新城疫(Newcastle disease，ND)又称亚洲鸡瘟、伪鸡瘟或禽肺脑炎，是由新城疫病毒引起的一种急性、高度接触性传染病^[1-3]。新城疫的主要特征：呼吸困难、神经紊乱、黏膜和浆膜出血、死亡率高等。家禽中鸡最易感，雏鸡比成年鸡更易感染。该病被国际兽疫局(OIE)列为需通报传染病，在中国也被列为一类传染病。20世纪90年代在欧、亚流行的ND，分子流行病学上发生了很大变化，呈现以基因Ⅶ型为主导的新趋势。目前我国流行的NDV毒株的基因型极其复杂，存在多个基因型，但以基因Ⅶ型为主，对养禽业造成重大的经济损失^[4]。

新城疫病毒属于副黏病毒科腮腺炎病毒属的成员，是一种有囊膜的负链RNA病毒，整个基因组为单一开放阅读框，全长约15 kb左右。含有6个串连的基因，顺序为3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次为核蛋白(Np)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶(HN)和聚合酶(L)。其中融合蛋白(F)和血凝素神经氨酸酶(HN)是NDV的主要保护性抗原。F蛋白由65 ku的无活性前体F0合成，随后在蛋白酶的作用下裂解为55 ku的F1和10 ku的F2，F1和F2由二硫键连接在一起^[5-7]。F蛋白是NDV感染细胞所必需的，它不仅能促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合，而且能促进相邻宿主细胞之间发生融合，是构成NDV致病力的重要成分，诱导机体产生中和抗体的主要抗原。新城疫病毒可经过消化道或呼吸道，也可经眼结膜，受伤的皮肤和泄殖腔黏膜侵入机体，病毒在24 h内很快在侵入部位繁殖，随后进入血液扩散到全身，引起病毒血症，表明黏膜免疫系统在预防新城疫过程中起着重要的作用。

转基因植物疫苗(transgenic plant vaccine)是把植物基因工程技术与动物机体免疫机制相结合，生产出能使动物机体获得特异抗病能力的疫苗^[8]。同时，“转基因植物疫苗”有细胞壁作为天然的“生物胶囊”，可使细胞中的抗原抵抗胃内的酸性环境和消化道内各种酶的降解，使其顺利到达小肠，并且在小肠内缓慢释放引起消化道的黏膜免疫反应，达到免疫保护的目的^[9]。但根据S. Kumar等报道^[3]，单独应用融合蛋白或融合蛋白和血凝素神经氨酸酶结合在一起免疫家禽，具有完全保护性抗原作用，而单独使用融合蛋白(F)也能对家禽起到部分保护作用。F蛋白是NDV防控中的理想靶标^[10]。因此，利用转基因水稻表达F蛋白为后续研究具有实用性的鸡新城疫转基因植物疫苗奠定了基础^[11-12]。

1 材料与方法 1.1 基因、载体及主要试剂

根据GenBank中登录的F基因序列，由南京金斯瑞公司合成重组质粒pUC57-F序列。中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300由武汉禾元生物技术有限公司提供。新城疫F抗原检测试纸条由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室提供。10× Loading Buffer、DL2000 DNA Marker、Taq酶、dNTPs购自大连宝生物公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen生物技术有限公司；琼脂糖为Sigma公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 引物的设计

根据F和潮霉素(hygromycin, hyg)的基因序列，应用DNAMAN8的软件分别设计一对引物，并根据F基因序列设计荧光定量PCR的一对引物，上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表 1)。

1.3 重组质粒的构建及鉴定

双酶切pUC57-F和pMP3后，经过T4连接酶连接，F基因携带pMP3载体上有助于外源基因在水稻中表达的GT13启动子、信号肽SP和终止子NOS，构建了重组中间载体pMP3-F，经PCR鉴定，送公司进行测序。然后将pMP3-F和1300载体分别用HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切、连接，构建了转基因植物载体1300-F，用PCR扩增鉴定并送公司测序。

1.4 水稻胚乳的转化

利用农杆菌介导法^[13]对2批(约300块)愈伤组织进行遗传转化，经过潮霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织移栽温室，获取转基因再生苗，选取存活植株进行后续鉴定。取0.2 g左右水稻叶片，用CTAD法提取新鲜的水稻叶片总DNA，检测DNA的浓度，用1%的琼脂糖凝胶电泳验证。分别对潮霉素基因和目的基因双重扩增，从而筛选出含有目的基因和潮霉素基因的植株。

1.5 水稻表达F蛋白的鉴定

按每20 mg米粉加入100 μL抽提液(10 mmol·L^-1)Tris-HCL(25 mmol·L^-1 NaCl, 1 mmol·L^-1EDTA，1 mmol·L^-1 GSH pH9.0)。在室温振摇1 h，然后在15 000 r·min^-1离心20 min, 吸取上清液至另一新的离心管中，保存于4 ℃备用。取适量蛋白质样品经SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜上。用NDV抗原检测试纸条检测F蛋白的活性。

1.6 纯合子植株的筛选

为了挑选表达F蛋白的纯合子株系，用相对定量PCR的方法比较Ct(2^-ΔΔCt)进行筛选。用水稻的内源基因RBE4(单拷贝)作为内参，筛选到表达为内参两倍拷贝数的目的基因，判断其为纯合子，即纯合子的2^-ΔΔCt值为杂合子的两倍。用CTAB提取T2代水稻的新鲜叶片DNA，反应的总体积为20 μL，包括2 μL DNA模板，5 μL 2×SYBR Green混合液，上下游引物各0.5 μL。反应程序：预变性95 ℃10 min，之后进行32个循环的95 ℃ 15 s，53 ℃ 20 s，和95 ℃ 15 s，53 ℃ 20 s，每个反应重复三次^[14]。

2 结果 2.1 重组表达载体的鉴定

重组表达质粒pUC57-F经过MlyⅠ和XhoⅠ双酶切后，与酶切载体pMP3连接，经转化、鉴定获得pMP3-F重组表达载体(图 1a)。然后用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切pMP3-F和pCAMBIA1300进行双酶切、连接、转化，经PCR扩增和双酶切鉴定(图 1b)。

2.2 转基因水稻植株的获取及鉴定

经农杆菌介导法将pCAMBIA1300-F导入到水稻愈伤中，得到转基因再生苗121株，存活植株79株，经过PCR鉴定，阳性表达植株有64株(图略)。目的基因(图 2a)和潮霉素基因(图 2b)的PCR分析证明F基因已整合进转基因水稻的基因组中。阳性植株T0代成熟后收获T1代水稻种子，共收获到64个表达目的基因的独立转化子。

2.3 F蛋白表达的鉴定

用抽提液提取种子中的总蛋白质，用抗F的特异抗体进行SDS/PAGE和Western blot杂交分析，结果显示在转基因水稻成熟种子中有F蛋白的表达(图 3a)。随后新城疫抗原检测试纸条进行再次筛选检测(图 3b)。

2.4 纯合子植株的筛选

用QPCR的方法筛选T2代纯合子植株，starch branching enzyme (RBE4) 作为内参基因。在相对定量PCR的基础上用Ct (2^-ΔΔCt)数值来判断纯合子。其中纯合子的Ct (2^-ΔΔCt)数值是杂合子的两倍。首先，确定内参基因和目标基因的标准曲线、扩增效率和熔解曲线(图片未展示)，目标基因标准曲线的R²是0.994，PCR的扩增效率为105%，该数值证明可以用此标准曲线进行纯合子的检测。在试验中Ct (2^-ΔΔCt)数值都是在1~2之间，故用Ct (2^-ΔΔCt)大于2的作为纯合子筛选结果(图 4)。从64个转化子，筛选出了16株纯合子植株，根据新城疫试纸条和电泳结果，选取其中既是纯合子、表达量又相对高的5株(1、18、23、25、52) 进行种植，进行后续研究。

3 讨论

新城疫在全世界很多地方流行，接种疫苗是预防新城疫疾病暴发的首选^[15-16]。传统的疫苗接种往往受宿主和病毒两方面的影响而使得免疫失败, 即宿主对病毒的免疫耐受力下降及病毒产生变异使宿主不能抵抗病毒的攻击。用转基因植物的方式生产疫苗倍受青睐。其中利用水稻胚乳表达动物病原蛋白不仅能降低成本，同时可避免生物之间的交叉污染。近年来，为有效降低表达动物主要免疫保护性蛋白的成本并提高其生产效率，大规模表达外源蛋白质的方法一直被人们广泛关注，而水稻作为我国的主要作物，不仅容易形成规模化生产，而作为疫苗，水稻更具有良好的安全性，水稻胚乳作为天然的储藏场所可以在室温存放长达数年^[17-18]。

将外源基因F基因插入pCAMBIA1300载体中，其上GT13a启动子是胚乳启动子，可以启动外源基因在水稻胚乳中表达，通过潮霉素和目的基因的PCR检测，说明F基因已经整合到植物染色体上，根据Western blot和试纸条检测结果，说明F蛋白在水稻中成功表达。通常表达外源蛋白质的方法有很多，包括大肠杆菌表达系统、酵母细胞表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统，而在转基因植物表达系统中表达重组蛋白质可以保证获得的重组蛋白质更接近于自然状态下的翻译修饰。而纯合子筛选不仅使水稻表达的F蛋白更加稳定，也有助于高表达株系的筛选。据报道，新城疫F基因已经在玉米，土豆等植物中成功表达^{[5, 19]}。植物表达可以帮助外缘基因进行糖基化修饰，从而形成多种形式的糖基化构型，而外加的这些多糖可能会改变在SDS/PAGE电泳的蛋白质大小。优化过的基因经过多肽串联，预测的蛋白质大小为115 ku，而在Western blot中发现，表达的蛋白质分别在120和70 ku。检测到的120 ku目的蛋白质，可能是由于水稻胚乳表达系统糖基化造成的^[20]，而糖基化修饰是否完全，修饰后的抗原活性是否更好，仍在进一步研究中。表达的70 ku目的蛋白质则可能是在表达过程，部分断裂导致的结果，但是断裂后是否有活性，也需要更深入的试验来论证。本试验为水稻表达系统表达新城疫F蛋白亚单位疫苗提供了可能，通过鉴定出的纯合子筛选出高表达量株系，同时植物作为载体来表达也给疫苗的发展注入了新的内容，为制备亚单位疫苗奠定基础。

4 结论

优化并合成新城疫病毒F基因，连接至pCAMBIA1300植物载体，通过农杆菌导入水稻愈伤组织，获得表达植株。F蛋白在水稻中成功表达。通过QPCR的方法筛选获得5株高表达的纯合子株系。