畜牧兽医学报  2017, Vol. 48 Issue (6): 1158-1166. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2017.06.021    PDF    
引用本文
赵帅平, 焦小丽, 李留安, 郭亮, 田川尧, 王颖, 杨婧, 张品东. 绵羊TRA2B基因的克隆、序列信息与表达分析[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(6): 1158-1166.  
ZHAO Shuai-ping, JIAO Xiao-li, LI Liu-an, GUO Liang, TIAN Chuan-yao, WANG Ying, YANG Jing, ZHANG Pin-dong. Cloning, Sequence Information and Expression Analysis of TRA2B gene in Sheep (Ovis aries)[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(6): 1158-1166.  
绵羊TRA2B基因的克隆、序列信息与表达分析
赵帅平, 焦小丽, 李留安, 郭亮, 田川尧, 王颖, 杨婧, 张品东     
天津农学院动物科学与动物医学学院, 天津 300384
收稿日期：2016-12-30
基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目（201610061003）；附属动物医院关键技术集成与学生综合能力提升（2017.40）；天津市科委重大种业项目（15ZXZYNC00100）
作者简介：赵帅平(1994-), 男, 河南原阳人, 本科, 要从事动物科学研究, E-mail: 846719542@qq.com
通信作者：焦小丽, 博士, 讲师, 主要从事动物分子遗传育种研究, E-mail: jxlwjh@126.com
摘要：旨在研究绵羊TRA2B基因的结构与功能，探讨其在两品种脂尾型绵羊脂肪等不同组织中的表达和调控特性。采用RT-PCR克隆TRA2B基因编码区（CDS）并对其进行生物信息学分析；Real-time PCR检测广灵大尾羊和小尾寒羊8月龄公羊共8只心、肝、肾、小肠、睾丸、肾周及尾脂肪组织、股二头肌中TRA2B基因mRNA的表达。结果表明，TRA2B基因CDS区长867 bp，编码288个氨基酸。生物信息学分析表明，TRA2B为不稳定的水溶性蛋白，无信号肽和跨膜域，有2个O-糖基化位点和70个磷酸化位点，109~196氨基酸残基为RRM保守结构域。TRA2B基因mRNA在所检测的组织中均有一定的表达，睾丸中表达量最高，显著高于肾、肾周脂肪与尾脂（P＜0.05）以及肝、股二头肌和小肠中的表达量（P＜0.05），心中表达量最低（P＜0.05）。品种间总mRNA表达量差异不显著（P＞0.05），品种因素显著影响该基因组织间的表达（P＜0.05）。TRA2B可能在绵羊繁殖及脂质代谢中发挥重要作用。为深入研究TRA2B在绵羊中的基因功能提供了理论基础。
关键词：绵羊    TRA2B基因    克隆    生物信息学    mRNA表达    
Cloning, Sequence Information and Expression Analysis of TRA2B gene in Sheep (Ovis aries)
ZHAO Shuai-ping, JIAO Xiao-li, LI Liu-an, GUO Liang, TIAN Chuan-yao, WANG Ying, YANG Jing, ZHANG Pin-dong     
College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China
Abstract: The objective of this study was to explore the gene structure and function of TRA2B and characterize its expression and regulation properties in adipose and other tissues in two breeds of fat-tailed sheep. The coding sequence (CDS) of TRA2B gene was cloned using RT-PCR technology and the sequence was analyzed by bioinformatics. Eight rams from Guangling Large Tailed and Small Tailed Han respectively were slaughtered at 8 months of age, heart, liver, kidney, small intestine, testis, perirenal and tail fats as well as femoral biceps were collected to determine the mRNA expression by real-time PCR technology. The results showed that the CDS of ovine TRA2B gene was 867 bp in length, encoding 288 amino acids. The bioinformatics analysis suggested that TRA2B was a kind of unstable and hydrophilic protein with 2 potential O-glycosylation sites and 70 phosphorylation sites, while without signal peptide and transmembrane domain, a highly conserved domain of RRM was located at 109-196 amino acid residues in TRA2B. TRA2B mRNA expressed in all the investigated tissues and the highest expression was found in testis, which was significantly higher than that in kidney, perirenal and tail fats (P < 0.05) as well as in liver, femoral biceps and small intestine (P < 0.05), with the lowest level in heart (P < 0.05). The total mRNA expression between 2 breeds was not significantly different (P > 0.05), however, breed significantly affected the mRNA expression patterns in tissues (P < 0.05). Taken together, the findings in this study indicated that TRA2B was possibly an important regulation factor involving reproduction performance as well as lipid metabolism in sheep. The study would lay a theoretical foundation for further exploration of the gene function of TRA2B in sheep.
Key words: sheep     TRA2B gene     cloning     bioinformatics     mRNA expression    

选择性剪接是增加蛋白质多样性的重要机制之一[1]。丝氨酸精氨酸富集样(SR-like)蛋白家族选择性剪接因子(Transformer 2β，TRA2B)，与富含(A)GAA的外显子特异结合，激活外显子进入mRNA，导致外显子的选择性增加[2]。TRA2B是发育过程重要的剪接因子[3]，可调控多种组织如平滑肌、睾丸和神经元功能转录本的选择性剪接[4-5]，为小鼠胚胎与大脑发育所必需[6-7]。TRA2B是应激反应基因[8]，选择性剪接作用具有发育阶段性和组织特异性[3]。其同源蛋白果蝇TRA2调控精子发生和性别分化的选择性剪接[9]。TRA2B表达异常与人类癌症及神经病变等疾病有关[10]。

选择性剪接因子调控人类脂质代谢[11]，TRA2B基因在胰岛素抵抗的肥胖人群以及肥胖小鼠肝和肌肉中表达下调。TRA2B在HepG2细胞和C2C12肌细胞中基因沉默导致脂质生成基因的表达增加以及甘油三酯合成的增加，而过表达显著降低生脂基因的表达[12]。TRA2B对脂质的调控可部分归结于其对脂质代谢关键基因LPIN1的选择性剪接[12]。LPIN1基因编码脂质(Lipins)家族蛋白中的Lipin1，在脂质代谢中具有Mg2+依赖的磷脂酸磷酸酶活性，催化磷脂酸生成甘油二酯，以及调控脂质相关基因表达的双重功能[13]。TRA2B siRNA没有改变LPIN1总表达量，但改变了其剪接异构体的产生，导致LPIN1β增加而LPIN1α降低，而Lipinβ可促进脂肪合成基因表达[13]。研究发现乙醇干扰AML-12肝细胞中Lipin1信号途径，乙醇处理AML-12肝细胞导致TRA2B mRNA水平显著降低，Lipin1β mRNA表达上调以及LPIN1β/α显著升高[14]。TRA2B基因附近的一个多态位点与人体肥胖相关[15]。提示mRNA加工剪接基因可作为肥胖或脂质代谢候选基因进行研究。

TRA2B基因表达与脂质表型的生理相关存在不一致，TRA2B或LPIN1β表达水平在人肝活检中，并没有表现出与肥胖或肝组织病理学相关联[16]，可能与试验手段和生物不同有关[17]。本研究选择脂尾表型差异显著的广灵大尾羊和小尾寒羊为研究对象，克隆TRA2B基因CDS区并进行序列分析及功能预测，检测其mRNA在脂肪等不同组织中的表达差异性，为揭示该基因在绵羊脂质及其他代谢中的功能活性提供基础。

1 材料与方法 1.1 试验样本

选择相同饲养管理条件下的广灵大尾羊和小尾寒羊为研究对象，8月龄时屠宰取样，每品种4只公羊, 共8只，屠宰程序和饲养管理按照中华人民共和国国家标准(GB 13078-2001和GB/T 17237-1998) 和农业行业标准(NY 5148-2002-NY 5151-2002) 进行。屠宰后，迅速采集心、肝、肾、小肠、睾丸、肾周及尾部脂肪、股二头肌组织样品，锡纸包好，置于R Nase-free冻存管，并立即投入液氮罐中，随后-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂及仪器

RNAiso Plus总RNA提取试剂、PrimeScript® RT Master Mix反转录试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒、感受态细胞、pMD®18-T Vector购自宝生物工程(大连)公司；无水乙醇、异戊醇、三氯甲烷、DEPC、琼脂糖等试剂购自北京天根生化科技有限公司；PCR产物回收试剂盒(D6492, Omega)，KOD DNA聚合酶(KOD-201, Toyobo公司)。ABI7500实时荧光定量PCR仪(ABI，美国)。

1.3 试验方法 1.3.1 总RNA提取及RT-PCR反应根据RNAiso

Plus总RNA提取试剂说明书提取组织总RNA，通过核酸蛋白仪和凝胶电泳检测所提取总RNA的质量。参照反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，置于-20 ℃保存备用。

1.3.2 引物设计与合成

参照NCBI GenBank预测的绵羊TRA2B(XM_004003070) 以及牛TRA2B基因mRNA序列(NP_001029948.1)，应用Primer3.0在线软件设计扩增CDS区的特异性引物。参照扩增出的CDS设计荧光定量引物，选择RPL13A(XM_004015371) 和ACTB(NM_001009784.1) 作为内参基因，引物由苏州金唯智生物科技有限公司北京分公司合成。引物信息见表 1。

表 1 引物序列、退火温度及PCR产物长度 Table 1 Primer sequence, annealing temperature and PCR product size
1.3.3 RT-PCR扩增与TA克隆

以肾周脂肪组织cDNA为模板进行RT-PCR扩增，反应总体系为50 μL：10×KOD Buffer 5 μL，2 mmol·L-1 dNTPs 5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，KOD DNA聚合酶1 μL，ddH2O 36 μL。反应条件为94 ℃预变性3 min，35个循环：94 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，最后72 ℃修复延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，用PCR产物回收试剂盒回收目的片段。将回收产物与pMD®18-T载体连接，转化至E. Coli DH5α感受态细胞，37 ℃ LB培养基Amp抗性平板培养过夜。次日，挑取白色单一菌落于液体LB培养基中培养6~7 h长出菌落，菌落PCR扩增鉴定后，送苏州金唯智生物科技有限公司北京分公司测序。

1.3.4 结构与功能预测

应用DNAMAN7.0和Contig软件拼接序列，ApE软件预测开放阅读框(ORF)，并翻译CDS区成氨基酸序列。应用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)、SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)、NetOGlyc 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc-3.1/)、NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)、NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)在线软件分别预测蛋白质理化性质、信号肽、跨膜域以及O-糖基化、N-糖基化和磷酸化位点；应用PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)在线软件预测蛋白质二级结构；应用NCBI中的CDD数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)预测蛋白质功能结构域。

1.3.5 实时荧光定量PCR

参照SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒进行荧光定量PCR扩增，反应体系为20 μL，包括SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火及延伸30 s，40个循环；熔解曲线分析：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。每个样品每个基因3个重复。

1.3.6 数据分析

采用2-ΔΔCt相对定量分析方法，由2个内参基因获得的相对表达量计算几何平均数作为目的基因的相对表达量。运用SPSS17.0软件中的一般线性模型(GLM)进行单变量方差分析。考虑的影响因素为品种、组织，GLM为Yijk=μ+Bi+Tj+BTij+eijk。式中，Yijk为TRA2B基因mRNA相对表达量，μ为总体均值，Bi为第i个(i=1, 2) 品种效应，Tj为第j种(j=1, 2, …, 8) 组织效应，BTij为品种、组织二因素互作效应，eijk为残差效应。数据表示为“X±SX”，运用Duncan’s法多重比较分析各因素不同水平间的表达量差异。

2 结果 2.1 绵羊TRA2B基因克隆

凝胶电泳检测RT-PCR产物为特异性条带(图 1)，测序拼接后，获得TRA2B基因867 bp的ORF，应用NCBI中的Blastn程序与GenBank数据库预测的mRNA(XM_004003070) 进行序列比对，除289位AGT→CGT(Ser-Arg)，590位AAA→ACA(Cys-Thr)，675位GGA→GGG(Gly-Gly)3处不同外，其余核苷酸序列与预测序列一致。与家牛(Bos taurus(NM_001034776.2))、野猪(Sus scrofa(DQ972957.1))、人(Homo sapiens(NM_004593.2))、以及小鼠(Mus musculus(NM_009186.5))TRA2B基因CDS区相似性分别高达98%、96%、94%和90%，表明克隆获得的ORF为完整的CDS区(图 2)。核酸序列已提交GenBank(登录号：KT186101.1)。

M. DNA相对分子质量标准 M. DL2000 DNA marker 图 1 TRA2B基因RT-PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳 Figure 1 Agrose gel electrophoresis of RT-PCR amplification of TRA2B gene
阴影表示SR/RS(Ser/Arg或Arg/Ser)重复序列；下划线表示TRA2B蛋白RRM保守结构域氨基酸序列 Gray shadows refer to SR/RS (Ser/Arg or Arg/Ser) repeat sequences; Underline represents the peptide sequence of the RRM conserved domain of TRA2B protein 图 2 TRA2B基因CDS及编码氨基酸序列 Figure 2 Coding sequence of TRA2B gene and its encoding amino acid sequence
2.2 生物信息学分析 2.2.1 理化性质

绵羊TRA2B由288个氨基酸组成，分子式C1407H2225N519O444S6，分子质量33 707.72 u，理论等电点(pI)11.28，为碱性蛋白质。氨基酸残基中Arg (R)频率最高(22.6%)，Ser (S)频率为17.7%，Cys频率最低(0.7%)，不稳定系数为117.91，属不稳定蛋白质。在哺乳动物网织红细胞内的半衰期为30 h。脂溶指数为27.12，总平均亲水性为-1.619，为水溶性蛋白。

2.2.2 信号肽、跨膜域与翻译后修饰

预测绵羊TRA2B无信号肽和跨膜域，可能主要分布于细胞质或细胞器中。预测不存在N-糖基化位点，存在Thr33和Ser48两个潜在的O-糖基化位点以及48个Ser、8个Thr和14个Tyr共70个磷酸化位点，潜力值均大于0.5(图 3)。

图 3 预测的TRA2B蛋白O-糖基化(A)和磷酸化(B)位点 Figure 3 Predicted O-glycosylation (A) and phosphorylation (B) sites of TRA2B protein
2.2.3 结构域、氨基酸序列与二级结构

预测绵羊TRA2B蛋白109~196氨基酸残基为RRM_SF超家族结构域(图 4)，RRM是RNA识别模序。氨基酸序列分析发现，RRM结构域两侧肽链富集SR(Ser/Arg)重复序列(图 2)。二级结构包含8.68%α螺旋，8.33%β折叠和82.99%环；氨基酸残基溶剂可及性中埋藏态为13.89%，中间态为5.56%，暴露态为80.56%；1~105氨基酸残基有5个蛋白质结合位点，196~288氨基酸残基有16个蛋白质结合区域，而RRM中只有1个RNA结合位点。204~250氨基酸残基存在RNA、DNA与核酸结合位点。预测1~114、169~171、180、194~288氨基酸残基为无序结构。α螺旋、β折叠以及氨基酸残基溶剂可及性埋藏态主要位于RRM结构域，环及无序结构位于RRM侧翼肽链(图 5)。

图 4 TRA2B蛋白保守结构域预测 Figure 4 Predicted conserved domain of TRA2B protein
图 5 TRA2B蛋白二级结构预测 Figure 5 Predicted secondary structure of TRA2B protein
2.3 绵羊TRA2B基因mRNA的表达差异

方差分析表明(表 2)，TRA2B基因mRNA相对表达量在广灵大尾羊(1.332) 和小尾寒羊(1.511) 品种间差异不显著(P＞0.05)，品种与组织间的互作显著影响了mRNA表达(P＜0.05)，表现为小尾寒羊睾丸、肾、尾脂中的表达量高于广灵大尾羊的相应组织，而肾周脂肪、小肠、肝、心中的表达量无明显差异(图 6)。比较8种组织中mRNA表达丰度(表 2)，发现睾丸中(2.089) 表达量最高，显著高于肾、肾周脂肪、尾脂、小肠、股二头肌和肝中的表达量(P＜0.05)，心中表达量最低(P＜0.05)，肾周脂肪与尾脂中的表达量差异不显著(P＞0.05)。

表 2 TRA2B基因mRNA表达丰度及方差分析 Table 2 mRNA expression abundance and variance analysis of TRA2B gene
STH.小尾寒羊; GLT.广灵大尾羊; HE.心; LV.肝; KD.肾; SI.小肠; TS.睾丸; PR.肾周脂肪; TA.尾脂; FB.股二头肌 STH. Small Tailed Han sheep; GLT. Guangling Large Tailed sheep; HE. Heart; LV. Liver; KD. Kidney; SI. Small intestine; TS. Testis; PR. Perirenal fat; TA. Tail fat; FB. Femoral biceps 图 6 品种与组织二因素互作对TRA2B mRNA表达丰度的影响 Figure 6 Effects of two-way interaction between breed and tissue on TRA2B mRNA expression abundance
3 讨论 3.1 绵羊TRA2B基因序列分析

绵羊TRA2B基因CDS区长867 bp，含8个外显子，编码288个氨基酸，位于OAR1。与牛、猪、人、鼠TRA2B基因CDS相似性在90%以上，相似性较高，表明该基因在进化上高度保守。蛋白质半衰期与其稳定性密切相关，半衰期长则蛋白质稳定性高[18]。预测绵羊TRA2B具有较长的半衰期，却属于不稳定蛋白，是否与其广泛参与前体mRNA的选择性剪接有关尚待研究。

3.2 绵羊TRA2B蛋白结构与功能预测

RRM结构域为SR-like蛋白识别前体mRNA的区域[19]，预测绵羊TRA2B蛋白109~196氨基酸残基为RRM结构域，在该区域有RNA结合位点，表明RRM为绵羊结合前体mRNA进行选择性剪接的功能结构域。SR重复序列出现在人类大量的SR蛋白或SR-like蛋白中[20-21]，分析发现绵羊TRA2B蛋白RRM侧翼肽链富集SR重复序列，这与上述SR-like蛋白结构相符。TRA2B不仅在细胞核中发挥作用，激活选择性外显子的增加[3]，还可进入细胞质中发挥作用[22]，这与本研究预测绵羊TRA2B不存在信号肽和跨膜域，位于细胞质或细胞器中相一致。预测TRA2B存在2个O-糖基化位点，由于不含信号肽，不可能进入内质网(ER)发生糖基化作用。而O-糖基化除发生在高尔基体和ER中之外，在细胞质和细胞核中还存在单低聚糖O-GlcNAc(O-乙酰葡萄糖胺)方式，O-GlcNAc常发生在Ser/Thr残基并与磷酸化竞争[23]，进而对转录起调控作用[24]，推测可能存在O-糖基化位点。

预测绵羊TRA2B存在70个磷酸化位点，且主要分布于RRM侧翼序列，二级结构预测发现，大多数磷酸化位点以及2个O-糖基化位点位于无序结构，而无序结构为磷酸化和糖基化的热点区域[25]。SR模序在RNA剪接中可促进RRM与RNA结合[26]以及调节蛋白质间的互作[20]，进而在RNA剪接中发挥重要作用。SR模序预测为无序结构，磷酸化促其向有序结构转移[21, 27]。磷酸化调控TRA2B的亚细胞定位，且SR模序可能通过磷酸化依赖方式调控RRM与前体mRNA的互作[28]。因此，认为磷酸化位点和O-糖基化位点存在，在选择性剪接中发挥作用。二级结构预测发现RRM侧翼存在多个蛋白质、RNA、DNA及核酸结合位点，与SR模序功能相一致。绵羊TRA2B具有RRM保守功能域，生理功能保守。

3.3 绵羊TRA2B基因组织表达差异

TRA2B基因在小鼠不同组织中广泛均匀表达[5]。本研究TRA2B基因在绵羊8种组织中均有一定的表达量，表明TRA2B可能广泛参与绵羊不同组织的选择性剪接，表达量差异可能与TRA2B选择性剪接具有发育阶段性和组织特异性有关[3]。研究发现小鼠TRA2B通过调节Nasp基因外显子剪接进而在雄性生殖细胞中发挥调控作用[3]，绵羊TRA2B基因在睾丸中有高的表达量，可能与TRA2B调控绵羊精子发生有关。小尾寒羊睾丸表达量高于广灵大尾羊，是否与繁殖力或品种差异相关有待进一步研究。

TRA2B基因在肥胖人群以及肥胖小鼠肝和肌肉中表达下调[12]。本研究中尽管品种间的表达量差异不显著，但品种与组织间的互作显著影响了TRA2B基因表达，表现为小尾寒羊尾脂中的表达量高于广灵大尾羊。研究表明，TRA2B调控脂质关键基因LPIN1的选择性剪接[12]。TRA2B siRNA导致LPIN1β异构体表达增加，而LPIN1α异构体表达相应降低，lipinβ可促进脂肪合成基因的表达[13]。广灵大尾羊脂肪沉积较多，而小尾寒羊蓄脂能力弱[29]，LPIN1基因在广灵大尾羊和小尾寒羊尾脂和肾周脂肪中均有高的表达[30]。尾脂中TRA2B基因的表达差异可能与TRA2B参与调控绵羊脂质代谢有关。两品种中股二头肌、肾周脂肪、肝中TRA2B基因表达量无较大差异，可能与二品种绵羊8月龄适逢12月份，冬季牧草质量差影响脂质沉积有关。

4 结论

绵羊TRA2B基因CDS区长867 bp，编码288个氨基酸，TRA2B是一种不稳定的亲水性蛋白，无信号肽和跨膜域，有两个O-糖基化位点和70个磷酸化位点，含有RRM结构域，该基因高度保守。TRA2B基因在广灵大尾羊和小尾寒羊8个组织中的总表达量无显著差异，高表达于睾丸、肾、肾周脂肪及尾脂中，小尾寒羊睾丸、肾、尾脂中的表达量高于广灵大尾羊相应组织，可能与其参与调控繁殖性能及脂质代谢有关。

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