猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起，以腹泻、呕吐、脱水和哺乳仔猪高死亡率为特征^[1-3]。PED是导致初生仔猪死亡的重要传染病之一，于1971年首次发生于英国的生长育肥猪群，随后在欧洲其他国家以及亚洲相继发生^[4-5]。1976年我国广东、上海、黑龙江等地发生PED，继而在国内猪场呈地方流行性形式发生^[6]。2010年10月，由PEDV变异株引起的初生仔猪腹泻在我国多地暴发流行，以7~10日龄内的哺乳仔猪受害最严重，其发病率高达100%，死亡率达50%~90%，给我国养猪生产造成了巨大经济损失^[2-3]。

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属成员，为线性单股正链RNA病毒，基因组全长约28 kb，编码4种结构蛋白：纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)，其中S蛋白位于病毒粒子表面，是PEDV最重要的结构蛋白，由1 383 aa组成，包括信号肽、中和表位、跨膜区和细胞质区^[7-10]。S蛋白可以分为S1(1—789 aa)和S2(790—1 383 aa)两个区域，S1区位于病毒表面，可与宿主细胞上的受体结合，诱导中和抗体产生；S2区位于病毒内部，介导病毒与宿主细胞的融合^[11-13]。因此，S蛋白是PEDV感染免疫研究和疫苗设计的主要靶蛋白，该蛋白抗体水平及其变化动态是评价免疫效果和监测免疫状态的重要依据，同时也可以作为PEDV感染血清流行病学调查的重要指标。丁振江等^[14]和华耀等^[15]分别建立了基于重组PEDV S1蛋白的检测IgA抗体的间接ELISA方法和基于PEDV S蛋白的检测IgG抗体的间接ELISA方法。由于S1蛋白区域是诱导机体保护性免疫应答的主要区域，所以针对该区域的特异抗体水平更能够反映疫苗免疫保护水平和机体抗感染免疫水平。已知血清PEDV抗体与局部黏膜免疫水平具有正相关性^[16]，而检测血清IgG抗体ELISA方法的应用范围更加广泛。因此，非常有必要建立基于S1蛋白的IgG抗体ELISA检测方法。

本研究以重组PEDV S1蛋白作为检测抗原，通过优化抗原、抗体工作浓度和反应条件，建立了基于PEDV S1蛋白的IgG抗体间接ELISA检测方法，并用该方法检测了PED灭活疫苗免疫母猪的血清、初乳抗体水平及其所产仔猪的血清母源抗体动态变化，旨在为临床PEDV感染和免疫检测提供技术手段，为PED的有效防控以及阐明其被动免疫机制提供参考。

1 材料与方法 1.1 菌种

表达抗原蛋白(PEDV部分S1蛋白，相对分子质量为38 ku)的菌种BL21-S1，由PEDV S1蛋白原核表达质粒pET-S1转化E. coli BL21获得，由河北农业大学传染病实验室制备和保存。

1.2 主要试剂与抗体

Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒，购自北京康为试剂生物科技有限公司；蛋白质定量测试盒，购自南京建成生物工程研究所。PEDV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RVA)的抗血清以及小鼠抗PEDV阳性和阴性血清，为河北农业大学传染病实验室制备和保存；猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和伪狂犬病病毒(PRV)等的抗血清，为美国爱德士生物科技公司产品；HRP-羊抗猪IgG和HRP-羊抗鼠IgG，购自北京索莱宝生物技术有限公司。

1.3 重组PEDV S1蛋白的制备

将表达PEDV S1蛋白的BL21-S1种子液按照培养基体积1%的量接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃ 200 r·min^-1振摇培养至对数期(OD_{600 nm}值为0.6~1.0)，加入终浓度为0.5 mmol·L^-1的IPTG，28 ℃ 230 r·min^-1振摇诱导培养5 h，4 ℃ 7 500 r·min^-1离心15 min收集菌体，经过SDS-PAGE检测蛋白质的表达情况及其相对分子质量大小，应用Western blot鉴定表达蛋白质的抗原活性。按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒说明，纯化目的蛋白质。经SDS-PAGE分析纯化蛋白质有无杂带，用紫外分光光度计测定蛋白质含量，分装，-80 ℃保存，作为包被抗原。

1.4 最佳工作浓度与工作条件的确定 1.4.1 抗原包被浓度与封闭液的确定

将0.25、0.5和1 μg·mL^-1的重组PEDV S1蛋白分别加入96孔酶标板各孔内，100 μL·孔^-1，重复2孔；于37 ℃下孵育1 h、4 ℃下作用过夜；弃去包被液，洗涤3次；在相应浓度的抗原孔内加入不同封闭液(5%新生牛血清、5%马血清、5%脱脂奶粉、2%BSA和1%明胶)，100 μL·孔^-1，置37 ℃孵育1 h，弃去封闭液；加入100 μL 1:40倍稀释的猪抗PEDV阳性血清和阴性血清；置37 ℃孵育1 h，洗涤；每孔加入100 μL 1:1 000倍稀的羊抗猪IgG-HRP，置37 ℃孵育45 min，洗涤；每孔加入100 μL新鲜配制的TMB底物溶液，室温避光反应15 min；每孔加入50 μL的2 mol·L^-1 H2_SO₄终止反应。用酶联检测仪测定OD_{450 nm}值，比较阴、阳性血清的OD值，以及阳性血清(P)与阴性血清(N)OD值的比值(P/N值)。当P/N值最大且阳性血清的OD值在1.0左右时，所用抗原包被浓度和封闭液为最佳抗原包被浓度和封闭液。

1.4.2 包被条件与封闭条件的确定

分别在下列5种条件下进行抗原包被，即37 ℃作用1 h、4 ℃过夜，37 ℃作用1 h，25 ℃作用1 h、4 ℃过夜，25 ℃作用1 h，4 ℃过夜。然后在下列4种条件下封闭抗原孔，即37 ℃孵育30 min、37 ℃孵育1 h、25 ℃孵育30 min、25 ℃孵育1 h。随后按照“1.4.1 ”中的反应条件进行ELISA，确定最佳抗原包被条件和封闭条件。

1.4.3 待检血清浓度与酶标抗体浓度及其反应条件的确定

分别将PEDV抗体阳性和阴性血清作1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1 280倍稀释，与包被抗原在37 ℃下分别反应45 min和1 h；洗涤后，分别与1:500和1:1 000倍稀释的羊抗猪IgG-HRP于37 ℃反应30和45 min；按照“1.4.1 ”中的反应条件进行ELISA，确定待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度与反应条件。

1.5 血清阴阳性临界值的确定

用建立的方法检测50份PEDV抗体阴性血清，计算样品OD_{450 nm}值的平均值(x)和标准方差(s)。根据统计学原理，样本的OD_{450 nm}值≥x+3 s时，判为阳性；当OD_{450 nm}值≤x+2 s时，判为阴性；介于二者之间者判为可疑。

1.6 特异性与敏感性试验

用建立的间接ELISA方法检测PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV和RVA等病毒的抗血清，同时设立PEDV抗体阴、阳性血清对照，评价方法的特异性。

将PEDV的抗血清作1:80、1:160、1:320、1:640、1:1 280、1:2 560倍比稀释后，分别用建立的ELISA方法和免疫过氧化物酶单层试验(immunoperoxidase monolayer assay, IPMA)^[17]检测其中的特异抗体。每个稀释度做3个重复，评价ELISA方法的敏感性。

1.7 对比试验

分别用建立的ELISA方法与IPMA检测70份猪血清，比较两种方法的检测结果，评价ELISA方法与IPMA的符合率。

1.8 重复性试验

用同一批次重组蛋白质包被酶标板，同时检测10份猪血清，每份血清重复3孔，共重复3次试验。另取4个批次的重组蛋白质包被酶标板，分别检测10份猪血清，每份血清重复3孔。根据变异系数(CV)，分析ELISA方法的批内与批间重复性。

1.9 母猪及初生仔猪的血清抗体检测

随机选取5头怀孕母猪，于产前4周经后海穴免疫接种PED灭活疫苗，母猪生产后，通过自然哺乳方法使每头初生仔猪吃到初乳。应用建立的ELISA方法检测初乳、母猪分娩当天血清及其所产仔猪(共60头)在1、7、14、21、28和35 d时血清中的特异抗体，初步分析初生仔猪血清中特异母源抗体的动态变化。

2 结果 2.1 重组PEDV S1蛋白的制备

在28 ℃下经IPTG诱导5 h后，BL21-S1表达的重组蛋白质相对分子质量约38 ku，与预期大小一致，应用Ni-Agarose His标签蛋白质纯化试剂盒能够有效地纯化目的蛋白质(图 1A)，经Western blot检测，该蛋白质可以与PEDV抗血清特异结合(图 1B)。

2.2 ELISA抗原和抗体的最佳工作浓度与反应条件

将不同浓度的抗原、抗体与各种封闭液，组成方阵，分别在不同条件下进行ELISA。结果显示，用1 μg·mL^-1的重组PEDV S1蛋白在37 ℃孵育1 h、4 ℃下包被过夜，用5%新生牛血清在37 ℃下封闭1 h；待检血清作1:40倍稀释，与包被抗原在37 ℃下反应1 h；酶标抗体作1:1 000倍稀释，与待检血清在37 ℃下作用45 min，ELISA的P/N值最大(表略)。

2.3 阴阳性临界值

50份PEDV抗体阴性血清的OD_{450 nm}平均值x为0.169，其SD为0.068。因此，当样品OD_{450 nm}值≥0.373时，判定为特异抗体阳性；当OD_{450 nm}值≤0.305时，判定为阴性；当OD_{450 nm}值介于两者之间时，判定为可疑。

2.4 特异性与敏感性

用建立的方法检测PCV2、PRRSV、CSFV、PRV、TGEV和RVA的抗血清时，OD值均＜0.305(表 1)，表明建立的ELISA方法与其他病毒抗血清无交叉反应，具有良好的特异性。

敏感性检测发现，当将血清作1:640稀释时，ELISA检测的OD值为0.475±0.022，当1:1 280稀释时，其OD值为0.294±0.006，低于0.373，为阴性。所以ELISA能检出的血清抗体效价为1:640。同时，当用IPMA检测时，血清的抗体效价为1:160。上述结果表明，该ELISA的敏感性高于IPMA。

2.5 ELISA与IPMA检测结果的符合率

应用IPMA和ELISA从70份血清中分别检出抗PEDV阳性血清34份和35份，检出抗PEDV阴性血清36份和35份，二者检测结果的阳性符合率为97.06%，阴性符合率为97.22%，总符合率为97.14%。

2.6 重复性

当用同一批次的重组PEDV S1蛋白包被酶标板，重复3次检测相同的血清样品，或者用4个批次的重组PEDV S1蛋白包被酶标板，检测相同血清样品时，其变异系数分别为3.75%~9.30%和1.49%~7.84%，均低于10%(表略)。该结果表明，无论是批内还是批间重复试验，重组PEDV S1蛋白作为检测抗原均具有很好的重复性。

2.7 母猪及初生仔猪的血清PEDV S1抗体

在5头产前免疫接种PED灭活疫苗的怀孕母猪初乳和血清中，均可以检测到PEDV特异抗体，但初乳比血清中的平均抗体水平低，其中初乳和血清(1:40倍稀释)的OD_{450 nm}值分别为0.508±0.058和0.824±0.093(图 2A)。5头母猪中，初乳的抗体效价在1:40~1:80(1头为1:80，其余均为1:40)，血清的抗体效价在1:80~1:640(1头为1:80，其余为1:160~1:640)。60头1日龄仔猪的血清抗体阳性率为50%，抗体阳性仔猪的平均抗体水平低，抗体效价在1:40~1:80，血清(1:40倍稀释)OD_{450 nm}值为0.481±0.057。7日龄后所有仔猪的血清全部转为抗体阴性(图 2B)。

3 讨论

已有PEDV N蛋白抗体间接ELISA检测方法的报道^[18-19]。该方法可用于PEDV感染诊断和流行病学调查，但不适合对疫苗免疫效果进行监测与评价。已知S蛋白是介导保护性免疫应答的主要蛋白，其中S1区域是诱导机体产生保护性免疫应答的主要区域^[11-13]，所以通过检测S1蛋白抗体，能够更好地评价机体抗感染能力和疫苗免疫效果，同时也能够了解PEDV的感染与流行情况。因此，本研究以原核表达的部分PEDV重组S1蛋白作为检测抗原，通过对抗原包被浓度与包被条件、待检血清和酶标抗体的反应浓度与反应条件以及封闭液和封闭条件的优化，建立了基于重组S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法。该方法与猪场常见的其他病毒抗体无交叉反应，与常用的IPMA的总符合率在97%以上。这些技术指标与华耀等^[15]报道的基于重组S蛋白建立了检测PEDV IgG抗体ELISA检测方法中的类似。

PEDV野毒、灭活疫苗与弱毒疫苗均能够诱导机体产生特异性全身免疫应答和黏膜免疫应答，其中黏膜免疫在机体抵抗PEDV感染中发挥着关键作用^[16]。仔猪回肠绒毛M细胞可能是PEDV入侵肠道的重要通道^[20]。初乳中PEDV S蛋白特异的IgA水平与初乳对病毒的中和活性密切相关，其提供的被动免疫是保护初生仔猪早期免于感染发病的关键^[21-23]。丁振江等^[14]基于重组PEDV S1蛋白建立了PEDV IgA抗体间接ELISA，适合检测母乳IgA抗体。但实践中仍然需要测定IgG水平，以补充IgA抗体间接ELISA方法应用范围的局限性。已知PEDV抗原诱导机体产生的全身免疫应答与局部黏膜免疫应答水平呈正相关^[16]，所以通过检测血清中PEDV IgG抗体水平同样能够反映疫苗诱导的免疫保护效果，并且其适用于哺乳期、非哺乳母猪及其他猪的免疫监测与感染情况调查，适用范围更加广泛。

为了分析PED灭活疫苗免疫母猪所产仔猪血清母源抗体动态，为PED的免疫预防提供参考，本研究用建立的方法检测了免疫母猪初乳、血清以及初生仔猪血清PEDV抗体，发现妊娠母猪于产前4周接种PED灭活疫苗后，虽然其初乳和血清中均有特异性IgG抗体，但是初乳比血清中的IgG抗体平均水平低。同时发现，这些母猪所产的仔猪只有部分在出生当天可以检测到低水平的特异抗体，7日龄后抗体全部转为阴性。此结果说明，这些仔猪由初乳获得的PEDV抗体水平低，且维持时间短暂。这可能与产前怀孕母猪只免疫接种1次，特异抗体尤其是初乳抗体水平低密切相关。因为已有研究表明，怀孕母猪产前4周、2周连续两次接种PEDV灭活疫苗，或者以2~3周的间隔，将弱毒疫苗与灭活疫苗联合接种，均可以诱导母猪在血清和初乳内产生高效价的特异抗体，并可以在初生仔猪血清中检测到高水平的母源抗体^[24]。因此，猪场需要改善母猪免疫方案，以提高母猪的PEDV抗体效价。只有母猪特异抗体水平足够高时，才能保证初生仔猪获得效果确实的被动保护。

4 结论

建立了基于PEDV S1蛋白的间接ELISA抗体检测方法，该方法与其他病毒抗血清不发生交叉反应，与免疫过氧化物酶单层试验的符合率为97.14%，批内和批间重复性试验的变异系数小于10%。应用建立的ELISA方法检测了产前用PEDV灭活疫苗免疫一次的母猪初乳、血清及其仔猪血清中的PEDV抗体，结果显示初乳中的特异性IgG抗体平均水平低于血清中的水平，仔猪的母源特异抗体阳性率和抗体水平低，维持时间短暂。该结果提示猪场需要改善母猪免疫方案，以提高母猪的PEDV抗体效价，保证初生仔猪获得效果确实的被动保护。