近20年来，大量畜牧工作者致力于抗生素替代品的研究和开发。使用无公害、无残留的绿色饲料添加剂来替代饲用抗生素已经成为国内外近年研究的热点。先后开发出多种具有潜在替代饲用抗生素的产品^[1]。其中，植物提取物在抗菌、调节动物免疫力等方面较其他替代品更具开发价值和应用前景^[2]。

核桃(Juglans regia L.)青皮，又称青龙衣，为核桃外部包裹的绿色果皮。I. Oliveira等^[3]报道核桃青皮提取物对蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等革兰阳性菌具有明显的抑制作用，对大肠杆菌(Escherichia coli)、克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)等革兰阴性菌和白色念珠菌(Candida albicans)、新生隐球菌(Cryptococcus neoformans)等真菌均无抑制活性。而吕海宁等^[4]报道，金黄色葡萄球菌和深红酵母(Saccharomyces rubrum)对核桃青皮提取物不敏感，但提取物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有显著的抑制作用。此外，核桃青皮提取物还具有较强的自由基清除能力，乙酸乙酯提取物的自由基清除能力最强，而氯仿提取物的自由基清除能力最弱；同时，自由基清除能力也与提取物浓度成正相关^[5]。由此可见，核桃青皮提取物可能具有替代饲用抗生素的作用，但是其抗菌作用受多个因素影响，其中提取溶剂是重要因素。

本研究以新疆核桃青皮为研究对象，采用不同溶剂提取其活性成分，并对其抗氧化活性和抑菌能力进行研究，以期为开发新的抗生素替代品奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料及试剂

选取产自新疆阿克苏地区核桃“温185”，成熟后将核桃青皮剥离，放入电热鼓风干燥箱中50 ℃烘干至恒重，烘干后粉碎过100目筛，储存备用。大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为本实验室保存。

1.2 核桃青皮提取物的制备

称取核桃青皮，分别以蒸馏水以及甲醇、乙醇和丙酮的水溶液为提取溶剂(有机溶剂体积分数均为25%、50%、75%和100%)，料液比为1:10，分别在37 ℃水浴摇床浸提8和12 h，之后经4层纱布过滤获得相应核桃青皮提取物。

1.3 核桃青皮提取物中总酚和黄酮含量的测定

总酚含量采用Fohn-Ciocalteu比色法测定^[6]。取核桃青皮提取物稀释液1.0 mL，加入1.0 mL Fohn-Ciocalteu试剂充分混合后加入3.0 mL 12.5%碳酸钠溶液，再加入5.0 mL蒸馏水，于30 ℃水浴反应60 min后于764 nm处测定吸光值，以没食子酸(GAE)为标准品测定总酚含量，样品总酚含量以GAE相当值表示。GAE相当值$ \left( {{\rm{mg}} \cdot {{\rm{g}}^{ - 1}}} \right) = \frac{{X \times 50 \times V}}{W} $，其中X为标准曲线计算的总酚浓度(mg·mL^-1)，50是提取物稀释倍数，V是提取物总体积(mL)，W是核桃青皮风干重(g)。

采用Al(NO₃)₃比色法测定核桃青皮中总黄酮含量^[7]。取1.0 mL提取液，加入80%的乙醇溶液至10.0 mL。加入5% NaNO₂溶液1.0 mL摇匀，放置6 min，再加入10% Al(NO₃)₃溶液1.0 mL摇匀，放置6 min，最后加入10% NaOH溶液10.0 mL，用蒸馏水定容至25.0 mL，摇匀放置15 min，在510 nm处测定吸光度值。以芦丁为标准品计算测定总酚含量。总黄酮含量$ \left( {{\rm{mg}} \cdot {{\rm{g}}^{ - 1}}} \right) = \frac{{m \times {V_2}}}{{{V_1} \times W}} $，其中m为标准曲线计算的总黄酮质量(mg)；V₁为测试时提取液的取样体积(mL)，V₂为提取物总体积(mL)，W为核桃青皮风干重(g)。

1.4 核桃青皮提取物抗氧化活性的测定

还原能力采用普鲁士法^[8]测定。取核桃青皮提取液1.0 mL，加入2.5 mL 0.2 mol·L^-1 pH 6.6磷酸盐缓冲液和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液，充分混匀后于50 ℃水浴反应20 min后加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀后于3 000 r·min^-1离心10 min，取上清液2.5 mL加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液混匀，静置10 min后于700 nm处测定吸光值(OD_{700 nm})。以OD_{700 nm}表示核桃青皮提取物的还原能力。

采用2, 2-二苯基-1-苦肼基(2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)法测定自由基清除率^[9]。取核桃青皮提取液0.3 mL和0.1 mol·L^-1 DPPH乙醇溶液2.7 mL混匀后于黑暗中静置30 min后于517 nm处测定吸光值OD_S；同时，取0.3 mL提取液和2.7 mL相应提取溶剂按照上述操作测定吸光值OD₀；此外，再取0.3 mL相应提取溶剂和2.7 mL DPPH溶液按照上述操作测定吸光值OD_DPPH。自由基清除率＝$ \frac{{{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{DPPH}}}} - \left( {{\rm{O}}{{\rm{D}}_{\rm{S}}} - {\rm{O}}{{\rm{D}}_{\rm{0}}}} \right)}}{{{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{DPPH}}}}}} \times 100\% $。

1.5 核桃青皮提取物抑菌活性测定 1.5.1 核桃青皮提取物抑菌圈直径的测定

将获得的提取物于55 ℃下旋转蒸发制备提取浸膏，55 ℃烘干至衡重后用相应溶剂稀释至200 mg·mL^-1备用。采用牛津杯法测定提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径^[10]。在90 mm培养皿中加入灭菌未凝固LB固体培养基15 mL，凝固后将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中。取100 μL浓度为10⁸ CFU·mL^-1的细菌悬液加至55 ℃的5 mL LB固体培养基中，充分混匀后均匀平铺至上述培养基顶层。吸取稀释后的提取物溶液100 μL至牛津杯中，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h，用十字交叉法测量抑菌圈直径。空白对照以100 μL相应提取溶剂代替提取物溶液，阳性对照以100 μL浓度为100 μg·mL^-1的氨苄青霉素钠溶液代替提取物溶液，其他操作与上述相同。每个处理设置3个重复。

1.5.2 核桃青皮提取物最小抑菌浓度(MIC)

采用宫毓静等^[11]的微量稀释法测定提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC。取稀释后的提取物溶液0.5 mL加入55 ℃灭菌LB固体培养基1.0 mL充分混匀，使提取物的终质量浓度分别为66.67、33.33、16.67、8.33、4.17、2.08、1.04、0.52、0.26 mg·mL^-1。移取上述培养基200 μL加至无菌96孔板。待培养基凝固后，向每个孔中加入10⁸ CFU·mL^-1的细菌悬液20 μL，于37 ℃培养24 h。以培养后未见细菌生长的最低浓度为抑制该细菌的MIC。空白对照以0.5 mL相应提取溶剂代替提取物溶液，阳性对照以0.5 mL质量浓度为100 μg·mL^-1的氨苄青霉素钠溶液代替提取物溶液，其他操作与上述相同。每个处理设置3个重复。

1.5.3 核桃青皮提取物抑菌率的测定

采用周子雄等^[12]和陈默等^[13]的方法测定抑菌率。取25%乙醇浸提8 h的提取浸膏，用25%乙醇梯度稀释至100、50、25和12.5 mg·mL^-1备用。取20.0 mL无菌LB液体培养基，冷却后加入20 μL浓度为108 CFU·mL^-1处于对数生长期的细菌悬液，振荡混匀。试验孔：取1.0 mL上述接种有细菌的培养基，加入100 μL提取物溶液，混匀后取200 μL加至平底96孔板中。提取物在培养基中的终质量浓度分别为9.09、4.55、2.27和1.14 mg·mL^-1。空白孔：取1.0 mL接种有细菌的培养基，加入100 μL提取溶剂，混匀后取200 μL加至96孔板中。阴性对照孔：取200 μL液体培养基加至96孔板中，以观察培养基污染情况。阳性对照孔：取1.0 mL接种有细菌的液体培养基，加入100 μL 100 μg·mL^-1氨苄青霉素钠溶液，混匀后取200 μL加至96孔板中。将96孔板于37 ℃培养24 h后用Infinite M200酶标仪于600 nm处测定其光密度值(OD)。抑菌率(%)＝$ \frac{{\left( {{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{C}}\left( {24} \right)}} - {\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{C}}\left( 0 \right)}}} \right) - \left( {{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{T}}\left( {24} \right)}} - {\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{T}}\left( 0 \right)}}} \right)}}{{\left( {{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{C}}\left( {24} \right)}} - {\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{C}}\left( 0 \right)}}} \right)}} $×100%，其中OD_C(24)为空白孔培养24 h时的吸光值，OD_C(0)为空白孔培养0时的吸光值，OD_T(24)为试验孔培养24 h时的吸光值，OD_T(0)为试验孔培养0时的吸光值。每个处理重复3孔。

1.6 数据统计分析

使用SPSS 18.0软件进行统计分析，采用一般线性模型进行单响应变量多因素方差分析，数据模型为X_ij＝μ＋α_i＋β_j＋ε_ij，其中X_ij为观察值，μ为总体均值，α_i(i＝1…5) 为浓度效应，β_j(j＝1, 2) 为提取时间效应，ε_ij为误差。当因素水平达到显著后采用Duncan's法多重比较。显著水平为P≤0.05。

2 结果 2.1 不同提取溶剂对核桃青皮提取物总酚含量的影响

由表 1可知，从甲醇和乙醇来看，当体积分数达到25%时，总酚含量最高，并极显著高于其他体积分数(P＜0.01)，随着甲醇和乙醇体积分数的升高，总酚含量极显著下降(P＜0.01)。与丙酮溶液相比，蒸馏水提取物中的总酚含量显著高于其他丙酮溶液获得的提取物(P＜0.05或P＜0.01)，当丙酮体积分数超过50%后，提取物中的总酚含量急剧下降(P＜0.01)。从提取时间来看，甲醇和丙酮溶液均以提取12 h更好(P＜0.01)，而乙醇溶液则提取8 h更好(P＜0.05)。综合来看，以25%乙醇溶液提取8 h获得的提取物中总酚含量最高。

2.2 不同提取溶剂对核桃青皮提取物总黄酮含量的影响

由表 2可知，蒸馏水提取物中的总黄酮含量极显著高于甲醇提取物(P＜0.01)，25%乙醇和25%丙酮提取物中的总黄酮含量显著高于同组其他处理(P＜0.05和P＜0.01)。当总黄酮含量达到最高值后，随着甲醇、乙醇和丙酮体积分数的升高，总黄酮含量均极显著下降(P＜0.01)。从提取时间来看，甲醇和乙醇溶液均以提取8 h更好(P＜0.05)，丙酮溶液则无显著差异(P＞0.05)。综合来看，以25%乙醇溶液提取8 h获得的提取物中总黄酮含量最高。

2.3 不同提取溶剂对核桃青皮提取物抗氧化活性的影响 2.3.1 不同提取溶剂对核桃青皮提取物还原能力的影响

由表 3可知，从甲醇和乙醇来看，当溶剂体积分数达到25%时，提取液的还原能力均最高，并极显著高于同组其他处理(P＜0.01)；随着溶剂体积分数的进一步增加，提取液的还原力均极显著下降(P＜0.01)。蒸馏水提取物的还原力极显著高于丙酮溶液获得的提取物还原力(P＜0.01)。从提取时间来看，对甲醇和乙醇溶液而言，提取8或12 h对还原力均无显著影响(P＞0.05)；丙酮溶液则以提取8 h更好(P＜0.05)。综合来看，以25%乙醇提取8 h获得的提取物还原能力最强。

2.3.2 不同提取溶剂对核桃青皮提取物DPPH自由基清除率的影响

如表 4所示，从甲醇来看，当溶剂体积分数为0%~50%时，提取物的DPPH自由基清除率极显著高于同组其他处理(P＜0.01)；进一步增加甲醇体积分数后，提取物DPPH自由基清除率极显著下降(P＜0.01)。25%~50%乙醇提取液其DPPH自由基清除率极显著高于其他乙醇溶液的提取物(P＜0.01)；从丙酮溶液来看，75%丙酮提取液DPPH自由基清除率极显著高于其他丙酮溶液的提取物(P＜0.01)。从提取时间来看，甲醇溶液以提取8 h更好，而提取时间对乙醇和丙酮提取物的自由基清除率无显著影响(P＞0.05)。总的来看，75%丙酮提取物的DPPH自由基清除率最高。

2.4 不同提取溶剂对核桃青皮提取物抑菌活性的影响 2.4.1 抑菌圈直径

在试验中，空白对照均未产生可测量的抑菌圈，而氨苄青霉素则产生了明显的抑菌圈，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径分别到达20.20、25.16和22.30 mm，明显大于核桃青皮提取物生产的抑菌圈。如表 5所示，所有提取物对3种受试菌均有一定的抑菌作用。在甲醇提取物中，50%的甲醇溶液提取物对大肠杆菌的抑菌圈直径显著大于蒸馏水、25%和100%甲醇溶液提取物(P＜0.05或P＜0.01)。25%的乙醇提取物对大肠杆菌的抑菌圈直径极显著大于同组其他处理(P＜0.01)。25%的丙酮提取物对大肠杆菌的抑菌圈直径显著大于蒸馏水、50%和100%丙酮提取物(P＜0.05或P＜0.01)。从提取时间来看，丙酮溶液以提取12 h更好(P＜0.01)，而乙醇溶液则以提取8 h更好(P＜0.05)。

50%的甲醇溶液提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径极显著大于蒸馏水、25%和100%甲醇溶液提取物(P＜0.01)。25%乙醇溶液和25%及50%丙酮溶液提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌直径显著大于同组其他处理(P＜0.05或P＜0.01)。甲醇和丙酮溶液以提取12 h较好(P＜0.05或P＜0.01)，而乙醇溶液提取8 h更好(P＜0.01)。

核桃青皮提取物对枯草芽孢杆菌的抑制与其他两种细菌略有不同。随着甲醇浓度的提高，提取物对枯草芽孢杆菌的抑制作用显著增强(P＜0.05)，当甲醇的浓度达到100%时产生的抑菌圈最大。25%乙醇提取物对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强，之后随着乙醇浓度的提高，抑菌圈的直径极显著减小(P＜0.05或P＜0.01)。丙酮提取物对枯草芽孢杆菌也具有较强的抑制作用，随着丙酮浓度的提高，抑菌圈的直径极显著增大(P＜0.01)，并在丙酮浓度达到75%时达到最大值；进一步增加丙酮浓度，抑菌圈的直径开始显著下降(P＜0.05)。从提取时间来看，甲醇和乙醇溶液提取8 h较12 h具有更强的抑制枯草芽孢杆菌的作用(P＜0.01)；而对于丙酮溶液而言，两个提取时间对枯草芽孢杆菌的抑制无显著差异(P＞0.05)。从抑菌圈直径来看，25%乙醇8 h提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用最好。

2.4.2 MIC

如表 6所示，甲醇、乙醇、丙酮的体积分数及提取时间对大肠杆菌的MIC均有显著的影响(P＜0.01或P＜0.05)。50%甲醇、25%乙醇和25%丙酮提取物在同组处理中MIC最小。甲醇和乙醇溶液12 h提取物对大肠杆菌具有更低的MIC，而丙酮溶液则相反(P＜0.05)。

与丙酮提取物相比，甲醇和乙醇提取物对金黄色葡萄球菌具有更强的抑菌活性。其中，75%甲醇提取物、25%乙醇提取物的MIC在同组中均最小，并显著低于同组其他处理(P＜0.01)。提取时间对甲醇提取物的MIC无显著影响(P＞0.05)，乙醇溶液12 h提取物对金黄色葡萄球菌具有更低的MIC，而丙酮溶液则相反(P＜0.05)。

与金黄色葡萄球菌相似，75%甲醇提取物、25%乙醇提取物对枯草芽孢杆菌的MIC在同组中最小，并显著低于同组其他处理(P＜0.05或P＜0.01)，而丙酮提取物虽然对枯草芽孢杆菌有一定抑菌活性，但MIC明显高于甲醇和乙醇提取物的MIC。此外，提取时间对甲醇和乙醇溶液提取物MIC均无显著影响(P＞0.05)，而丙酮溶液8 h提取物对枯草芽孢杆菌具有相对较低的MIC(P＜0.05)。

综合来看，25%乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均具有较强的抑菌作用。

2.4.3 抑菌率

如表 7可知，当提取物终质量浓度为9.09 mg·mL^-1时对金黄色葡萄球菌的抑制率显著高于对大肠杆菌的抑制率(P＜0.05)。随着提取物质量浓度在培养基中降低，对受试细菌的抑制率明显下降。与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌相比，当提取物终质量浓度为4.55和2.27 mg·mL^-1时可极显著抑制枯草芽孢杆菌(P＜0.01)；当提取物质量浓度降低到1.14 mg·mL^-1时，对3种受试细菌的抑制率均无显著影响(P＞0.05)。100 μg·mL^-1的氨苄青霉素对3种受试菌均具有较强的抑制率。9.09 mg·mL^-1的提取物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率以及4.55 mg·mL^-1的提取物对枯草芽孢杆菌的抑制率与氨苄青霉素相当。以上结果表明，核桃青皮提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌活性强于对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制。

3 讨论 3.1 核桃青皮提取物的抗氧化活性

核桃青皮中含有多种活性成分，通过GC-MS、HPLC-TMS等技术，大量活性成分从核桃青皮、树叶、树皮、核桃分心木中被分离和鉴定，包括45种挥发性成分、27种酚类以及胡桃醌等化合物，其中主要活性成分有萘醌类、多酚类、黄酮类、萜类等活性成分^[14-16]。多酚是核桃青皮中重要的抗氧化物质。核桃叶片中的主要多酚化合物有鞣花酸，其次是反式肉桂酸、绿原酸和咖啡酸^[17]。S. N. Cosmulescu^[18]从核桃青皮中鉴定出6种多酚类化合物，其中香草酸和丁香酸的含量较高。核桃青皮提取物的还原力和自由基清除能力与提取物中的总酚含量密切相关，总酚含量越高还原力的EC₅₀值越低^[3]。研究表明，多酚是良好的电子和氢原子供体，通过稳定自由基和活性氧而终止自由基链反应，从而起到还原作用^[19]。A. Fernández-Agulló等^[20]报道，以50%乙醇溶液获得的核桃青皮提取物，其总酚含量最高，还原力和自由基清除能力最强。黄酮是一类很强的抗氧剂，核桃叶中主要的黄酮类化合物有杨梅素、儿茶素和芦丁^[17]。研究发现，杨梅素、儿茶素和芦丁菌具有较好的抗氧化活性^[21-22]。在本研究中以25%乙醇为提取溶剂提取8 h获得的总酚和总黄酮均含量最高，同时其还原力和DPPH自由基清除率在各组中也最高。

在本试验中，不同提取溶剂核桃青皮提取物的抗氧化性能存在明显差异，其中还原力25%乙醇＞25%甲醇＞水＞50%丙酮。I. Oliveira等^[3]报道，乙酸乙酯提取物的自由基清除能力最强，而氯仿提取物的自由基清除能力最弱。由于萃取溶剂的理化性质不同，所得化合物的极性亦不同^[23]，酚类化合物的提取通常采用有机溶剂^[24]。从本研究的结果来看，醇和水的混合物在提取具有抗氧化活性的化合物方面比其他相应的溶剂系统更有效。此外，这些结果表明，基于相似相溶原理，存在于核桃青皮上的酚类化合物具有中等极性特征。

3.2 核桃青皮提取物的抑菌活性

核桃青皮提取物对多种细菌和真菌的生长具有抑制作用。不同溶剂提取物的抑菌作用存在明显差异。吕海宁等^[4]首先用80%乙醇对核桃青皮回流提取，获得的浸膏再分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇进行二次萃取；抑菌试验表明，核桃青皮提取物并不抑制金黄色葡萄球菌和深红酵母，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌则有显著的抑制作用；核桃青皮各极性组分对大肠杆菌的抑制效果为氯仿＞乙酸乙酯＞石油醚＞正丁醇＞水。活性最高的氯仿组分对枯草芽孢杆菌的MIC为62.5 mg·L^-1。张卫星等^[6]研究发现，核桃青皮乙酸乙酯提取相对细菌有较强的抗菌作用，而石油醚相对真菌有较强的抗菌作用。在本研究中，25%乙醇提取物对受试菌具有最强的抑制作用。本实验室前期研究表明氯仿以及乙酸乙酯提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均无抑制作用，这可能与提取工艺和参数不同有关。

此外，核桃品种是影响抑菌作用的另一个因素。由于品种不同，含有的活性成分有较大的差别。I. Oliveira等^[3]发现产自葡萄牙的5个核桃品种青皮水提取物(提取物质量浓度为100 mgmL^-1)对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌等革兰阳性菌具有明显的抑制作用，而对大肠杆菌、克雷伯杆菌等革兰阴性菌和白色念珠菌、新生隐球菌等真菌均无抑制活性。在所有的受试菌中金黄色葡萄球菌对提取物最敏感，MIC为0.1 mg·mL^-1。J. A. Pereira等^[25]发现来源于Lara品种的核桃仁提取物对革兰阳性菌(蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌)抑制作用较强，对蜡样芽胞杆菌的MIC为1 mg·mL^-1，对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC为0.1 mg·mL^-1，而来源于Franquette品种的提取物对金黄色葡萄球菌的MIC为100 mg·mL^-1。此外，生长环境、采摘时间、植株部位等均影响核桃活性成分含量^[26]。

核桃青皮提取物的抗菌作用与胡桃醌等活性成分有关。研究已证明胡桃醌、多酚、黄酮类等活性成分具有抗菌作用。黄酮类化合物特别是异黄酮化合物具有很强的抗菌作用。金银花中的总黄酮对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有强烈的抑制作用，其活性分别是绿原酸的4倍和2倍^[27]。

4 结论

以不同溶剂获得的核桃青皮提取物均具有一定的抗氧化作用和抑菌活性，其中以25%乙醇提取8 h获得的核桃青皮提取物总酚和黄酮含量最高，还原能力最强，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的抑菌活性最强。