2. 国家北方山区农业工程技术研究中心, 保定 071000;
3. 河北省山区农业工程技术研究中心, 保定071000;
4. 河北工程大学 生命科学与食品工程学院, 邯郸 056000;
5. 唐山市畜牧工作站, 唐山 063000;
6. 安平县畜牧兽医站, 安平 053000;
7. 邢台市畜牧站, 邢台 054000
2. National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Baoding 071000, China;
3. Engineering Research Center for Agriculture in Hebei Mountainous Areas, Baoding 071000, China;
4. School of Life Science and Food Engineering, Hebei University of Engineering, Handan 056000, China;
5. Tangshan Animal Husbandry Station, Tangshan 063000, China;
6. Anping Animal Husbandry and Veterinary Station, Anping 053000, China;
7. Xingtai Animal Husbandry Station, Xingtai 054000, China
DKK1(Dickkopf1) 基因是DKKs家族中的一员,它所编码的DKK1蛋白为分泌型糖蛋白[1]。DKK1作为Wnt/β-catenin经典信号通路中的拮抗因子之一,能够与细胞膜表面受体LRP5/6(低密度脂蛋白受体相关蛋白5、6) 相互作用,从而在Wnt信号转导通路中起抑制作用[2];另外,当有Kremen存在时,还可形成内吞小体即DKK1-LRP-Kremen三元复合物,使膜表面LPR6消除,从而阻断经典的Wnt信号转导通路[3]。M. D. Phillips等[4]研究发现,DKK1基因能够通过抑制Wnt信号对早期心肌细胞增殖起重要的调节作用;该信号转导通路还参与其他多种重要的生物过程[5],当被异常激活时,可致使细胞异常增殖与分化,从而引起肿瘤的发生[6]。作为Wnt信号抑制剂的DKK1基因参与骨形成、骨代谢[7-8],在骨髓间充质干细胞、成骨、成脂分化的分子调节机制的研究中发现该基因的高表达有助于促进骨髓间充质干细胞成脂分化,抑制其成骨分化[9-10];同时,DKK1基因也参与胚胎发育、干细胞分化[11]、心血管疾病[12]、细胞凋亡[13]等多个过程。
C.X.Liu等[14]对猪DKK1基因进行了染色体定位,以及与胴体性状进行了关联分析,不仅发现该基因在猪的脾和淋巴组织中高表达,而且发现肌肉组织的生成与Wnt/β-catenin信号通路的活性密切相关。M.B.Kim等[15]研究发现,经典的Wnt信号通路在脂肪形成和肌细胞生成过程中发挥着重要作用,T.Andi等[16]的研究表明,Wnt信号通路也是毛囊、毛发生成所必须的信号通路,而且皮肤毛囊的密度主要受Wnt和DKK两个因子调控,Wnt信号若使皮肤中DKK1异位表达则会致使毛囊发育受阻。S.Sick等[17]采用过表达DKK1基因制备的转基因小鼠发现皮肤毛囊密度显著降低;而刘薇借助于转基因核移植方法,通过建立DKK1转基因克隆小型猪,以实现皮肤特异性过表达DKK1转基因无毛小型猪[18]。由此可知,DKK1基因参与毛囊、毛发生成的功能与该基因的表达量密切相关,然而目前关于DKK1基因相应的表达调控机制尚不清楚。
由于基因表达量的高低受多个水平的调控,其中转录水平的调控在基因表达中起着重要作用。为探索DKK1基因的转录调控机制,了解猪DKK1基因启动子的结构与活性,本研究通过对该基因的5′侧翼区序列进行特征分析、克隆,构建一系列缺失片段的pGL3-DKK1重组质粒,分别转染293T细胞和Hela细胞,采用双报告基因活性检测方法,鉴定DKK1基因的5′侧翼区序列的转录活性,并初步确定该基因的启动子区域,以及启动子的核心区域和主要调控区域,探索其可能的调控作用,为深入揭示DKK1基因的转录调控机制奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 载体与细胞载体pGL3-Basic和pRL-TK由本实验室保存;293T细胞和Hela细胞购自上海诺百生物科技有限公司。
1.1.2 试剂盒、工具酶及其他试剂TailGen DNA Kit,金牌超量无内毒素质粒大提试剂盒GoldHi EndoFree Plasmid Maxi Kit,DM2000 Plus DNA Marker购自康为世纪公司;Trans5α Chemically Competent,Trans Taq-T DNA Polymerase和T4 DNA Ligase等常用分子生物学试剂均购自于北京TransGen生物技术有限公司;SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒和SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司;限制性内切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ均购自TaKaRa公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒Dual-Luciferase ReporterAssay System购自Promega公司;LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent购自IVGN公司;Hyclone SH30023.01B DMEM培养基购自Thermo公司;胎牛血清(Fetal Bovine Serum/FBS)购自Biowest公司。引物合成和测序均由北京华大科技公司完成。
1.1.3 分子生物学分析软件基因序列数据库:Ensembl数据库(http://www.ensembl.org/index.html);PCR引物设计软件:Primer Premier 5.0;序列分析软件:DNAMAN,BioEdit7.0;基因启动子分析软件:Promoter 2.0 Prediction Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/),PromoterScan (http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/),MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi),AliBaba2.1 (http://www.gene-regulation.com/pub/programs.html)。
1.2 试验方法 1.2.1 猪DKK1基因启动子预测利用Promoter Scan软件预测DKK1基因核心启动子的位置,利用MethPrimer软件预测基因序列中的CpG岛。
1.2.2 猪DKK1基因启动子不同片段的获取根据Ensembl数据库检索并下载猪DKK1基因(ENSSSCG00000010428) 的参考序列,以5′ UTR上游序列约2 500 bp为模板,利用Primer Premier 5.0软件设计引物扩增包含DKK1基因启动子区片段。根据pGL3-Basic质粒的多克隆位点信息,设计5条上游引物和1条下游引物,分别在上下游引物5′端加上合适的限制性内切酶酶切位点,其中下游引物均为pGL3+292,分别扩增5′端为-2 016、-1 679、-953、-586、-215的片段。构建载体片段的引物序列详见表 1。
大白猪耳组织DNA提取参照基因组提取试剂盒说明书进行。采用PCR方法以基因组DNA为模板,扩增猪DKK1基因启动子区长片段,PCR反应体系为:10×buffer 2.5 μL,2.5 mmol·L-1 dNTPs 2.0 μL,P-2016/+292上、下游引物(10 pmol·μL-1)各1.0 μL,模板DNA1.0 μL,Trans Taq-T DNA聚合酶(5 U·μL-1) 0.7 μL,加ddH2O至25.0 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,退火温度(表 1)退火30 s,72 ℃延伸2 min,34个循环;72 ℃延伸10 min。PCR产物纯化后经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,送华大科技公司进行测序。采用巢氏PCR方法,以扩增出的猪DKK1基因启动子区长片段为模板,扩增其他不同长度的片段,PCR各反应体系同上、反应条件见表 1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测,纯化后直接测序。
1.2.3 pGL3-DKK1启动子不同长度片段重组载体的构建利用PCR产物纯化试剂盒对带KpnⅠ和Hind Ⅲ内切酶位点的PCR产物进行纯化,利用限制性内切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ对pGL3-Basic质粒进行双酶切后与PCR产物进行连接、转化、菌液PCR鉴定、质粒DNA提取,并对质粒DNA进行酶切鉴定后,分别命名:pGL3-2016/+292,pGL3-1679/+292,pGL3-953/+292,pGL3-586/+292,pGL3-215/+292,送华大科技公司进行测序。
1.2.4 细胞培养及转染细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养,并置于37 ℃含5% CO2的培养箱中培养。在转染前1 d,将生长状态良好的细胞接种于24孔板,每孔约1×105个细胞,培养过夜,采用LipofectamineTM 2000转染细胞,具体步骤参照产品说明书进行。
1.2.5 荧光素酶报告基因检测将含不同长度启动子片段的pGL3-DKK1质粒分别转染293T细胞及Hela细胞,每个样品均设3个重复。细胞培养过夜后换液,并继续培养36 h,裂解细胞,使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒,利用化学发光仪(Promega)测定荧光素酶活性。
1.2.6 数据分析对各组试验重复数据计算平均值及标准差,采用单因素方差分析检验不同片段酶活性的差异性,Duncan’s检验法进行多重比较。数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析。
2 结果 2.1 DKK1基因启动子生物信息学分析利用启动子分析软件对猪DKK1基因启动子序列特征信号进行了分析,发现该序列具有真核生物启动子典型的TATA-box,其中在-1 638~-1 628 bp (GTATAAATAGA)处存在TATA-box特征序列;转录起始位点(TSS)位于-1 608 bp处,两者间隔30个碱基,相距较近。此外在该启动子区域还发现可能存在的主要转录因子:CTF/NF-1、TFIID、Oct-2、Ig-cd、HNF1、AP-1、AP-2、Sp1、T-Ag、JCV-repeated-sequence、EARLY-SEQ1、CAC-BP等,而且转录因子TFIID和Sp1分布较集中。利用MethPrimer软件预测发现该基因的-29~+75 bp处存在一个104 bp的CpG岛(图 1)。
通过PCR扩增出猪DKK1基因启动子5′端5个不同长度片段,PCR产物分别经1%琼脂糖凝胶电泳检测,其结果与预期片段大小一致(图 2)。
利用Trans Taq-T DNA聚合酶,分别以各个重组质粒为模板,与相对应表 1中引物分别进行PCR扩增,经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,结果均与各预期片段大小一致(图 3A)。经双酶切鉴定,结果显示各重组质粒均产生pGL3-Basic载体片段(4 818 bp)及各自相应的片段(图 3B)。经测序、序列比对确定为目的片段,因而,猪DKK1基因启动子缺失片段的荧光素酶报告基因载体构建成功。
由上述所构建的5个质粒和pGL3-Basic质粒分别与pRL-TK共转染293T细胞和Hela细胞,其中pGL3-Basic质粒作为阴性对照,利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定各个质粒萤火虫荧光素酶和内对照海肾荧光素酶活性,由图 4可知,猪DKK1基因启动子不同长度片段荧光素酶的转录活性在两种细胞中的变化趋势几乎相同,但各个递减片段在两种细胞中所对应的启动子活性存在较大差异,在293T细胞中的启动子活性远远高于在Hela细胞中的活性,说明DKK1基因启动子对293T细胞具有偏好性。
猪DKK1基因启动子不同片段在293T细胞中具有不同的启动子活性,利用双荧光素酶检测试剂盒分析的启动子活性由强到弱依次为pGL3-1679/+292 bp、pGL3-2016/+292 bp、pGL3-215/+292 bp、pGL3-586/+292 bp、pGL3-953/+292 bp、pGL3-Basic(图 5),除527和898 bp的启动子活性不存在显著差异外(P>0.05),其他片段间均呈极显著差异(P<0.01),因而推测在5′UTR的上游区域可能存在一些重要调控元件,其中-586~-953 bp、-1 679~-2 016 bp区域可能存在负调控元件,-953~-1 679 bp区域可能存在正调控元件。
真核生物的基因表达调控是一个极为复杂的过程,涉及转录水平、加工水平、翻译水平及翻译后水平的调控。由于转录水平的调控是基因表达的起始步骤,它决定着基因是否能够被转录以及转录的效率,同时也是顺式作用元件和众多反式作用因子之间相互作用的结果,因而转录水平的调控是基因表达过程中尤为重要的一步,对于真核基因转录水平调控的研究最多的是关于启动子的研究[19]。
目前生物信息学分析和表达载体的构建是研究启动子核心区域和调控区域的常用方法,万雷等[20]通过构建过表达重组腺病毒载体来研究DKK1基因的功能。基因启动子的分析通常采用荧光素酶报告系统,如通过构建pGL3报告基因载体来检测目的基因启动子活性,该方法是基于高度敏感的化学发光或放射性来检测,不仅简便且灵敏度高[21]。本研究首先通过生物信息学分析软件对启动子区序列进行初步预测,再以不含启动子和增强子,而含有荧光素酶基因的pGL3-Basic为载体,根据预测结果进一步构建5′端不同缺失片段的启动子报告基因表达载体,以表达海肾荧光酶的PRL-TK为内参共转染细胞,并采用双荧光素酶检测系统测定两种荧光素酶基因的表达,进而对调控序列做出快速分析。
曹贵玲等采用同源克隆的方法获得了山羊DKK1基因,该基因包含4个外显子和3个内含子,与其他哺乳动物有较高的同源性[22]。C.X.Liu等研究表明猪DKK1基因定位于染色体14q25-26[14],本试验通过生物信息学分析发现,DKK1基因启动子序列中含真核生物启动子所具有的典型TATA-box和多种转录因子,而且转录起始位点(TSS)位于-1 608 bp处,与TATA-box相距较近,两者间隔30个碱基;通过荧光素酶活性分析,初步证明了DKK1基因启动子片段具有转录活性,并且-1679/+292 bp的启动子活性最强,结合生物信息学分析结果进一步确定-953~-1 679 bp为核心启动子区域。
根据荧光素酶活性检测结果发现,猪DKK1基因在两种细胞中的启动子活性的强弱并不随着片段长度的增加而增强,即最长的启动子片段并不具有最高的活性,说明在-2 016~+292 bp区域中既存在着对该基因的转录起正调控的元件也存在着起负调控作用的因子。通过生物信息学方法对主要的负调控序列-1 679~-2 016 bp和-586~-953 bp进行分析,发现-1 679~-2 016 bp区域存在CTF/NF-1及多个TFIID、NF-1转录因子结合位点,-586~-953 bp区域主要含有GATA-1、Oct-1、Sp1、HOXA4等多个转录因子结合位点。对正调控区域-953~-1 679 bp进行分析,主要转录因子结合位点有TBP、AP-1、ARP-1、Oct-1、SP1、ATF、C/EBPalp、GATA-1、YY1、C/EBPbeta、NF-κB、MEB-1、CRE-BP1。
转录因子不仅能够控制基因的表达,而且是调节各种生理活动的关键环节,其中Sp1作为基本转录因子,其结合位点分布广泛。研究发现,Sp1不仅可以通过C末端的结构域与TFIID相互作用,而且多种转录因子如TBP、YY1也可参与Sp1的转录活性调节[23],W.Y.Lui等[24]研究结果显示,Sp1能够与人的KCTD10基因启动子区结合,进而调控该基因的表达。此外,Sp1对转录调控区的GC盒有很强的亲和力,参与细胞的分化、增殖及凋亡过程[25]。GATA-1属于锌指蛋白,可通过与启动子中(A/T) GATA(A/G)模序结合后激活基因的转录,在细胞分化和增殖中扮演重要角色[26]。存在于负调控区域的转录因子结合位点中,HOXA4是同源异型基因(HOX)家族中的成员之一,在动物胚胎期和胎儿的皮肤及毛囊中广泛表达[27]。目前关于DKK1转基因获得的无毛小鼠是受人皮肤特异性的K14启动子调控,使得皮肤特异性过表达DKK1基因从而导致小鼠毛发发育受阻。但是关于该基因转录调控方面的研究较少,因此不能有效解析DKK1基因启动子区转录调控元件在毛囊、毛发生成过程中的具体作用。
本研究通过预测与试验分析,初步在细胞水平上证明猪DKK1基因5′侧翼区具有启动子活性,由于基因的转录往往受到多种调控元件的协同作用,但具体是通过哪些顺式作用元件或反式作用因子发挥作用,仍需通过点突变、电泳迁移率变动分析与染色质免疫沉淀等方法进一步研究转录因子与DKK1基因启动子区的作用机制。
4 结论本试验通过对DKK1基因进行生物信息学分析并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了DKK1基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性,并初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究DKK1基因转录调控机制奠定基础。
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