2. 国家民委青藏高原动物 疫病防控创新团队, 成都 610041;
3. 金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司, 厦门 361000
2. Innovative Research Team on Animal Disease Prevention and Control of Qinghai Tibet Plateau of State National Ethnic Affairs Commission, Chengdu 610041, China;
3. GeneRadar Biotechnology Corp. (Xiamen), Xiamen 361000, China
轮状病毒(rotavirus，RV)是引起人类和动物急性肠胃炎的重要病原，尤其是在幼龄动物中高发[1]。RV为呼肠孤病毒科轮状病毒属，无囊膜双链RNA病毒, 分11个基因节段，分别编码6种结构蛋白(VP1~VP4、VP6、VP7) 和6种非结构蛋白(NSP1~NSP6)，其中VP6基因序列在各毒株间高度保守，是RV的主要分子检测靶点[2-4]。
牛轮状病毒(bovine rotavirus, BRV)是引起犊牛腹泻的主要病原体，已在全世界主要养牛国家和地区普遍发生和流行，给养牛业造成了严重的经济损失[5-6]。近来有研究发现BRV能从牛传染到人并导致腹泻[7-11]，其公共卫生学意义值得关注。PCR方法具有特异性强且灵敏度相对较高的特点，是目前病原检测的金标准，病原检测耗时4~7 h；实时荧光定量PCR将PCR与荧光检测方法结合，具有特异性好、灵敏度高、可定量、有效解决PCR污染问题及自动化程度高等优点，病原检测耗时3~5 h，目前这两种方法已广泛应用于RV的检测[12-14]。本实验室前期研究发现，VP6基因作为RV的主要检测靶基因在牦牛RV上变异很大，影响了BRV检测方法对牦牛RV的检出，基于此基础重新设计引物建立了RT-PCR方法，提高了检出率[15]，但是目前仍未有基于PCR原理的BRV或牦牛RV现场诊断方法。
恒温隔绝式PCR(insulated isothermal PCR, iiPCR)是一种基于Rayleigh-Benard对流原理的PCR扩增新技术。该技术自M. Krishnan等于2002年在Science杂志报道以来[16]，已用于虾白斑病病毒[17-18]、马流感病毒[19]、犬瘟热病毒[20]、犬细小病毒[21]、猪瘟病毒[22]等动物疫病的快速检测，也可用于食品中沙门菌[23]的检测，其中采用该技术建立的对虾白斑病病毒的检测方法已得到了OIE的认证[17-18]。该技术主要利用热对流的原理，通过容器底部液体加热产生上部液体与下部液体的温差以形成液体的循环，持续的加热维持循环进而形成稳定的温度梯度，此时借由容器的设计巧妙的控制对流的时间与散热的速率，就可以形成适合PCR的反应环境[14]。基于此研发的小型核酸检测仪，反应仅需42 min，机器内已设置荧光吸收的阈值，作为判读标准，结果直接显示于屏幕上。与传统PCR仪相比，该技术缩短了反应时间，仪器轻便，操作简单，配合试剂盒法提取核酸，实现了病原检测的现场化和程序化，适用于基层现场快速诊断[18, 24]。但目前国内还未见应用iiPCR检测病原微生物的文献报道。本研究的目的是建立既可现场检测BRV，也可现场检测牦牛RV的iiPCR方法, 并对2016年采集的川西北地区牦牛腹泻样本进行检测。
1 材料与方法 1.1 病毒(菌)株与临床样本BRV参考毒株(NCDV1)，分离自西藏、青海、四川及云南等四个地区样本的20株牦牛RV毒株(由本实验室保存)；用于特异性验证的病毒(菌)株和核酸样本：牛星状病毒(bovine astrovirus, BAstV. swun0706)、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV. swun0603)、牛肠炎病毒(bovine enterovirus, BEV. swun0510)；牛大肠杆菌(swun4025)、牛都柏林沙门菌(swun3736)、牛产气荚膜梭菌(swun2930)、牛空肠弯曲杆菌(swun1639)；牛冠状病毒(bovine coronavirus, BCoV)核酸样本以及牛艾美尔球虫、牛瑞氏隐孢子虫的DNA样本由本实验室保存。临床对比样本为2015年8月采集的30份普通肉牛腹泻粪便样本和30份牦牛腹泻粪便样本，由本实验室保存；临床样本为2016年8月采自于四川阿坝藏羌自治州阿坝、红原、若尔盖14个牧场的88份牦牛腹泻样本。
1.2 主要试剂及仪器TrizolTM Reagent、Premix Ex Taq (Probe qPCR)、PrimescriptTM反转录试剂盒、pMD19-T克隆载体等购于TaRaKa公司；AXY prepTM DNA胶回收试剂盒购于Axygen公司；PetNAD核酸萃取试剂盒、Uni-ii PCR Starter Kit检测试剂盒(包括Taq酶、反转录酶、预混buffer)由金瑞鸿捷(厦门)生物科技有限公司提供；DNA Marker、DH5ɑ感受态细胞、质粒提取试剂盒购于宝生物工程(大连)股份有限公司；凝胶成像系统Doc2000(Bio-Rad公司，美国)；Biospec-nano核酸蛋白分析仪(岛津公司，日本); 高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国)；反应体系优化等采用8通道的POCKITTM智能型核酸分析仪(金瑞鸿捷公司，中国厦门)、临床样本现场检测采用POCKITTM小型核酸分析仪及cubeeTM小型高速离心机(金瑞鸿捷公司，中国厦门)；荧光定量PCR仪(博日公司，中国杭州)。
1.3 引物的设计与合成选择BRV NCDV株(DQ870496.1)、国内DQ-75毒株(GU384194.1) VP6基因序列与实验室前期得到的14个牦牛RV VP6基因片段序列和1个牦牛RV VP6完整的ORF序列进行比较后选择高保守区域利用Primer5.0设计软件设计了特异性检测引物和探针，扩增目的片段位于1 224—1 316 bp处，长度为92 bp。引物序列：F:5′-GCTAACCACTTGGTATCCG-3′，R:5′-GCCATCTGAGTGATTACTCTG-3′，探针序列：FAM-TACGTATTCGCTACACAGAGTAATCA-BHQ1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.4 核酸的提取BRV参考毒株、用于特异性验证的毒株和对比方法所需的RNA提取采用Trizol法提取，采用PrimescriptTM反转录试剂盒合成cDNA，按照试剂盒说明书进行，-20 ℃保存备用；用于特异性验证的细菌DNA采用酚-氯仿法提取，-20 ℃保存备用。
为了便于现场使用，临床样本的核酸提取采用商品化的PetNAD核酸萃取试剂盒，PetNAD核酸萃取试剂盒法简述如下：将临床样本直接用PBS稀释，混匀离心，取200 μL到1.5 mL离心管中，然后按照PetNAD核酸萃取说明书操作，从离心柱中洗脱的总核酸包括DNA和RNA，于-20 ℃保存备用。RNA的反转录步骤在后续的PCR反应管中进行。
1.5 BRV阳性标准品的制备以NCDV1株提取的核酸样本作为模板，加入引物扩增BRV的VP6基因92 bp的片段，PCR产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收目的片段，并将其克隆至pMD19-T载体，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆接入含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃培养8 h，用质粒提取试剂盒提取重组质粒，送生工生物有限公司测序。测序正确的阳性质粒作为阳性标准品，核酸蛋白分析仪测定其浓度。
1.6 反应体系的优化按照Uni-ii PCR Starter Kit检测试剂盒说明书，采用50 μL体系(包括引物、探针、酶、Buffer、ddH2O和模板)对引物浓度10 μmol·μL-1(0.5~4 μL)、探针浓度10 μmol·μL-1 (0.05~0.4 μL)、Taq酶5 U·μL-1(1~5 μL)、反转录酶20 U·μL-1(0.5~2 μL)和模板(0.5~4 μL)分别进行优化，以PCR反应前后的读取到荧光值的增长值最高的用量为最佳。
1.7 特异性评价用建立的iiPCR方法对BRV标准毒株、20株来自四个地区的牦牛RV分离株、BAstV、BVDV、BCV、BEV、牛大肠杆菌、牛沙门菌、牛产气荚膜梭菌、牛空肠弯曲杆菌、以及艾美尔球虫、瑞氏隐孢子虫进行检测，以评价该方法的特异性。
1.8 敏感性测定将BRV阳性标准品10倍递增稀释后作为模板(1×100、1×10-1~1×10-10)，用建立的iiPCR方法进行检测，确定其检测限。
1.9 重复性评价用建立的iiPCR方法对阳性标准品8个稀释度(1×10-3~1×10-10)分别检测三次，以评价方法的重复性。
1.10 检测BRV的PCR预混试剂的制备为了便于保存运输和现场使用，将优化的iiPCR的反应体系，包括引物、探针、反转录酶、Taq酶、预混Buffer、DEPC H2O进行预混，并按照每一个样品检测所需试剂的量对应一管的比例分装到0.5 mL的离心管中，加入冻干保护剂真空冻干保存备用。
1.11 与现有检测BRV方法的比较采用本实验建立的iiPCR方法、本实验室前期建立的检测牦牛RV的RT-PCR方法[15]以及R. Gautam等报道的检测BRV荧光定量RT-PCR方法[25](表 1)同时对30份牛腹泻粪便样本及30份牦牛腹泻样本进行检测，并比较检出率。
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表 1 三种RT-PCR方法的引物信息 Table 1 Primer information for three kinds of RT-PCR assay |
采用已建立的iiPCR方法对采自于四川阿坝藏羌自治州阿坝、红原和若尔盖三个县14个牧场的88份牦牛腹泻样本进行检测，分析牦牛RV的流行情况。
2 结果 2.1 优化的反应体系优化后的体系:引物上下游各3.5 μL (10 μmol·μL-1)、探针0.25 μL (10 μmol·μL-1)、Taq酶1 μL(5 U·μL-1)、反转录酶1.25 μL(20 U·μL-1)、预混buffer 25 μL、模板2 μL、DEPC H2O 15.5 μL，共50 μL。
2.2 特异性评价采用自行设计的检测引物对BRV核酸阳性样本进行PCR扩增，获得的目的片段大小与预期结果一致，测序结果证明目的片段长度为92 bp，与BRV和本实验室前期获得牦牛RV的VP6基因序列的相似性均为100%，证明BRV检测引物的特异性良好。
采用建立的iiPCR方法检测用BRV标准毒株和20株牦牛RV细胞毒提取的核酸样本，均为阳性，检测BAstV、BVDV、BCV、BEV、牛大肠杆菌、牛沙门菌、牛产气荚膜梭菌、牛空肠弯曲杆菌以及艾美尔球虫、瑞氏隐孢子虫等无关核酸样本均为阴性，表明建立的iiPCR方法特异性良好。
2.3 敏感性检测阳性标准品的质量浓度为29.75 ng·μL-1，拷贝数为9.66×109copies·μL-1，敏感性检测结果显示，建立的iiPCR对BRV的核酸最低检限测为96.6 copies·μL-1(2.9 fg·μL-1)。
2.4 重复性评价用建立的iiPCR方法对阳性标准品8个稀释度(1×10-3~1×10-10)分别检测三次，结果一致，表明建立的iiPCR方法重复性良好。
2.5 与现有检测BRV的方法的比较如表 2结果显示，在对牛腹泻样本中的BRV检测时，本方法与R. Gautam等报道的方法3检出率均为33.33%，且检出的阳性样本号一致，而本实验室前期建立的RT-PCR方法的检出率仅为26.67%；而对牦牛腹泻样本中的牦牛RV检测时，本方法对牦牛RV的检出与本实验室前期建立的方法2一致，阳性率为73.33%，而方法3的检出率仅为36.67%；所有检出的阳性样本经克隆转化后送公司测序鉴定均为目的片段。可见本研究建立的iiPCR方法对牦牛RV的检测明显优于方法3。
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表 2 三种方法检测结果的比较(n=30) Table 2 The comparison of testing results for three kinds of methods (n=30) |
用本研究建立的iiPCR方法对阿坝、红原和若尔盖三个县14个牧场88份牦牛腹泻粪便样本进行检测，牦牛RV的检出率为98.86%(表 3)。
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表 3 临床样本的检测结果 Table 3 Detection of clinical samples |
犊牛腹泻是造成养牛业损失的主要原因之一。引起犊牛腹泻的病原很多，包括病毒(如BRV、BCoV、BVDV等)、细菌(如大肠杆菌、沙门菌等)，以及寄生虫(如艾美尔球虫、隐孢子虫等)[5, 26]。因为各种原因引起的犊牛腹泻的临床症状相似，往往需要依靠实验室检测来进行确诊。尽管已有很多检测BRV的方法[12-14]，但是牦牛RV的VP6基因的碱基突变造成导致现有的BRV检测方法对牦牛RV的检测效果不佳[15]。笔者通过分析BRV和牦牛RV的VP6基因序列设计引物和探针，成功建立了既可检测BRV也可检测牦牛RV的iiPCR方法，具有良好的特异性和重复性，且灵敏度可达到96.6 copies·μL-1。比较试验表明，本方法与R. Gautam等[25]报道的方法用于检测BRV的结果一致，而在检测牦牛腹泻粪便样本中RV时，笔者建立的方法明显优于R. Gautam的方法，分析发现方法3的检测位点与牦牛RV VP6基因序列相比有930 bp(T→G)、934 bp(A→G)、936 bp(C→T)等多处的变异，可能是导致方法3对牦牛RV的阳性检出率低的主要原因。本方法与本实验室前期建立的方法[15]用于检测牦牛RV的结果一致，而用于检测BRV结果不一致的原因，可能是因为本方法是基于探针模式的荧光RT-PCR方法，灵敏度远高于基于RT-PCR技术的方法导致的。
青藏高原地广人稀，交通不便，牦牛是青藏高原特有的养殖动物，是当地牧民不可或缺的生产生活资料。我国境内约有1 500万头牦牛，而腹泻病是牦牛最为常见的疾病之一[27]。本方法的建立，为牦牛RV的检测提供了有力的工具。笔者对2016年四川阿坝藏羌自治州3个县14个牧场的牦牛腹泻样本的检测结果显示，牦牛RV的感染率高达98.8%，表明牦牛RV感染是当前川西北牦牛腹泻的重要原因。
核酸提取是PCR检测的必备步骤，而核酸快速提取技术是缩短PCR检测时间的重要环节[28]。在预试验中，笔者对Triol法和本试验选用的PetNAD核酸萃取商品化试剂盒进行了比较，结果表明两种提取方法提取的核酸在用于荧光定量PCR检测时检出结果一致，因此，本试验选用该商品化核酸试剂盒，提取过程仅有加样和离心，离心采用的是小型高速离心机配合移动电源，提取过程仅耗时约15 min，满足了现场提取核酸的需要。
为了配合现场使用，笔者也对检测试剂的保存方式进行了优化。在对检测试剂的体系进行了优化筛选后，我们按照每一个样品检测所需试剂的量对应一管的比例分装，然后进行真空冻干后独立包装，独立包装的预混PCR检测试剂包括了反转录酶、Taq酶、buffer、引物及探针等，使用时只需使用buffer溶解后转移到PCR管中，加入模板即可进行检测，RNA的反转录步骤就在该PCR反应管中进行，省去了单独反转录的时间及仪器。此外，将PCR检测试剂预混还可以减少加样环节，避免操作过程的污染[21]。笔者的初步试验表明，预混试剂经过真空预冻之后在室温条件下可保存一年以上，4 ℃保存时间更长，和Y. Y. Go等报道的结果相似[29]，这极大地方便了该检测试剂盒的现场使用。
本试验所基于的恒温隔绝荧光PCR技术，具有检测速度快、操作简单、可现场使用等优点，已在国外用于动物疫病的快速诊断，并且基于此技术检测对虾白斑病病毒的方法已获得了OIE的认证[17-18]。基于此技术研发的POCKIT小型核酸检测仪自重仅380 g，自带电源，一键操作，方便携带，且检测仅需42 min，配合核酸现场提取技术，从样本处理到报告结果，可在1 h内完成。众所周知，准确的诊断是疫病科学防控的前提。实现疫病的现场诊断，对及时制定有效的疫病防控策略，特别是在重大疫病的防控上具有重要的意义。因此，该技术在重大动物疫病的现场快速诊断中具有很大的应用潜力。
4 结论基于恒温隔绝式PCR技术成功建立了可用于现场检测BRV和牦牛RV的iiPCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、稳定性好，既可用于BRV的检测，也可用于牦牛RV检测，配合PetNAD核酸提取试剂盒，从核酸提取到报告检测结果仅需1 h，具有快速检测、灵敏度高、操作简便及可以现场使用等特点，为RV的诊断及防控提供有力的工具。
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