近年来的研究陆续揭示了微生物菌群及其代谢产物短链脂肪酸(主要是乙酸、丙酸和丁酸)在维持动物肠道健康和机体能量代谢方面中发挥着重要作用[1-5]，其中丁酸被认为是大肠上皮细胞的主要供能物质[6]。因此，大肠中微生物(包括丁酸梭菌)的繁殖对于维护机体健康尤为重要，其对大肠肠段及全肠道表观氨基酸消化率的影响在揭示氨基酸营养方面也具有重要意义。丁酸梭菌作为一种新型的微生态制剂，具有调节肠道微生态平衡的作用[7-8]，但目前关于丁酸梭菌作用机制的研究还不是很清楚，丁酸梭菌是否可以通过定植在后肠而改变氨基酸的全肠道表观消化率乃至饲粮中蛋白质的利用率目前还不清楚。通过日粮向大肠引入丁酸梭菌是否会引起后肠微生物菌群的变化，进而改变机体脂肪酸组成？特别是近年来由于低蛋白质日粮能够节约蛋白质饲料资源、减少猪粪尿中氮排放量而受到广泛关注[9-10]，这一问题是否有不同答案，有待进一步研究。
本试验选用氨基酸全肠道表观消化率和血液脂肪酸组成作为主要指标来分析日粮蛋白质水平和丁酸梭菌是否对生长猪肠道菌群结构和发酵程度产生影响，为丁酸梭菌在不同蛋白质水平日粮中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料丁酸梭菌(clostridium butyricum)制剂活菌数为1×109 CFU·g-1。
1.2 试验动物与饲养管理选取24头初始体重为(39.07±1.80) kg的健康杜×长×大三元杂交去势公猪，按照随机区组的原则分为4组，每组6个重复，每个重复1头猪。试验采用2×2因子设计，设蛋白质水平(14%、18%)和丁酸梭菌(0、100 mg·kg-1)两个因子，共配制4种试验日粮，Ⅰ组日粮粗蛋白质水平为18%，不添加丁酸梭菌；Ⅱ组粗蛋白质水平为18%，添加100 mg·kg-1丁酸梭菌；Ⅲ组粗蛋白质水平为14%，不添加丁酸梭菌；Ⅳ组蛋白质水平为14%，添加100 mg·kg-1丁酸梭菌。试验预试期6 d，正试期13 d。试验期间每头猪单独饲养于代谢笼(2.6 m×1.8 m×0.9 m)中，舍内温度保持在(25±2)℃，自由饮水。日粮的有效能、必需氨基酸等营养的供给量满足NRC(2012)[11]推荐的25~50 kg体重阶段生长猪营养需要量。日粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础日粮组成和营养成分 Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets |
试验猪分别于正式试验的第1和第13天经12 h空腹后称重，计算平均日增重；并记录每头试验猪的总采食量，计算平均日采食量和耗料增重比。
1.4 粗蛋白质和氨基酸消化率采用全收粪法，在试验期的最后3 d收集新鲜粪便，加入10%盐酸溶液固氮，用于粪氮含量的测定。所有粪样置于-20 ℃冷冻保存，试验结束后将每头猪的全部粪便充分混合均匀后烘干粉碎置于-20 ℃保存备用。日粮和粪中的粗蛋白质含量(N×6.25) 采用半自动定氮仪进行分析，氨基酸含量采用离子交换色谱分析仪(Hitachi L-8800) 进行测定。
蛋白质表观消化率(%)=(蛋白质食入量-粪中蛋白质排泄量)÷蛋白质食入量×100%；
氨基酸表观消化率(%)=(氨基酸食入量-粪中氨基酸排泄量)÷氨基酸食入量×100%。
1.5 氮平衡在试验期的最后3 d收集新鲜尿液，加入10%盐酸溶液用于固氮，-20 ℃冷冻保存。试验结束后，将3 d内收集的尿样混合均匀，并取其总量的1/10用于尿氮含量的测定。
氮沉积(g·d-1)=食入氮-粪氮-尿氮；
氮利用效率(%)=沉积氮÷食入氮×100%。
1.6 血液生化指标在试验期的最后1 d，采集每头猪的前腔静脉血样，3 000 g离心10 min，收集血清并置于－20 ℃保存备用。采用全自动生化分析仪(OTA-400, WonTechTM)检测血清中总蛋白质、白蛋白质、尿素氮、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯含量。采用气相色谱仪(HP6890，Wilmingten)分析血清中游离脂肪酸含量。
1.7 数据分析本试验利用SAS 9.2[12]软件中的2×2因子一般线性模型(General liner mode，GLM)，按完全随机区组设计原则对数据进行分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.10表示有差异的趋势。
2 结果 2.1 日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对生长猪生长性能、氮平衡的影响由表 2可知，本试验中各处理组的猪生长性能均较好，平均日增重约770 g，处于良好的健康状态。在日粮中添加丁酸梭菌对生长猪生长性能无显著影响(P＞0.05)，日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对生长猪的生长性能无互作效应(P＞0.05)。但低蛋白质日粮有增加生长猪平均日采食量的趋势(P＜0.10)，且显著增加了耗料增重比(P＜0.05)。日粮蛋白质水平对生长猪平均日增重和平均日采食量均无显著影响(P＞0.05)。由表 3可知，在日粮中添加丁酸梭菌对氮平衡无显著影响(P＞0.05)。日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对氮平衡没有互作效应(P＞0.05)。低蛋白质日粮显著降低了生长猪氮摄入和尿氮排放，提高了氮利用率(P＜0.05)，对粪氮排放和氮沉积无影响(P＞0.05)。
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表 2 日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对生长猪生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary protein levels and Clostridium butyricum on growth performance of growing pigs |
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表 3 日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对生长猪氮平衡的影响 Table 3 Effects of dietary protein levels and Clostridium butyricum on nitrogen balance of growing pigs |
由表 4可知，丁酸梭菌显著降低了蛋氨酸、蛋氨酸+半胱氨酸全肠道表观消化率(P＜0.05)，对其他氨基酸的消化率没有显著影响(P＞0.05)。日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对粗蛋白质和其他氨基酸全肠道表观消化率无显著互作效应(P＞0.05)。与常规蛋白质水平组相比，低蛋白质水平组试验猪蛋氨酸和色氨酸消化率显著升高(P＜0.05)，粗蛋白质、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的消化率均显著降低(P＜0.05)，且异亮氨酸和谷氨酸消化率有下降趋势(P＜0.10)。
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表 4 日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对生长猪粗蛋白质和氨基酸全肠道表观消化率的影响 Table 4 Effects of dietary protein levels and Clostridium butyricum on TTAD of crude protein and amino acids of growing pigs |
由表 5可知，在日粮中添加丁酸梭菌显著提高了血清中顺式-5, 8, 11, 14, 17-二十碳五烯酸含量(P＜0.05)，且有降低豆蔻酸含量的趋势(P＜0.10)，对其他脂肪酸含量影响不显著(P＞0.10)。日粮蛋白质水平和丁酸梭菌两者对血清中总脂肪酸、二十四酸、棕榈油酸、花生四烯酸含量有显著互作效应(P＜0.05)。互作效应表现为不同日粮蛋白质水平会改变丁酸梭菌对血清中总脂肪酸、棕榈油酸及二十四酸含量的影响，而饲粮中添加丁酸梭菌会影响日粮蛋白质水平对血清中花生四烯酸含量的作用。低蛋白质日粮显著降低生长猪血清中亚油酸含量(P＜0.05)，且有提高棕榈酸含量的趋势(P＜0.10)，对其他脂肪酸含量无显著影响(P＞0.05)。
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表 5 日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对生长猪血液脂肪酸水平的影响 Table 5 Effects of dietary protein levels and Clostridium butyricum on serum fatty acid composition of growing pigs |
由表 6可知，在日粮中添加丁酸梭菌对生长猪血生化指标无显著影响(P＞0.05)。日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对血生化指标无显著互作效应(P＞0.05)。饲喂低蛋白质水平日粮显著降低了生长猪血清尿素氮含量(P＜0.05)，对血清中总蛋白质、白蛋白质、低密度脂蛋白质胆固醇、高密度脂蛋白质胆固醇、甘油三酯、葡萄糖和总胆固醇无显著影响(P＞0.05)。
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表 6 日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对生长猪血清生化指标的影响 Table 6 Effects of dietary protein levels and Clostridium butyricum on serum biochemical indexes of growing pigs |
本试验主要通过测定生长猪氨基酸全肠道表观消化率和血液脂肪酸组成来反映不同蛋白质水平日粮中添加丁酸梭菌对生长猪蛋白质、氨基酸的利用率以及血液脂肪酸组成的影响。依据猪肠道微生物和血液脂肪酸对日粮变化的响应时间约为7~10 d[13-14]，本试验正式期设为13 d。生长性能的测定表明，试验期内生长猪均处于正常健康状态，其采食量和日增重未受试验因素的影响。氮平衡试验结果显示，丁酸梭菌对氮平衡无影响。降低日粮中粗蛋白质水平被认为是减少氮排放的一种有效方法[15-16]，本试验中，低蛋白质水平组与正常蛋白质水平组相比，尿氮排放显著降低、氮利用率提高，粪氮排放和氮沉积无显著差异，说明低蛋白质日粮降低氮排放主要通过降低尿氮排放量，这与鲁宁等[17-18]的研究结果一致。
3.2 日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对生长猪粗蛋白质和氨基酸全肠道表观消化率的影响目前还未见到丁酸梭菌对猪氨基酸消化率影响的报道。在本试验中，添加丁酸梭菌显著降低了蛋氨酸、蛋氨酸+半胱氨酸的全肠道表观消化率，这可能与丁酸梭菌能影响肠道微生物菌群结构[7]，而微生物菌群的变化又会影响氨基酸在肠道的吸收利用[19]有关，但为什么只改变了蛋氨酸的全肠道表观消化率有待于进一步研究。在低蛋白质日粮中补充合成氨基酸会改变氨基酸的吸收位点和吸收速度，降低氨基酸在小肠的吸收和转运[20-21]，也有研究称低蛋白质日粮会降低猪回肠末端多数氨基酸的表观消化率[22-23]。本试验中，低蛋白质水平组的粗蛋白质、精氨酸和组氨酸等多数氨基酸的全肠道表观消化率均显著降低，这与前人的研究结果相吻合[23]。氨基酸消化率受很多因素影响，其中日粮组成是很重要的一个因素[24]。有研究表明，晶体氨基酸的消化率比蛋白质结合型氨基酸高[25]，但本试验中晶体氨基酸添加量很小，其对日粮总氨基酸消化率的影响可以忽略不计。在本试验的日粮中，低蛋白质水平组玉米的比例较常规蛋白质水平组中高，而豆粕比例较少，玉米中各氨基酸的消化率均比豆粕的低[11]，这可能是造成低蛋白质组氨基酸消化率降低的原因之一。
3.3 日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对生长猪血液脂肪酸组成的影响脂肪酸在动物营养、健康和生物化学过程中发挥重要作用，血液中游离脂肪酸组成能够快速反映动物机体脂肪酸组成变化的情况。有趣的是，本试验中，丁酸梭菌显著提高了血清中顺式-5, 8, 11, 14, 17-二十碳五烯酸含量。二十碳五烯酸是动物必需的n-3多不饱和脂肪酸，在动物生长、繁殖和发育过程中发挥重要作用[26-27]。日粮蛋白质水平和丁酸梭菌添加水平二者对血清中总脂肪酸、二十四酸、棕榈油酸、花生四烯酸含量有互作影响，且对血清单不饱和脂肪酸含量有互作影响趋势，由此可见，丁酸梭菌与蛋白质水平共同参与了血液脂肪酸组成的调节。日粮蛋白质水平和丁酸梭菌都影响着肠道微生物平衡[28-29]，而肠道微生物的发酵程度与挥发性脂肪酸的产生密切相关[30]。挥发性脂肪酸经肠壁吸收进入血液，进而影响血液中脂肪酸组成。这可能是本试验中日粮蛋白质水平和丁酸梭菌改变血液脂肪酸组成的一个重要原因，有待于进一步验证。
3.4 日粮蛋白质水平和丁酸梭菌对生长猪血液生化指标的影响血清尿素氮是蛋白质代谢的终产物之一，其含量能够反映动物对蛋白质代谢和利用的状况[31]。本试验中，丁酸梭菌对生长猪血清尿素氮、总蛋白质水平等血液生化指标均无显著影响，且蛋白质水平和丁酸梭菌对血液生化指标无互作效应。张彩云等[32]发现，丁酸梭菌有降低断奶仔猪血清尿素氮的趋势，这种分歧可能是因为与断奶仔猪相比，生长猪消化道微生物区系受到外源添加丁酸梭菌的影响较小。此外，本试验中，低蛋白质日粮显著降低了猪血清尿素氮含量，对血清中总蛋白质、白蛋白质、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、葡萄糖和总胆固醇无显著影响。
4 结论本试验条件下，丁酸梭菌降低了日粮中蛋氨酸全肠道表观消化率，提高了血清中顺式-5, 8, 11, 14, 17-二十碳五烯酸含量。且丁酸梭菌和日粮蛋白质水平对血清中总脂肪酸、二十四酸、棕榈油酸、花生四烯酸含量互作显著，说明二者可能具有共同调节血液脂肪酸组成的作用，但其是否是通过改变肠道微生物菌群的结构或发酵程度而发挥作用仍需进一步研究。同时，在研究日粮中添加丁酸梭菌的作用时应该考虑日粮粗蛋白质和蛋氨酸的水平。
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