2. 湖南农业大学逆向动物疫苗研究中心及功能蛋白质组学实验室, 长沙 410128;
3. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193;
4. 南京农业大学动物医学院, 南京 210095;
5. 江苏南农高科技股份有限公司, 江阴 214405
, WANG Dong-liang1,2#, WANG Nai-dong1,2, JIANG Yi-fan1,2, HUANG Kun1,2, CUI Shang-jin3, JIANG Ping4,5, YANG Yi1,2,5
2. Research Center of Reverse Vaccinology and Laboratory of Functional Proteomics, Changsha 410128, China;
3. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
4. College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
5. Jiangsu Nannong Hi-tech Co., LTD., Jiangyin 214405, China
猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)是圆环病毒科圆环病毒属的重要成员之一。该病毒包括两个基因型(genotypes): 1型和2型，即PCV1和PCV2[1]。PCV1是从猪肾上皮细胞(PK15) 中分离出来的非致病性病毒粒子[2]，而PCV2则是目前对世界养猪业危害极大的病原体之一，给全球养殖业带来了巨大的经济损失[3-4]。与PCV2相关的疾病(PCV2 associated diseases, PCVAD)包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome, PDNS)、呼吸系统疾病(respiratory disease)、繁殖障碍(reproductive failure)和肠道疾病(enteric disease)等[5-7]。
PCV是目前报道的最小的无囊膜DNA病毒。成熟的病毒粒子由60个核衣壳蛋白质(capsid protein, Cap)亚基组装成为一个直径为17~20 nm的正二十面体的球形颗粒，病毒的基因组包裹于其中，由1767~1768碱基组成的单链环形DNA[8-9]，编码两个主要的开放阅读框(open reading frames, ORFs): cap和rep (病毒复制相关的酶)[10]。Cap是PCV唯一的结构蛋白质和主要抗原，由232~234个氨基酸残基组成，相对分子质量约为27 ku[11-12]。昆虫-杆状病毒表达系统(baculovirus expression vector system, BEVS)表达的PCV2 Cap能在体内自组装成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)[13]，该VLPs是目前商业化PCV2亚单位疫苗的主要抗原，能诱导机体产生有效的免疫保护反应[14-15]。
2016年10月，美国Kansas州立大学的R. Palinski等和加州大学San Francisco分校T. G. Phan等几乎在同一时间报道一个新的PCV基因型，又称为PCV3[16-17]。该病毒从出现病症的母猪或仔猪中分离得到，同时PCV2检测为阴性。基因组序列分析发现，PCV3基因组包含2 000碱基，具有与PCV1和2相似的基因组结构，主要编码cap和rep两个基因。在cap和rep基因5′端包含有一个由9个碱基(TAGTATTAC)组成的stem loop结构，其碱基组成与PCV1的stem loop序列完全一致。PCV3 cap基因编码214个氨基酸残基，较PCV2 Cap少19~20个，此外，与PCV2和鸭圆环病毒相比，其cap基因相似性仅为36%~37%。PCV3 rep基因编码297氨基酸残基，与GenBank数据库比较发现，该Rep蛋白质氨基酸与先前在美国报道的一株PCV毒株(GenBank accession登录号：ADU77001) 展现出较高的相似性(69.4%)；与从我国分离到的蝙蝠圆环病毒的Rep相似性为54%。此外，PCV3在其他国家和地区尚未见报道。
本研究对我国南方部分省份的猪场进行PCV3检测，并对其唯一的结构蛋白质Cap的结构进行同源模拟，分析与PCV2抗原性的异同，从而对目前以PCV2为基础的圆环病毒疫苗是否对PCV3的感染具有交叉保护作用作出科学的预测。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病料本研究检测的14份猪病料(肺和淋巴结)于2014年采自湖南、江苏和湖北等地猪场的发病猪，病猪临床表现为消瘦、食欲减退、精神不振，疑似为PDNS综合征。其中，湖南省猪场10份样品，江苏省猪场3份样品，湖北省猪场1份样品。
1.1.2 主要试剂QIAamp DNA Mini Kit(基因组提取试剂盒)购自QIANGE公司；EasyTaq聚合酶购自北京全式金公司；Gel Extraction Kit(DNA胶纯化试剂盒)购自OMEGA公司；DL 2000 Marker (DNA相对分子质量标准)购自Biomed公司；pSP72基因克隆载体购自Promega公司；限制性内切酶、T4连接酶均购自Fermentas公司；其他化学试剂均从Sigma-Aldrich公司购买。
1.2 病料DNA的提取称量约25 mg病料组织，加入1 mL无菌的PBS研磨，10 000 r·min-1离心1 min，弃掉上清，总DNA的分离纯化按照QIAamp DNA Mini Kit操作手册进行，纯化后的总DNA用紫外分光光度计测量其浓度和纯度(A260 nm/A280 nm)。
1.3 引物设计根据GenBank中已有的PCV2序列进行大量比对，在PCV2基因组保守区设计一对特异性引物；根据GenBank中已报道的5株PCV3序列，在其保守区内设计两对特异性引物进行巢式PCR检测PCV3。所有引物均由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，本试验所有引物序列见表 1。
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表 1 引物信息 Table 1 Primer information |
病料组织DNA PCV2检测的体系为25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物PCV2-F/PCV2-R浓度0.4 μmol·L-1，模板1 μL。反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，扩增35个循环，最后再72 ℃延伸7 min。
PCV3检测利用巢式PCR的方法检测，第一次PCR检测体系25 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物PCV3-F1/PCV3-R1浓度0.4 μmol·L-1，模板1 μL，反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，扩增35个循环，最后再72 ℃延伸7 min。将第一次PCR产物作为模板50倍稀释，利用引物PCV3-F2/PCV3-R2进行巢式PCR，扩增35个循环。
1.5 PCV3 Cap核苷酸序列测定将扩增的PCV3 PCR产物和pSP72基因克隆载体分别用KpnⅠ和BamHⅠ双酶切，22 ℃连接1 h，连接产物转化到DH5α感受态大肠杆菌，挑取单克隆细菌，37 ℃摇菌过夜，提取重组质粒并进行双酶切鉴定，阳性质粒送公司测序。
1.6 PCV3 cap基因及其对应的蛋白质氨基酸序列分析在NCBI GenBank数据库下载部分PCV3、PCV2、PCV1和部分其他种属圆环病毒参考毒株的cap基因及其氨基酸序列，利用NCBI Blast、Clustal W软件和MEGA5.0 Maximum Likelihood对PCV3 cap基因序列进行比对和进化树分析，对Cap氨基酸序列进行多重比较分析。
1.7 PCV3 Cap蛋白3D结构的模拟及抗原表位预测以PCV2 Cap蛋白(PDB ID：3R0R)为模板，利用Modeller蛋白质分子模拟软件(版本号9.17；https://salilab.org/modeller/)对PCV3 Cap蛋白进行三维结构同源建模。所有蛋白质三维结构用蛋白质结构软件Pymol(版本号1.8.4.0；https://www.pymol.org/)进行展示和标记。PCV3 Cap蛋白质的抗原表位采用在线服务器：http://www.iedb.org进行预测。
2 结果 2.1 PCV2和PCV3的检测从疑似猪PDNS组织中检测PCV2和PCV3。PCR结果表明，14份DNA样品均为PCV2阳性，阳性率为100%；6个样品为PCV3阳性, 阳性率为42.9%(图 1)。DNA测序结果进一步确定上述DNA片段分别属于PCV2和PCV3的基因组。其中6个样品含有PCV2和PCV3的混合感染，占总样品数的42.9%。使用PCR扩增了PCV3 cap基因，并做了TA克隆，DNA测序后，获得的cap基因(YiY-1-11和YiY-2-11，GenBank No. : KY484769和KY484770) 进化树分析，结果显示两个cap基因属于PCV3毒株(图 2)，与GenBank参考的PCV3 cap基因序列对比分析，相似性高达97%(图 3)。
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A. PCV2检测结果；B. PCV3巢式PCR检测结果。M. DL2000 DNA相对分子质量标准；－.阴性对照；+.阳性对照；1~14.样品DNA A. PCR detection for PCV2;B. Nested-PCR detection for PCV3. M. DL2000 DNA marker; －. Negative control; +. Positive control; 1-14. DNA samples 图 1 PCV2和PCV3 PCR检测结果 Figure 1 Partial results of PCR detection for PCV2 and PCV3 |
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图 2 PCVs cap基因的系统进化树 Figure 2 Phylogenetic trees of cap gene of PCVs |
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图 3 PCV3 cap基因的相似性 Figure 3 Identity of cap gene of PCV3 |
Cap氨基酸序列比对分析结果，与5个美国报道的PCV3参考毒株的Cap蛋白氨基酸相似性达98%，NLS含有大量正电荷的精氨酸，YiY-1-11第206位缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A)，与PCV2 Cap蛋白氨基酸序列的比对，PCV3 Cap显示在Loop CD区域缺失掉了8个氨基酸(图 4)，而这8个氨基酸位于病毒衣壳的外表面位置，研究表明适合外源抗原表位的插入[18]，进一步揭示了病毒进化的规律。PCV3 Cap不含有半胱氨酸(cysteine)，而PCV2 Cap Loop DE中含有一个独特的半胱氨酸，能在Cap亚基间形成二硫键，体外研究表明该二硫键的形成在PCV2 VLPs的组装和完整性上起到重要作用[19]。此外，PCV2 Cap CT端含有位于病毒衣壳外表面的PXXP基序，60个PCV2 Cap亚基组装成病毒的衣壳后可能会激活SH3-domain的磷酸化过程，加速病毒入侵宿主细胞[20]，而PCV3 Cap不具有此结构。
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图 4 PCV1、2、3 Cap氨基酸序列比对 Figure 4 Comparative amino acid sequences alignment of the PCVs (PCV1, 2, 3) Caps |
以PCV2 Cap蛋白质亚基的晶体结构为模板[21]，模拟PCV3 Cap蛋白质亚基的三维结构。结果表明，PCV3 Cap亚基也具有一个与PCV2 Cap亚基类似的jelly roll折叠。该折叠存在于很多病毒的结构蛋白质中，由两个β-片层(β-sheets)组成，每一个片层中由4个反平行的β-折叠链组成(图 5B)[22]。结构分析发现，尽管PCV3 Cap亚基包含由两个β-片层结构，但是其中一个片层仅由3条反平行的β-折叠链组成(图 5A)。此外，PCV3 Cap中的β-折叠链长度均要短于PCV2中Cap的β-折叠链(图 5A、B)；与此同时，与PCV2 Cap亚基相比，PCV3 Cap含有更高比例的loop结构。表面结构分析发现，与PCV2 Cap类似，这些loops结构决定了PCV3 Cap表面的大部分结构(图 5C绿色部分)[20]。但PCV2 Cap与PCV3 Cap蛋白质表面结构差异较大，尤其是Loop GH(图 5)。
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PCV2 Cap晶体结构PDB数据库登录号：3R0R，图A、C是以PCV2晶体结构为模板对PCV3 Cap单体的三维结构进行模拟，图B、D是PCV2 Cap亚基的结构展示图，分别用“Cartoon模式”(A、B图)和“Surface模式”(C、D图)进行展示(黄色标记为β-折叠链，绿色标记为loop结构) PDB Protein Data Bank ID:3R0R; Fig. A, C :Results of the PCV3 Cap monomer prediction using the PCV2 Cap as the template is displayed in a cartoon and surface model; Fig. B, D: PCV2 Cap monomer is displayed in a cartoon and surface model (β-strands were labeled in yellow, loops were labeled in green) 图 5 PCV2与PCV3 Cap蛋白质亚基三维结构比较 Figure 5 Comparative 3D structure of Cap monomer of PCV2 and PCV3 |
PCV3 Cap蛋白质的抗原表位预测结果(图 6)，抗原表位氨基酸位置(表 2)，用Pymol展示Cap亚基抗原表位分别用不同的颜色进行标记(图 6B)。PCV2 Cap蛋白质抗原表位根据先前报道结果(表 2)。比较结果发现，PCV2和PCV3 Cap蛋白质不具有共同的线性表位。
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图A为PCV3 Cap抗原表位的预测结果图，图B将预测潜在的抗原表位用不同的颜色标记用“Surface模式”进行展示。34—43 aa.红色；51—61 aa.绿色；93—103 aa.黄色；109—110 aa.桃红色；112—146 aa.青色；149—160 aa.橘色；170—181 aa.咖啡色；192—203 aa.胭脂红色 Fig.A Results of the epitope prediction of the PCV3 Cap; Fig.B Localization of the potential epitopes were labeled in different colors is displayed in surface model (34-43 aa. Red; 51-61 aa. Green; 93-103 aa. Yellow; 109-110 aa. Magenta; 112-146 aa. Cyan; 149-160 aa. Orange; 170-181 aa. Wheat; 192-203 aa. Hotpink) 图 6 PCV3 Cap蛋白抗原表位预测结果 Figure 6 The results of liner epitope prediction of the PCV3 Cap |
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表 2 PCV2和PCV3 Cap蛋白抗原表位的比较 Table 2 Comparative analysis for Cap epitope of PCV2 and PCV3 |
PCV2是造成PCVAD的主要病原体之一，在2003年之前PCV2a为主要流行毒株，现PCV2b为主要流行的毒株[23-25]，PCV2d近期也被报道广泛存在于世界各地[26-28]。2016年10月，R. Palinski等报道了从流产胎猪(其母猪具有PDNS临床病症)中检测到高拷贝的PCV3基因组[17]，值得注意的是，用高灵敏度的PCR和宏基因组测序(metagenomic sequencing)分析显示，在这些病理组织中并未检测到PCV2和其他病毒。更为重要的是，免疫组化结果显示PCV3抗原的同时也出现在典型的PDNS病变组织中。因此，这些结果强烈暗示PCV3可能是这些临床病症的主要致病因子。分子流行病学结果也显示PCV3已经在美国猪场广泛分布。本研究结果首次证明PCV3毒株至少在2014年已经出现在我国部分省份的商业化猪场，且部分病猪表现出PCV2和PCV3的共感染特点，但PCV3单独感染及与其他病原体共感染的致病力有待进一步研究。
PCV2的不同基因亚型因抗原结构或抗原表位的差异，可能导致PCV2疫苗缺乏不同基因亚型间的交叉免疫保护力。PCV2a和PCV2b Cap蛋白质核苷酸序列的相似性为91%~96%，而PCV2d与PCV2b毒株比较，PCV2d毒株在CT第234位多一个赖氨酸(lysine，K)，研究表明234K可能会导致PCV2衣壳表面构象表位的改变，造成免疫失败[25]，目前以PCV2a为主要抗原的商业化疫苗是否对PCV2b能够起到保护作用还存在争议。而目前以PCV2为基础的圆环病毒疫苗是否对PCV3感染具有交叉保护作用需要系统研究。本研究根据已报道的PCV2 Cap蛋白质线性抗原表位，以及对PCV3 Cap蛋白质抗原性分析预测，PCV2和PCV3 Cap蛋白质不具有共同的线性抗原表位。三维结构预测显示，尽管PCV3 Cap蛋白质也包含一个jelly roll折叠，但与PCV2 Cap蛋白质表面结构差异很大，这种结构的差异进一步会对构象型表位的识别产生影响。此外，Cap蛋白质氨基酸序列分析表明PCV2和PCV3 Cap相似性仅约30%；与PCV2 Cap蛋白质亚基相比，PCV3 Cap蛋白质亚基含有更多的loops结构，由于圆环病毒属于非囊膜病毒，在病毒侵染细胞的时候，核衣壳蛋白质参与了病毒与宿主细胞的相互作用，这些loops结构是由非典型的二级结构组成，在与宿主细胞蛋白质相互作用过程中展现出高度的动态性，因而使得其致病机制更加复杂。综上所述，根据上述抗原性和结构分析的结果，预测PCV2和PCV3不具有交叉免疫保护的特性，本研究结果与R. Palinski等的报道一致，因此针对于PCV3疫苗研究和开发，对于控制PCV3临床上的流行是必要的。
4 结论在疑似PDNS综合征病料中检测到PCV3，部分病料表现为PCV2和PCV3共感染。PCV2和PCV3不具有交叉免疫保护的特性。
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