畜牧兽医学报  2017, Vol. 48 Issue (7): 1314-1322. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2017.07.016    PDF    
16S rRNA高通量测序方法检测羊圈空气微生物群落结构及多样性
孙翠丽1, 张阁2, 程汝佳1, 朱良全2, 丁家波2, 常维山1     
1. 山东农业大学动物科技学院, 泰安 271018;
2. 中国兽医药品监察所, 北京 100083
摘要:以羊圈空气微生物为研究对象,了解羊圈空气中细菌群落结构以及致病菌属特征。将来自10个不同羊场的羊圈空气样本,应用Illumina MiSeq高通量测序技术测定羊圈空气中细菌的16S rRNAV3-V4变异区序列,分析不同空气样本细菌群落组成。结果显示:空气样本中的细菌在97%的相似水平下共得到OTU个数为33 408,涵盖了25门、66纲、123目、253科、547属、444种的细菌。通过微生物多样性进行分析以及羊圈空气样本菌群中丰度较高的病原菌属的统计,以期为羊场的消毒和用药提供依据。本研究解析了羊圈空气样本中微生物的多样性、丰度及主要病原菌属的特征,对羊场疾病防控有一定指导意义。
关键词羊圈空气    微生物群落及多样性    MiSeq测序    
Microbial Community Structure and Diversity of Sheepfold Atmosphere by 16S rRNA High-throughput Sequencing
SUN Cui-li1, ZHANG Ge2, CHENG Ru-jia1, ZHU Liang-quan2, DING Jia-bo2, CHANG Wei-shan1     
1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai'an 271018, China;
2. China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100083, China
Abstract: The aim of this study was to investigate the bacterial community structure and the characteristics of pathogenic bacteria in the air of sheepfold. We selected ten different sheep farms to take air samples. The Illumina MiSeq sequencing with 16S rRNA V3-V4 variable region was adopted to analyze the bacterial community structures of the air in sheepfold. A total number of 33 408 operational taxonomic units (OTUs) were obtained from air samples under the similarity level of 97%. We have got bacteria comprising groups of 25 phyla, 66 classes, 123 orders, 253 families, 547 genera, and 444 species. Analysis of microbial diversity and summarize pathogens with higher abundance in sheepfolds, which provides the basis for the disinfection and medication for sheep farm. The diversity, abundance, and characteristics of the main pathogens in air samples were analyzed in this study, which would be a helpful reference for disease prevention and control in sheepfold.
Key words: air of sheep fold     microbial community structure and diversity     MiSeq sequencing    

微生物在自然界中广泛存在,微生物以单细胞悬浮状态、与干燥固体颗粒(尘埃)、液体微粒(液体小滴)相连接在空气中悬浮可形成微生物气溶胶[1]。许多病原体可通过微生物气溶胶进行传播[2],造成严重的经济损失。因此,系统地对畜禽舍微生物气溶胶进行研究具有重要意义。

唐芳等[3]通过平板计数法和多管发酵法检测山西省某舍饲羊场环境常见微生物的情况。但是,通过传统的微生物培养进行检测存在耗时、工作量大、培养基表面长出的微生物重要性被过高估计等缺点[4],并且自然界很多微生物很难分离培养并得到其纯培养物,导致只能检测到部分微生物或特定病原微生物,在种类和数量的分析上存在很大局限性[5]。近年来,随着高通量测序技术的不断发展,Illumina公司开发的MiSeq方法成功解决了通量低、准确率低、操作复杂等问题,并已经广泛被应用于环境微生物多样性的分析中[6]

本研究以羊圈空气为研究对象,对其进行16S rRNA高通量测序,分析其多样性和丰度,为羊圈气溶胶微生物多样性的研究奠定基础。同时,找出菌群中报道过的病原微生物,了解羊圈空气优势微生物的致病性,对羊场生物安全有一定的指导意义。

1 材料与方法 1.1 样品采集

实验羊场为规模化的10个羊场,分别位于内蒙古自治区中部的不同城市,采样时间在2016年3月。在每个羊场圈舍的中央离地面60 cm处,使用AirPort MD8型空气浮游菌采样仪进行采样。每个羊圈使用一块独立的凝胶膜,通气速率50 L·min-1,采集500 L空气。样本采集时,采样人员与羊场工作人员均远离采样仪。将吸附有样品的凝胶膜装入无菌封口聚乙烯袋,做好标记,带回实验室。

1.2 DNA提取与测序

将采自同一羊场饲草舍的凝胶膜样品,用PBS作为溶解液进行合并溶解后作为一个样本。浓缩含有微生物的溶解液,然后用PowerSoil DNA Isolation Kit(MOBIO)提取。提取的10份来自不同羊场的样本DNA送至北京奥维森基因科技有限公司,应用Illumina MiSeq平台对细菌和古菌16S rRNA基因的V3-V4区(336F-806R)进行测序。

1.3 数据分析处理

对Illumina测序的结果进行分析,去掉低质量的序列,根据Barcode确定对应样品,并去除Barcode和引物序列,最终得到有效的序列文件。在0.97相似度下用QIIME(V1.8.0)(Knight and Caporaso labs, USA)软件将其聚类为用于物种分类的操作分类单元(operational taxonomic units, OTU),统计各个样品每个OTU中的丰度信息,OTU的丰度初步说明了样品的物种丰富程度。利用QIIME软件计算样品包括Chao1指数[7]、Shannon指数[8]、Phylogenetic diversity(谱系多样性)[9]的α多样性值,经过UniFrac算法利用系统进化的信息来比较样品间物种群落差异[10],并进行Beta多样性(Beta diversity)分析。

2 结果 2.1 样品测序结果及取样深度验证

通过对羊圈空气中细菌16S rRNA基因的V3-V4(336F-806R)进行测序,10个样品原始序列条数为588 030个,过滤掉低质量的序列后,有效序列总数为553 521个。根据Barcode标签进行样品序列拆分,在对初始序列进行去冗余处理后,获得16S rRNA Unique Reads,并在97%相似度下将其聚类为用于物种分类的OTU,统计得到各个样品在不同OTU中的丰度信息,10个样品共产生33 408个OTU,平均测序读长在420~480 bp之间。每个样品的序列信息如表 1所示。

表 1 样本的序列信息 Table 1 Sequence information of samples

采用随机抽样的方法抽取数据,以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建曲线(图 1),即稀释性曲线(rarefaction curve)。稀释曲线反映了样品的取样深度,可以用来评价测序量是否足以覆盖所有类群。10个样品的稀释曲线如图 1所示,曲线已趋于平缓,即再增大数据量对OTU的发现也没有影响,可以说样本的OTU的覆盖度已基本饱和,说明测序数据量合理,更多的数据量对发现新OTU的边际贡献很小。

图 1 相似度为97%条件下各样本的稀释性曲线 Figure 1 Rarefaction curves of each sample at cutoff level of 3%
2.2 细菌群落的多样性分析 2.2.1 Alpha多样性分析

Alpha多样性指数分析是指对单个样品中物种多样性的分析。其中Chao1指数是根据所测得的tags和OTU的数量以及相对比例来预测样品中微生物的种类,谱系多样性反映了物种组成的系统进化特征多样性,Shannon指数是一个综合OTU丰度和OTU均匀度两方面因素的多样性指数,Shannon指数、谱系多样性指数越大,则表示该样品中的物种越丰富,反之则物种多样性越低。由表 2综合分析可知,羊场SCL5空气的物种多样性最强,其次为SCL1和SCL2,羊场SCL10的空气物种多样性最差。不同样本的物种多样性存在差异,这可能与羊圈空气的营养条件、微粒多少、紫外线照射和空气流动速度快慢等因素有关[11]

表 2 样品的Alpha多样性指数 Table 2 The Alpha diversity index of the sample
2.2.2 Beta多样性分析

Beta多样性(Beta diversity)分析是用来比较一对样品在物种多样性方面存在的差异大小。UniFrac是通过系统进化的信息来比较样品间物种群落差异,其计算结果可以作为一种衡量Beta多样性的指数,它考虑了物种间的进化距离,该指数越大表示样品间的差异越大。根据样品的物种分布,计算了unweighted UniFrac距离(只考虑各样本中的物种类别差异)和weighted UniFrac距离(考虑了样本之间物种类别差异以及各类别物种的丰富度差异)。然后,对样品间的距离矩阵进行主成分分析,做出Beta多样性的主坐标分析(PCoA)图(图 2)。

图 2 Beta多样性的主坐标分析(PCoA)图 Figure 2 Principal coordinate analysis (PCoA) scores plot of beta diversity
2.3 样品群落组成分析 2.3.1 细菌门分类水平的比较

利用QIIME软件分析各样品在门分类水平上菌群的组成和结构(图 3),共得到25种细菌类群,这些样本中含量最高的门是厚壁菌门(Firmicutes),在10个样本中相对丰度分别为87.85%、84.74%、87.22%、57.77%、58.21%、88.66%、80.47%、87.71%、90.90%和90.22%,其次是变形菌门(Proteobacteria)相对丰度分别为4.37%、3.16%、10.43%、40.96%、22.47%、9.20%、10.57%、9.47%、8.19%和9.28%,放线菌门(Actinobacteria)相对丰度分别为4.98%、2.64%、1.39%、0.65%、11.88%、0.48%、4.49%、0.89%、0.55%和0.18%,而其他菌类比例相对较低,例如:拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)等。这表明,在羊圈空气菌落结构中,厚壁菌门、变形菌门、放线菌门为三大优势菌群,而其他细菌类群为非优势菌群。

图 3 细菌门分类水平的比较 Figure 3 Comparison of bacteria groups at phylum level
2.3.2 细菌属分类水平的比较

利用QIIME软件分析各样品在属分类水平上菌群的组成和结构(图 4),共得到547种细菌类群,其中含量最高的是芽孢杆菌属(Bacillus),在10个样本中相对丰度分别为6.34%、8.86%、47.32%、32.58%、6.59%、47.42%、36.88%、45.41%、50.26%和49.61%;其次是未鉴定菌属(Unidentified)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)等,这些菌属的丰度比例相对较低。

图 4 细菌属分类水平的比较 Figure 4 Comparison of bacteria groups at genus level
2.4 菌群结构的差异分析

为了进一步探究微生物群落结构与不同羊圈空气样本之间的关系,本研究基于可分类的25个不同门类水平上,构建了含系统发育树、样品聚类关系树的热图(heat map)。分析表明,在门(图 5)水平上,微生物群根据进化关系聚类为两大分支,其中样本SCL4和SCL5构成一支,剩余样本构成另一支,说明样本SCL4和SCL5的细菌群落与其他样本明显不同。对于热图中出现的大面积的蓝色方块,表明这种菌的含量非常低,导致没有数值。

图 5 含系统发育进化树的热图(门水平) Figure 5 Heat map with phylogenetic tree (phylum level)
2.5 羊圈空气中动物细菌类病原的分布

将各羊圈空气样本中丰度较高(丰度大于0.1%)的动物病原菌进行整理,如表 3所示为羊圈空气样本中检出的20种潜在动物病原菌属的分布特征。可以看出,这20种动物病原菌属分别隶属于厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes),其中厚壁菌门、变形菌门、放线菌门为羊圈空气微生物三大优势菌门。

表 3 羊圈空气样本中潜在动物病原菌分布特征 Table 3 Characteristics of potentially pathogenic microorganisms in the air of sheepfold

进一步深入分析发现,在10个空气样本中均有检出的动物病原菌属有15个,分别为:芽胞杆菌属(Bacillus)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、链球菌属(Streptococcus)、窄食单胞菌属(Stenotrophomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、根瘤菌属(Rhizobium)、志贺菌属(Shigella);其他5个动物病原菌属仅在部分空气样本中检出。各致病菌的临床意义详见表 4

表 4 羊圈空气样本中潜在动物病原菌的临床意义 Table 4 The clinical significance of potentially Pathogenic microorganisms in the air of sheepfold
3 讨论

近年来,以细菌16S rRNA为基础的分子生物学技术因快速、灵敏、准确等优点在各类疾病的菌种鉴定中备受青睐。16S rRNA是原核生物核糖体中16S rRNA对应的基因序列,既有高度保守性,又具有一定变异性。在保守区域设计通用引物,然后利用可变区的差异鉴别菌种,这就是此类分子生物技术的基本原理。笔者利用Illumina MiSeq测序技术通过对16S rRNA的V3-V4高变区测序分析,成功地检测了羊圈空气细菌群落结构的多样性,获得了大量、全面且深入的菌群信息。10个样品共获得有效序列的总数为553 521,平均测序读长在420~480 bp。在97%的相似度水平下共产生有效OTU个数为33 408,涵盖了25门、66纲、123目、253科、547属、444种的细菌。

通过与RDP数据库[27]进行比对,在门水平上得到优势菌群为厚壁菌门、变形菌门、放线菌门,其中厚壁菌门的丰度最高;在属水平上,含量最高的为芽孢杆菌属。羊圈环境空气中的细菌种类复杂、繁多,本试验涉及到的众多病原菌属中,许多病原菌致病力较强,如苍白杆菌、志贺菌等。值得注意的是,苍白杆菌与布鲁菌均属于布鲁菌科[28],不仅能与布鲁菌发生交叉凝集,更重要的是感染后临床表现与布鲁菌病极为相似[29],苍白杆菌感染羊后极有可能会干扰羊布鲁菌病的血清学诊断。还有的属于机会致病菌,如阪崎肠杆菌、链球菌等,随着畜牧业的迅猛发展,疫病更加复杂化,原来不被重视的条件致病菌引起的损失也越来越大[30],良好的疫病防控成为保障畜牧业长远发展的关键。

本试验采集的空气样本均来源于自然状态下的羊圈,且采样前并未进行专门的消毒,样品密封保存,试验结果真实又全面地反映了羊圈空气微生物的种类、含量及分布情况,也为羊场的消毒和用药提供了依据。

4 结论

首次使用MiSeq测序技术全面解析了羊圈空气样品中微生物多样性,并初步探讨了动物致病菌属的种类与特征,为以后指导羊场疫病防控提供了科学依据。

参考文献
[1] 柴同杰, 张绍学, MUELLERW. 乳牛舍内外环境空气中需氧菌、厌氧菌以及产气荚膜杆菌的定量分析[J]. 中国兽医学报, 1999, 19(6): 612–615.
CHAI T J, ZHANG S X, MUELLER W. Concentration of airborne anaerobia in cow stable and its vicinity in preference to Clostridium perfringens[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 1999, 19(6): 612–615. (in Chinese)
[2] CUTLER T D, WANG C, HOFF S J. A method to quantify infectious airborne pathogens at concentrations below the threshold of quantification by culture[J]. Can J Vet Res, 2013, 77(2): 95–99.
[3] 唐芳, 高静, 靳玉舒, 等. 山西省某舍饲羊场环境微生物的检测与分析[C]//中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十一次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第二十次学术研讨会论文集. 太原: 中国畜牧兽医学会兽医病理学分会, 中国病理生理学会动物病理生理专业委员会, 2015: 1.
TANG F, GAO J, JIN Y S, et al. Detection and analysis of environmental microorganisms in a sheep farm in Shanxi province[C]//Chinese Association of Animal Science and Veterinary Medicine Veterinary Pathology Branch Twenty First Academic Symposium & Chinese Association of Pathophysiology Animal Pathophysiology Professional Committee Twentieth Academic Symposium Proceedings. Taiyuan: Chinese Association of Animal Science and Veterinary Medicine Veterinary Pathology Branch, Chinese Association of Pathophysiology Animal Pathophysiology Professional Committee, 2015: 1. (in Chinese) http://cpfd.cnki.com.cn/Article/CPFDTOTAL-SYBL201507001173.htm
[4] HIGHLANDER S K. High throughput sequencing methods for microbiome profiling: application to food animal systems[J]. Anim Health Res Rev, 2012, 13(1): 40–53. DOI: 10.1017/S1466252312000126
[5] HUYBENS N, HOUEIX J, LICOIS D, et al. Pyrosequencing of epizootic rabbit enteropathy inocula and rabbit caecal samples[J]. Vet J, 2013, 196(1): 109–110. DOI: 10.1016/j.tvjl.2012.08.014
[6] POŁKA J, REBECCHI A, PISACANE V, et al. Bacterial diversity in typical Italian salami at different ripening stages as revealed by high-throughput sequencing of 16S rRNA amplicons[J]. Food Microbiol, 2015, 46: 342–356. DOI: 10.1016/j.fm.2014.08.023
[7] CHAO A. Non-parametric estimation of the number of classes in a population[J]. Scand J Stat, 1984, 11(4): 265–270.
[8] HILL M O. Diversity and evenness: a unifying notation and its consequences[J]. Ecology, 1973, 54(2): 427–432. DOI: 10.2307/1934352
[9] LOZUPONE C A, KNIGHT R. Species divergence and the measurement of microbial diversity[J]. FEMS Microbiol Rev, 2008, 32(4): 557–578. DOI: 10.1111/j.1574-6976.2008.00111.x
[10] LOZUPONE C, KNIGHT R. UniFrac: a new phylogenetic method for comparing microbial communities[J]. Appl Environ Microbiol, 2005, 71(12): 8228–8235. DOI: 10.1128/AEM.71.12.8228-8235.2005
[11] 张邓华, 陈清凤, 邓芸, 等. 重庆市动物园动物环境中常见病原菌的调查及预防保健措施[J]. 中国畜牧兽医, 2009, 36(8): 140–143.
ZHANG D H, CHEN Q F, DENG Y, et al. Investigation and prevention of common pathogens in animal environment of Chongqing zoo[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2009, 36(8): 140–143. (in Chinese)
[12] 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所. 兽医微生物学[M]. 2版. 北京: 中国农业出版社, 2013.
Harbin Veterinary Research Institute. Veterinary microbiology[M]. 2nd ed. Beijing: China Agriculture Press, 2013. (in Chinese)
[13] 陆承平. 兽医微生物学[M]. 5版. 北京: 中国农业出版社, 2013.
LU C P. Veterinary microbiology[M]. 5th ed. Beijing: China Agriculture Press, 2013. (in Chinese)
[14] BHARUCHA T, SHARMA D, SHARMA H, et al. Ochromobactrum intermedium: an emerging opportunistic pathogen case of recurrent bacteraemia associated with infective endocarditis in a haemodialysis patient[J]. New Microbes New Infect, 2017, 15: 14–15. DOI: 10.1016/j.nmni.2016.09.016
[15] 李仲兴, 张新华, 王永祥. 乳球菌及其感染的研究进展[J]. 国外医学临床生物化学与检验学分册, 2005, 26(12): 928–931, 935.
LI Z X, ZHANG X H, WANG Y X. Research advance in lactococci and its infection[J]. Clinical Biochemistry and Laboratory Medicine, Foreign Medical Sciences, 2005, 26(12): 928–931, 935. (in Chinese)
[16] FROSTH S, KÖNIG U, NYMAN A K, et al. Characterisation of Dichelobacter nodosus and detection of Fusobacterium necrophorum and Treponema spp. in sheep with different clinical manifestations of footrot[J]. Vet Microbiol, 2015, 179(1-2): 82–90. DOI: 10.1016/j.vetmic.2015.02.034
[17] TYRRELL K L, WARREN Y A, CITRON D M, et al. Re-assessment of phenotypic identifications of Bacteroides putredinis to Alistipes species using molecular methods[J]. Anaerobe, 2011, 17(3): 130–134. DOI: 10.1016/j.anaerobe.2011.04.002
[18] 田克恭. 人与动物共患病[M]. 北京: 中国农业出版社, 2013.
TIAN K G. Zoonoses[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2013. (in Chinese)
[19] LIU J, CHEN P, ZHENG C Y, et al. Characterization of maltocin P28, a novel phage tail-like bacteriocin from Stenotrophomonas maltophilia[J]. Appl Environ Microbiol, 2013, 79(18): 5593–5600. DOI: 10.1128/AEM.01648-13
[20] 马保臣. 奶牛乳腺炎的研究[D]. 泰安: 山东农业大学, 2003.
MA B C. Study on cow mastitis[D]. Tai'an: Shandong Agricultural University, 2003. (in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10434-2003080660.htm
[21] KUEHN J S, GORDEN P J, MUNRO D, et al. Bacterial community profiling of milk samples as a means to understand culture-negative bovine clinical mastitis[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e61959. DOI: 10.1371/journal.pone.0061959
[22] 刘娜. 羊腐蹄病微生物多样性及主要病原菌分离与耐药性分析[D]. 大庆: 黑龙江八一农垦大学, 2015.
LIU N. The ovine hoof microbiome and the etiology of footrot in sheep[D]. Daqing: Heilongjiang Bayi Agricultural University, 2015. (in Chinese) http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10223-1015587760.htm
[23] 康晓冬, 刘溪源, 杨慧君, 等. 宁夏地区奶牛乳房炎源性放射根瘤菌的分离鉴定与药敏试验[J]. 动物医学进展, 2014, 35(12): 92–95.
KANG X D, LIU X Y, YANG H J, et al. Isolation, identification and drug sensitivity test of Rhizobium radiobacter from cows with mastitis in Ningxia area[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2014, 35(12): 92–95. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5038.2014.12.023 (in Chinese)
[24] GOMES T A, ELIAS W P, SCALETSKY I C, et al. Diarrheagenic Escherichia coli[J]. Braz J Microbiol, 2016, 47(S1): 3–30.
[25] SCHRANK K, CHOI B K, GRUND S, et al. Treponema brennaborense sp. nov., a novel spirochaete isolated from a dairy cow suffering from digital dermatitis[J]. Int J Syst Bacteriol, 1999, 49 Pt 1: 43–50.
[26] 胡文举, 宋艳画, 秦佳辰, 等. 奶牛子宫内膜炎主要致病菌的分离鉴定及药敏试验[J]. 动物医学进展, 2014, 35(5): 117–123.
HU W J, SONG Y H, QIN J C, et al. Isolation identification and drug sensitive tests of main pathogenic bacteria from cows with endometritis[J]. Progress in Veterinary Medicine, 2014, 35(5): 117–123. (in Chinese)
[27] WANG Q, GARRITY G M, TIEDJE J M, et al. Naïve Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy[J]. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(16): 5261–5267. DOI: 10.1128/AEM.00062-07
[28] HORVAT R T, EL ATROUNI W, HAMMOUD K, et al. Ribosomal RNA sequence analysis of Brucella infection misidentified as Ochrobactrum anthropi infection[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(3): 1165–1168. DOI: 10.1128/JCM.01131-10
[29] OZDEMIR D, SOYPACACI Z, SAHIN I, et al. Ochrobactrum anthropi endocarditis and septic shock in a patient with no prosthetic valve or rheumatic heart disease: case report and review of the literature[J]. Jpn J Infect Dis, 2006, 59(4): 264–265.
[30] 陈静, 锁守丽, 吴巧玲, 等. 浅谈免疫监测的作用及应用[J]. 中国动物检疫, 2007, 24(2): 31–32.
CHEN J, SUO S L, WU Q L, et al. Talks on the roles and application of immunological monitoring[J]. Chinese Journal of Animal Quarantine, 2007, 24(2): 31–32. (in Chinese)