎见不到细胞克隆，Con A组出现了大量的细胞克隆(图 1B)，在Con A+ZEA 10 μmol·L-1组可看到细胞克隆明显比Con A组减少(图 1C)，在Con A+ZEA 20 μmol·L-1和Con A+ZEA 40 μmol·L-1组，可看到细胞克隆团继续减少并出现死细胞团的现象(图 1D、E)。
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表 1 ZEA对T淋巴细胞增殖的影响(n=8, x±s) Table 1 Effect of ZEA on the proliferation of T lymphocytes stimulated by Con A (n=8, x±s) |
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A. Blank; B. Con A; C.10 μmol·L-1 ZEA+Con A; D. 20 μmol·#183;L-1 ZEA+Con A; E.40 μmol·L-1ZEA+Con A 图 1 不同处理组小鼠T淋巴细胞72 h增殖情况(50×) Figure 1 Proliferation of T lymphocytes in different treatment groups (50×) |
小鼠T淋巴细胞培养6 h后，用双抗体染色法结合流式细胞术检测T淋巴细胞早期活化抗原CD69的表达。流式结果及数据分析见图 2，对照组小鼠CD3+T细胞CD69的表达率为(3.23±0.61)%。在Con A刺激6 h后其CD69表达明显升高，达到(61.93±2.85)%，加入ZEA后，其表达量明显降低，ZEA在终浓度10、20、40 μmol·L-1下均抑制Con A介导的T细胞CD69表达(P＜0.01)，呈剂量-效应关系。
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A~E. ZEA对Con A刺激的T细胞表达CD69的影响(仅在CD3阳性T淋巴细胞群分析); F.不同处理组CD3+CD69+占CD3+总细胞比例(n=3, 和空白组相比，##. P＜0.01;和Con A组相比，*.P＜0.05; **.P＜0.01) A-E. Effects of ZEA on the expression of CD69 of T lymphocytes stimulated by Con A (Only analyzed in CD3 positive T lymphocytes); F. The proportion of CD3+CD69+ accounted for total CD3+ cells in different treatment groups, n=3; Compared with blank group, ##.P < 0.01; Compared with Con A group, *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 2 ZEA对Con A刺激的T细胞表达CD69的影响及CD69+细胞占比分析 Figure 2 Effects of zearalenone (ZEA) on the expression of CD69 of T lymphocytes stimulated by Con A and the proportion of CD69+ cells |
小鼠T淋巴细胞培养30 h后，用双抗体染色法结合流式细胞术检测调节T淋巴细胞中期活化抗原CD25的表达。流式结果见图 3，对照组小鼠CD4+T细胞CD25的表达率为(5.45±0.31)%。在Con A刺激30 h后其CD25表达明显升高，达到(56.43±0.83)%，加入ZEA后，其表达量明显降低，ZEA在终浓度10、20、40 μmol·L-1下均抑制Con A介导的T细胞CD25表达(P＜0.01)，呈剂量-效应关系。
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A~E. ZEA对Con A刺激的T细胞表达CD25的影响(仅在CD4阳性T淋巴细胞群分析); F.不同处理组CD4+CD25+占CD4+总细胞比例(n=3, 和空白组相比，##. P＜0.01;和Con A组相比，*.P＜0.05; **.P＜0.01) A-E. Effects of ZEA on the expression of CD25 of T lymphocytes stimulated by Con A (Only analyzed in CD4 positive T lymphocytes); F. The proportion of CD4+CD25+ accounted for total CD4+ cells in different treatment groups, n=3; Compared with blank group, ##.P < 0.01; Compared with Con A group, *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 3 ZEA对Con A刺激的T细胞表达CD25的影响及CD25+细胞占比分析 Figure 3 Effects of zearalenone (ZEA) on the expression of CD25 of T lymphocytes stimulated by Con A and the proportion of CD25+ cells |
Z. H. Ren等[7]通过体内研究试验表明，ZEA可以导致小鼠血清IL-1、IL-4以及补体C3的失调，从而影响小鼠免疫功能，尤其在高浓度的情况下失调的现象更为明显。混合霉菌毒素染毒的情况下，ZEA与其他几种霉菌毒素具有协同作用。并且，在Z. H. Ren等[8]的研究中，将360只健康成年雌性小鼠随机分为九组进行为期12 d的研究，各组小鼠分别给予一个为期4 d的连续腹腔注射不同浓度的玉米赤霉烯酮或其他霉菌毒素，单独或混合注射，于0、3、5、8和12 d收集血液样本进行试验。结果表明，各试验组均可能导致小鼠血清中IgA、IgG和IgM水平的紊乱，进而影响小鼠的体液免疫。混合组，尤其是高浓度组，对免疫球蛋白的影响效果更明显。L. J. Yang等[9]将纯化的ZEA以0、(1.10±0.02)、(2.00±0.01)、(3.20±0.02) mg·kg-1分组混在饲料中连续投喂18 d，结果每组猪的血液生化指标都发生了一定的变化，并且高浓度ZEA组降低了血清中免疫球蛋白(尤其是IgG、IgM)的滴度，且呈浓度依赖性。淋巴细胞的增殖率以及外周血中的T细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+、CD56+)的比例也受到了一定的影响。体外试验中，有研究发现，高剂量ZEA会抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖以及某些细胞因子的分泌[10]。潘顺叶等[11]研究证明，ZEA可以通过某些信号途径诱导CTLL-2细胞发生凋亡。D. E. Marin等[17-18]研究发现，ZEA及其衍生物对猪外周血淋巴细胞的增殖、抗体及细胞因子的合成均有抑制作用，进而改变体液和细胞免疫反应。
淋巴细胞是机体主要的免疫细胞，是免疫系统的核心成分，其中T淋巴细胞是淋巴细胞中数量最多、功能最复杂的一类，是特异免疫系统赖以实现免疫调节的重要细胞[19]。在免疫防御、免疫调节、炎症性疾病和自身免疫疾病当中起到相当重要的作用。而T淋巴细胞的活化和增殖是其执行免疫功能的基础，是免疫系统调控的中心环节[20]。T细胞有丝裂原Con A是经T细胞表面膜受体TCR/CD3而激活细胞内信号转导途径，通过Lck、Zap-70等上游的蛋白酪氨酸激酶(PTK)进行传导，从而介导CD69的表达[21]。CD69为T淋巴细胞早期活化的表面标志性抗原，其本身是一种细胞表面的磷酸化的同二聚体蛋白，它的表达依赖于新的RNA合成和翻译。静息T淋巴细胞极少表达CD69，而活化后的T淋巴细胞通过编码基因的转录可大量表达CD69，并产生大量的IL-2和高亲和力的IL-2R。IL-2和IL-2R特异性结合后选择性支持经抗原刺激而活化的T淋巴细胞进行扩增，因此CD69可作为T细胞早期活化标志[22-25]。而CD25是非CD4+调节性T淋巴细胞的中期活化标志，也是CD4+调节T淋巴细胞的标志。其是一种连续表达的分子, 作为组成高亲和力IL-2R的α亚基，是T淋巴细胞接受其自身分泌的IL-2信号所必需的受体。通过检测其表达可间接反映T淋巴细胞的中期活化程度[26-28]。本试验结果显示，ZEA能有效抑制CD69、CD25分子的表达，从而干扰IL-2的自分泌效应以及CD4+CD25+调节T细胞的免疫调节功能，这与其能够抑制T淋巴细胞增殖的结果一致，提示ZEA可以通过抑制活化抗原的表达而抑制T淋巴细胞的增殖和发挥免疫应答作用。因此推测其对T淋巴细胞活化的影响可能是由于降低了蛋白激酶的活性，从而干扰了T淋巴细胞的早中期活化现象，从而进一步抑制了T淋巴细胞的增殖反应。
长期以来，人们对ZEA毒性及其机制的研究集中在生殖系统[29-31]，而对其免疫毒性方面的研究相对较少。本研究通过体外试验证明，ZEA对动物免疫细胞具有直接的毒性作用，可以显著性地抑制T淋巴细胞活化及增殖。该结论可以帮助人们更全面地认识ZEA的毒性作用，并可以为ZEA中毒及由其引起的免疫力降低相关疾病防控提供参考。ZEA抑制T淋巴细胞增殖、活化的机制，涉及细胞内多个信号通路，还需要更为深入的研究。
4 结论玉米赤霉烯酮抑制小鼠T淋巴细胞早期及中期活化标志CD69及CD25的表达，说明其可以抑制T淋巴细胞体外活化，干扰T淋巴细胞由静息期向淋巴母细胞的转化，从而抑制其增殖作用以及相关免疫功能。这一结果表明ZEA对动物免疫抑制作用的产生与其可直接抑制T淋巴细胞的活化和增殖有关。
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