2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 农业部畜禽遗传资源与利用重点开放实验室, 北京 100193;
3. 湖南农业大学动物医学院, 长沙 410128;
4. 北京农业职业学院, 北京 102442;
5. 北京市畜牧总站, 北京 100107;
6. 石家庄天泉良种奶牛有限公司, 石家庄 050020
, LI Lan-qi2,3, WANG Zhen-ling4, REN Kang5, LI Shu-jing6, LU Yong-qiang5
, WANG Dong2
2. The Key Laboratory for Farm Animal Genetic and Utilization of Ministry of Agriculture of China, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
3. College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;
4. Beijing Vocational College of Agriculture, Beijing 102442, China;
5. Animal Husbandry Station of Beijing, Beijing 100107, China;
6. Shijiazhuang Tianquan Elite Dairy Ltd., Shijiazhuang 050020, China
繁殖效率是奶牛场经济效益重要影响因素之一[1]，提高发情鉴定与排卵时间预测准确性是提高奶牛繁殖效率的关键[2-3]。奶牛发情鉴定主要有外部观察与体温[4-5]、阴道黏液电阻值(简称电阻值)[6]、活动量[7]、孕酮浓度[8-9]、产奶量[10]检测等方法。人工外部观察法简单有效、错误率低[11]，对夜间发情[12-13]、发情持续时间短、无站立发情表现[14-15]或隐性发情牛漏检较多[16-18]。准确、有效、简便的发情鉴定方法，对提高奶牛场繁殖效率有重要意义。
1954年，J.B.Roelofs等[19]应用活动量变化进行奶牛发情鉴定。研究发现，93%的母牛发情期活动量激增至平时的400% [11]，使用活动量鉴定发情，奶牛发情检出率可高达83.0%~91.5%，假阳性率为8.0%~11.3% [19-20]。但从开始发情~排卵平均约为(29.0±3.9) h(22~39 h)，有的则稍短一些，11.5%牛 < 20 h，14.7%牛＞30 h[20]。使用活动量鉴定奶牛发情效果较好，但用于预测排卵时间则存在一定局限性，很难准确确定输精时间。奶牛发情除伴随活动量变化外，还伴随着阴道黏液电阻值的规律性变化，黄体期电阻值最高，卵泡发育期电阻值较低[21-22]，排卵前25 h，电阻值达到最低值[18]。发情牛与未发情牛电阻值差异显著，电阻值用于发情鉴定具有很高的灵敏性与特异性[6]。电阻值与卵泡直径成负相关[23]，但排卵与电阻值的关系未明确揭示。活动量与电阻值结合用于预测奶牛发情排卵具有明显优势，相关研究未见报道。
本团队自行研发了一套发情监测系统(一种基于奶牛活动量变化的发情监测系统，专利号：CN201520109489.6)。使用该系统自动检测试验牛活动量，同时使用发情排卵仪手动测定试验牛电阻值，结合观察发情与直肠检查结果确定奶牛发情、排卵状态。探究奶牛发情排卵与活动量、电阻值的相关性，为建立奶牛发情自动监测技术与准确确定输精时间提供重要参考。
1 材料与方法 1.1 试验时间地点本试验于2015年10月—2016年3月在河北天泉良种奶牛场进行。
1.2 试验动物及饲养随机选择产后60~90 d二胎健康、西门塔尔牛与产后60~90 d头胎健康荷斯坦奶牛各10头为试验牛，所有试验牛个体间不存在血缘关系。试验牛采用散栏饲养、全混合日粮(TMR)饲喂，每天6:00、14:00、18:00 3次投放饲料、保证清洁饮水。
1.3 试验仪器本团队自行研发的发情监测系统(一种基于奶牛活动量变化的发情监测系统，专利号：CN201520109489.6)：活动量检测装置(计步器，采用加速度传感器检测活动量)、采集器(收集计步器检测到的活动量数据，并上传至上位机系统)及上位机系统(包括上位机通信模块与上位机软件，用于接收与储存采集器上传的数据，并经分析后通过上位机软件显示)，发情排卵仪(BATERSUARG®)。
1.4 两次PG法诱导同期发情牛产后发情周期任意一天第1次注射前列腺素F2α(Prostaglandin F2α，PGF2α)，11 d后, 第2次注射PGF2α，试验牛第2次注射PGF2α后，2~5 d内发情，该处理发情率可达90%[24]，对于发情母牛进行后续检测分析。
1.5 发情鉴定 1.5.1 外部观察第2次注射PGF2α后第2天开始，每4 h观察1次发情(每次30 min)。参考J.B.Roelofs等[19]记录方法，将首次观察~发情的时间-2 h定为发情开始时间，最后一次观察~发情的时间+2 h定为发情结束时间，同时进行直肠检查与活动量确定。此外，通过直肠检查确定排卵时间，排卵时间定义为最后一次摸到卵泡的时间+2 h。
1.5.2 电阻值检测第2次注射PGF2α后立即检测电阻值，注射后第2天开始每4 h测定1次电阻值，直至排卵后6 h，测定结束。
1.5.3 活动量检测试验前将计步器固定于牛后腿跖部，采用实时监测方式检测活动量，每检测到1次加速度则活动量记为1，并以30 min为周期累计活动量数据。采集器每4 h采集1次计步器储存的活动量数据，并传到电脑储存，经过初步分析后通过软件显示。当活动量超过前10 d(间情期)平均值的3倍，并持续2 h以上时认为开始发情，活动量降至前10 d(间情期)相同时间点平均值的3倍以下时，定义为发情结束，并通过观察发情、直肠检查结果进行确认。
1.6 数据分析电阻值数据与活动量数据均使用SAS 9.2进行方差分析，检验发情期与间情期、不同品种间差异显著性。由于牛发情起始时间、结束时间及排卵时间均不同步，发情持续时间也不同，因此，进行电阻值与活动量变化规律研究时，将发情开始时间与排卵时间均定为0，并分别向前后截取一段时间进行统计分析。采用t检验分析不同品种牛发情持续时间、开始发情~排卵时间、发情结束~排卵时间的差异显著性。
2 结果 2.1 发情期电阻值与活动量变化规律 2.1.1 牛发情排卵时电阻值变化规律对西门塔尔牛(肉牛)与荷斯坦奶牛(奶牛)电阻值的方差分析，肉牛与奶牛发情期((221±26) Ω vs (219±29) Ω)与间情期((299±11) Ω vs (302±14) Ω)阴道黏液电阻值无品种差异(P＞0.05)，但间情期电阻值((300±12) Ω)显著高于发情期((220±27) Ω)(P＜0.05)。将发情(排卵)开始时间定为0 h，发情(排卵)开始前时间为负数，发情(排卵)开始后时间为正数。发情开始前后与排卵前后电阻值变化规律见图 1和图 2(不区分品种)。图 1显示，间情期电阻值维持在最高水平((300±12) Ω)，发情开始前4 h电阻值迅速下降，到发情后8~12 h下降至最低值((220±27) Ω)，之后电阻值逐渐上升，至排卵结束恢复至间情期水平(图 2)，间情期与发情期电阻值最大平均差值为(114±18) Ω(P＜0.05)，电阻值最低值至排卵的时间为(15.0 ±1.3) h。
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*.P < 0.05。下同 *.P < 0.05.The same as below 图 1 发情开始前后电阻值变化规律 Figure 1 The variation of VER before and after the onset of oestrus |
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图 2 排卵前后电阻值变化规律 Figure 2 The variation of VER before and after ovulation |
分别统计西门塔尔牛和荷斯坦奶牛发情期活动量平均值与间情期10 d相同时间点活动量平均值，两品种牛发情开始后与发情结束前活动量变化规律如图 3、图 4。结果表明，间情期肉牛与奶牛发情时活动量较低，其中肉牛活动量均 < 500，奶牛大部分活动量 < 500，仅有部分时间段＞500。发情后活动量急剧增加，肉牛整个发情期活动量均＞1 000，奶牛有部分时间活动量 < 1 000。发情开始后4.5 h左右奶牛活动量增加至最大值(2 370±790)，肉牛发情后4.0 h左右活动量增加至最大值(1 979±1 019)；肉牛与奶牛活动量分别于发情结束前4.0与11.5 h左右达最高。母牛活动量高峰后，随发情进程活动量逐渐降低，至发情结束后恢复至正常值。
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图 3 发情开始后活动量变化规律 Figure 3 Activity variation after the onset of oestrus |
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图 4 发情结束前活动量变化规律 Figure 4 Activity variation before the end of oestrus |
本研究共监测了20头牛的活动量与阴道黏液电阻值数据，将活动量超过间情期3倍，并持续2 h定义为开始发情，活动量降至间情期3倍以下定义为发情结束，结合电阻值、外部观察与直肠检查结果，确认19头牛发情并排卵。发情后与发情前数据统计分析结果见表 1。表 1表明，发情后活动量平均增加(10.8±7.0) 倍，肉牛增加倍数显著高于奶牛(P＜0.05)。发情持续时间平均为(15.6±2.8) h，43.75%牛发情持续时间集中为17~18 h，81.25%持续时间为14~19 h，肉牛发情持续时间显著短于奶牛P＜0.05。发情开始~排卵的时间平均为(26.8±4.2) h，发情开始~排卵的时间为26~30 h的占49.5%，奶牛显著长于肉牛(P＜0.05)。发情结束~排卵时间平均为(11.3±4.3) h，主要集中在8~14 h(62.5%)，肉牛与奶牛间差异不显著(P＞0.05)。阴道黏液电阻值出现最低值~排卵的时间为(15.0±1.3) h，肉牛显著短于奶牛(P＜0.05)。
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表 1 牛发情、排卵时间及活动量变化规律 Table 1 Oestrus and ovulation time and the variation of activity |
本研究同期处理20头牛，经外部观察及直肠检查确认(表 2)，共鉴定出19头牛发情，1头未发情，同期发情率95%。表 2显示，同期处理后发情的19头牛中，17头活动量变化明显(西门塔尔牛9头，荷斯坦牛8头)，16头电阻值变化明显(西门塔尔与荷斯坦各8头)，活动量与阴道黏液电阻值均明显变化的14头(西门塔尔牛与荷斯坦牛各7头)。单独使用活动量与阴道黏液电阻值的发情检出率，西门塔尔牛分别为90%与80%，荷斯坦奶牛均为88.9%，而两参数的整合发情鉴定率则可达100%。
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表 2 以活动量与电阻值为指标的发情鉴定效果 Table 2 Oestrus detected efficiency based on VER and activity |
奶牛运动量的影响因素可能有品种、胎次、泌乳阶段、气候及个体差异等因素[25]。采用统一阈值的算法将增加奶牛发情鉴定错误率。基于广义似然比及时间概率进行奶牛活动量数据统计，采用统一阈值进行发情鉴定，对44头奶牛活动量数据分析，发情检测灵敏度达88.9%，错误率达5.9%[26]。孙保贵等将128步定为阈值，和当天活动量与前1 d运动量的差值相比较，发情检出率90%，错误率3.7%[27-28]。本研究将当天活动量与前10 d相同时间点的个体平均值进行比较，充分考虑了个体变化因素，避免了品种、胎次、泌乳阶段、气候及个体差异等因素的影响，并设定当差值达到3倍，且持续2 h时，认为开始发情，低于阈值后则认为发情结束，未采用全场固定的阈值，降低了系统误差和错误率，增加了发情检出率。该系统阈值可根据不同牛场发情活动量变化规律个性化设定，减少了由于牧场管理方式、饲养水平等差异引起的错误率。
雌激素是刺激下丘脑诱导发情的最主要信号，而高产奶牛雌二醇水平低于低产牛，导致高产奶牛发情时活动量低于低产奶牛[29]。荷斯坦奶牛发情期活动量变化规律研究表明，初产牛发情时活动量增加倍数显著高于经产牛((354.8±8.4)% vs. (323.9±6.0)%)[30]。也有研究表明，头胎牛与二胎牛发情活动量差异不显著[27]。本研究发现，奶牛发情后活动量低于肉牛，原因可能奶牛产奶消耗较大，卵泡发育不如肉牛更充分，导致奶牛发情后活动量显著低于肉牛，但本测定结果也高于A.M.L.Madureira等[30]研究结果(8.5倍vs. 3.5倍)，具体原因有待深入研究。
对98头泌乳奶牛发情期活动量规律研究发现，奶牛发情持续期为(13.0±0.8) h，其中97头牛，开始发情~排卵时间为(25.7±0.4) h，发情结束~排卵时间为(13.1±0.8) h[20]。对282头发情牛的研究也发现了相似结果[31]。而J.B.Roelofs等[19]发现，奶牛排卵分别发生在发情开始后(29.3±3.9) h，及发情结束后(19.4±4.4) h，时间稍长一些。研究荷斯坦奶牛发情持续时间发现，初产牛显著长于经产牛((12.0±0.3) h vs. (10.2±0.2) h)[30]。也有研究未发现经产牛与初产牛间发情持续时间有显著差异[32]。本研究发现，发情持续时间平均为(15.6±2.8) h，但初产牛与经产牛之间发情持续时间差异与A.M.L.Madureira等[30]研究结果基本一致，可能初产牛产奶任务较轻，卵泡发育较充分，发情持续时间相对较长。
黄体期电阻值最高，卵泡发育期电阻值最低[21-22]，与本研究结果一致，但其未明确揭示发情周期变化规律，本文首次揭示间情期电阻值最高((300±12) Ω)，发情前迅速下降，至发情后8~12 h降至最低值((220±27) Ω)，排卵前后恢复至间情期水平。关于电阻值与卵泡直径负相关的研究结果[23]与本研究基本一致。但本研究发现排卵前(15.0±1.3) h阴道黏液电阻值达最低，显著短于以往排卵前25 h电阻值达到最低值的报道[18]。本研究发现，阴道黏液电阻值达最低至排卵时间较集中，可利用该指标准确预测排卵时间。本研究结合二参数可进一步提高牧场的发情鉴定效率，进而提高妊娠效率。与传统观察发情相比，本团队研发的奶牛发情监测系统实现了24 h全覆盖检测，有望能大大提高发情持续时间短与夜间发情牛只检出率，同时，一旦实现电阻值自动化检测，将大大提高排卵时间预测的准确性，大幅降低传统观察发情的劳动时间与强度，解放生产力，对提高奶牛场经济效益具有现实意义。
4 结论本研究初步揭示了西门塔尔牛、荷斯坦奶牛发情期活动量与电阻值变化规律，利用该规律获得了较高的发情检出率，为自动化发情监测及排卵预测技术的研发及应用提供了重要参考。
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