植物性神经对睾丸的功能性调节和营养性作用越来越被大家重视，神经生长因子可以激活睾丸的初级传入神经元[1]，临床上采用睾丸神经切除术治疗顽固性睾丸痛[2]，大鼠生殖股神经切断导致睾丸上升，生殖力减弱[3]，笔者前期的大鼠睾丸去神经试验也证明了早期睾丸去神经会影响睾丸的发育、睾酮的分泌和精子的生成[4]。不管是植物性神经递质NE和Ach还是非神经源性的NE和Ach都是通过作用靶细胞上的受体发挥作用，而NE和Ach作用的受体亚型有多种，在机体不同组织的分布也不一样，肾上腺素能受体主要有α受体和β受体两大类，β2受体在体内各种组织广泛的表达[5]。毒蕈碱型乙酰胆碱受体有5种亚型，分别为M1、M2、M3、M4和M5[6]。这些受体在睾丸组织的分布情况还不清楚，笔者之前的研究发现不同亚型的β受体和不同亚型的M受体在小鼠睾丸发育的早期、青春期前、成年期都有不同表达[7]。但这些受体在睾丸组织的表达定位和生理功能还不是很清楚。本试验在前期研究的基础上进一步研究β2受体和M1受体在小鼠睾丸组织的表达定位，并通过其受体阻断剂研究β2受体和M1受体在睾丸生理功能调控中的作用。
1 材料和方法 1.1 试验动物和材料不同发育时期的昆明白雄性小鼠：出生后1、15、50 d的小鼠(中国科学院动物研究所)；小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系(MLTC-1，中国科学院上海生命科学研究院)；β2受体的阻断剂布托沙明(Butoxamine, Buto)；M1受体阻断剂哌吡氮平(Pirenzepine, Pire)；α1受体阻断剂哌唑嗪(Prazosin，Praz)；抗胆碱药物阿米替林(Amitriptyline，Amy)(Sigma公司)
1.2 肾上腺素能受体β2和胆碱能受体M1 mRNA在小鼠睾丸组织不同发育时期的表达分别取1、15、50 d昆明白雄性小鼠睾丸组织和脑组织，液氮中研磨组织，加入1 mL Trizol混匀，4 ℃12 000 r·min-1离心5 min，取上清，加0.2 mL的氯仿，振荡混匀，离心10 min，取上清水相，加0.5 mL异丙醇混匀室温5 min，离心10 min，弃上清，加1 mL预冷的乙醇振荡洗涤，8 000 r·min-1离心5 min，吹干，加20~30 μL的DEPC水。取3 μg总RNA，加入2 μL oligo(dT)合成cDNA第一条链，特异性引物用于PCR。取2 μL的反转录产物cDNA加至PCR反应体系中。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃变性30 s，不同退火温度退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min，HPRT作为内参，引物序列和退火温度见表 1。
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表 1 引物序列 Table 1 Primer sequence |
取50 d小鼠睾丸组织和脑组织，4%多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，5 cm厚连续切片，然后脱蜡，水化，灭活内源性过氧化物酶，微波加热抗原修复，再用10%的正常羊血清在室温下孵育1 h，封闭非特异性抗原。一抗分别加入1：200稀释的β2AR兔源多克隆抗体和M1R羊源的多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，用PBS或兔血清代替一抗作为阴性对照；脑组织为阳性对照；二抗使用生物素标记的羊抗兔IgG(GARB, 1：150) 和驴抗羊IgG(DAGB，1：150)，室温孵育3 h。三抗使用辣根过氧化物酶标记的链酶亲合素(SP-HRP，1：150)，室温孵育2 h。显色用0.05 mol·L-1的TBS缓冲液配制0.5 mg·mL-1的DAB，并按每400 μL DAB溶液加入2 μL 30%过氧化氢，配制好显色液，滴加在切片上，显色5 min，然后用自来水冲洗，终止反应。苏木精复染，显微镜下观察并拍片。
1.4 MTT法检测不同浓度NE和Ach对MLTC-1细胞增殖的影响将接种好的MLTC-1间质瘤细胞于37 ℃培养箱培养24 h后，分别加入不同浓度的NE和Ach，使终浓度分别为10-4、10-5、10-6、10-7 mol·L-1，另外一组加入等量的PBS作为阴性对照(Con)，另一组加入hLH(IU·mL-1)作为阳性对照，继续培养24 h，然后加入20 μL MTT(5 mg·mL-1)，继续培养4 h，然后弃上清，每孔加入150 μL的二甲基亚砜，摇床低速振荡30 min，然后酶联免疫检测570 nm波长处的吸光值[11]。
1.5 β2受体阻断剂和M受体阻断剂对MLTC-1细胞增殖的影响将接种好的MLTC-1间质瘤细胞于37 ℃培养箱培养24 h后，分别加入NE、Ach、NE+Buto、NE+Praz、Ach+Pire、Ach+Amy、Buto、Pire、Amy使其终浓度为10-5 mol·L-1，另外一组加入等量的PBS作为阴性对照，培养24 h，然后加入20 μL MTT(5 mg·mL-1)，继续培养4 h，然后弃上清, 每孔加入150 μL的二甲基亚砜，摇床低速振荡30 min，然后酶联免疫检测570 nm波长处的吸光值。
1.6 NE和Ach对MLTC-1细胞3β-HSD、ERα和ERβ mRNA表达的影响将接种好的MLTC-1细胞于37 ℃培养箱培养24 h后，分别加入NE、Ach、NE+Buto、Ach+Pire，使其终浓度为10-5 mol·L-1，另外一组加入等量的PBS作为阴性对照，继续培养24 h后, 收集细胞，每孔加入500 μL Trizol, 吹下细胞，冰上静置5 min，然后移入1 mL离心管，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，其他操作同1.2，引物序列和退火温度见表 1。
1.7 数据分析所有试验数据均用“平均值(标准差(mean±SE)”表示。数据差异显著性采用SPSS软件分析，P＜0.05则差异显著。PCR产物电泳条带的光密度值用软件(Alphalmager 2200 software)分析。
2 结果 2.1 β2受体和M1受体mRNA在小鼠睾丸组织不同发育时期的表达由图 1睾丸组织RT-PCR的检测结果可以看出, 肾上腺素能受体β2和胆碱能受体M1在小鼠发育的1、15、50 d均有明显表达，且β2AR在睾丸发育的不同时期表达没有明显的不同，而M1R随着睾丸发育成熟表达有明显减弱的趋势。
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M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1.50 d; 2.15 d; 3.1 d；+.阳性对照(脑)；其他为睾丸 M.DL2000 DNA marker; 1.50 d; 2.15 d; 3.1 d; +.Psotive control(brain); Others are testis 图 1 不同发育时期肾上腺素能受体β2和胆碱能受体M1 mRNA在小鼠睾丸的表达 Figure 1 Expression of β2AR and M1R mRNA on mouse testis in different development stages |
图 2表明，β2受体主要在小鼠睾丸间质细胞表达，并且大多数间质细胞都表达β2受体，另外少量的支持细胞也有β2受体表达。M1受体也主要在睾丸间质细胞表达, 但不是所有间质细胞都表达，被膜下间质细胞表达较多，实质间质细胞只是在不同部位零星表达。
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A，a.PBS阴性对照; B.β2受体在小鼠睾丸组织表达; C.β2受体在阳性组织脑中的表达；b和c.M1受体在小鼠睾丸组织中的表达 A, a.Negative control (PBS); B. β2AR positive staining in mouse testis; C. β2AR positive staining in mouse brain. b and c. M1R positive staining in mouse testis 图 2 β2受体和M1受体在小鼠睾丸中免疫组织化学定位(棕色为阳性结果)(40×) Figure 2 Immunohistochemical localization (brown are positive) of β2AR and M1R in mouse testis(40×) |
由图 3A和图 3B可见, NE和Ach对MLTC-1细胞的增殖具有明显促进作用，其中NE浓度为10-4、10-5和10-6mol·L-1时均可明显促进MLTC-1细胞的增殖(P＜0.05)，而10-5和10-6 mol·L-1Ach也能显著促进MLTC-1细胞增殖(P＜0.05)。
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*.P＜0.05。Con.阴性对照。下同。hLH.阳性对照 *.P < 0.05.Con.Negative control.The same as below.hLH.Positive control 图 3 不同剂量NE(A)和Ach(B)对MLTC-1细胞增殖的影响 Figure 3 Different doses of NE (A) and Ach (B) on proliferation of MLTC-1 cells |
由图 4(A)的结果可见，与对照组相比NE可明显促进MLTC-1细胞的增殖(P＜0.05)，NE+Buto组和NE+Praz组与对照组相比差异均不显著(P＞0.05)，Buto和Praz本身均不影响MLTC-1细胞的增殖(P＞0.05)。说明β2受体阻断剂Buto和α1受体阻断剂Praz都能明显阻断NE对MLTC-1细胞的促增殖作用，可见β2受体和α1受体作为功能受体对间质细胞的增殖都具有一定的调节作用。
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图 4 NE受体阻断剂(A)和Ach受体阻断剂(B)对MLTC-1细胞增殖的影响 Figure 4 Effects of NE receptor blockers and Ach receptor blockers on proliferation of MLTC-1 cells |
由图 4(B)的试验结果可见，Ach可明显促进MLTC-1细胞的增殖(P＜0.05)，Ach+Pire组的结果与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，说明M1受体阻断剂Pire能明显阻断Ach对MLTC-1细胞的促增殖作用。而Ach+Amy组的结果与对照组相比差异显著(P＜0.05)，说明抗胆碱药物Amy不能阻断Ach的促增殖作用。M1受体阻断剂Pire和抗胆碱药物Amy自身均不影响MLTC-1细胞的生长(P＞0.05)。
2.5 NE和Ach对MLTC-1细胞3β-HSD、ERα、ERβ mRNA表达的影响由图 5表明，NE和Ach可明显抑制MLTC-1细胞3β-HSD mRNA的表达，而β2受体阻断剂Buto和M1受体阻断剂Pire明显阻断了NE和Ach抑制3β-HSD mRNA表达的作用，说明β2受体和M1受体在调节睾丸3β-HSD表达方面具有一定的作用。
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1. Control; 2. NE; 3. Ach; 4. NE + Buto; 5. Ach + Pire 图 5 NE和Ach及其受体阻断剂Buto和Pire对MLTC-1细胞3β-HSD、ERα和ERβ mRNA表达的影响 Figure 5 Effects of NE, Ach, Buto and Pire on the expression levels of 3β-HSD, ERα and ERβ mRNA in the cultured MLTC-1 cells |
NE可明显促进睾丸ERα mRNA的表达，但不影响ERβ mRNA的表达。Ach可促进ERβ mRNA的表达，但却抑制ERα mRNA的表达。而β2受体阻断剂Buto和M1受体阻断剂Pire均不能阻断NE和Ach对MLTC-1细胞ERα和ERβ mRNA表达的调节作用。表明NE和Ach对睾丸间质细胞3β-HSD mRNA表达的影响有可能与ERα和ERβ mRNA的上调有关。
3 讨论本研究结果表明，在小鼠发育的早期(1 d)、中期(15 d)和成年期(50 d)，β2受体和M1受体在睾丸组织均有明显表达，说明睾丸的发育和成年期睾丸生理功能的调节离不开β2受体和M1受体介导的NE和Ach对睾丸靶细胞的作用。与笔者前期的研究结果一致，大鼠出生后10 d睾丸去神经显著影响了睾丸曲细精管的发育和精子的生成[16]。对于β2受体和M1受体在睾丸组织的表达定位，免疫组织化学结果显示，主要在睾丸间质细胞表达，支持细胞只有少量β2受体表达，没有M1受体表达。说明由β2受体和M1受体介导NE和Ach作用睾丸的靶细胞主要是间质细胞。睾丸被膜动作电位产生从而引发收缩，主要是通过M3受体介导的[17]。而非神经源性的N型乙酰胆碱受体在曲细精管的精原细胞、精母细胞以及支持细胞广泛表达，调节生殖细胞的分化[18]。表明不同受体介导NE和Ach对靶细胞的功能是不一样的。
由β2受体和M1受体介导的NE和Ach对睾丸间质细胞功能的调节通过体外培养MLTC-1细胞进行了研究，发现NE可通过β2受体和α1受体介导促进间质细胞的增殖，而Ach则可通过作用于M1受体促进间质细胞增殖。有研究表明支持细胞膜表达β2受体，介导的生物效应和FSH作用类似[19]，影响附睾的功能主要是α1受体而不是α2受体[20]。而本研究结果表明，介导NE对间质细胞促增殖作用的是β2受体和α1受体，介导Ach作用的主要是分布于间质细胞的M1受体。
3β-HSD酶是睾丸间质细胞合成雄激素的关键酶之一，结果表明，植物性神经递质NE和Ach可明显抑制间质细胞3β-HSD mRNA的表达，β2受体阻断剂和M1受体阻断剂可阻断NE和Ach的抑制作用。说明NE和Ach是通过β2受体和M1受体介导间质细胞3β-HSD酶的合成从而影响睾酮的合成。其他学者研究发现用β2受体激动剂可明显抑制睾酮合成的限速酶类固醇激素快速调节蛋白StAR的表达[21]，可见NE调节间质细胞雄激素的合成主要是通过β2受体介导的，另外应激反应的儿茶酚胺类激素造成对细胞DNA损伤也主要是通过β2受体介导的[22]，这也可能是长期应激刺激造成雄性生殖能力低下的主要原因。
NE和Ach调节间质细胞雌激素受体ERα和ERβ mRNA的表达。具有类雌激素样作用的玉米赤霉烯酮可通过调节睾丸ERα和ERβ的表达，影响睾酮分泌[23]。而ERα主要参与促性腺激素的负反馈调节，ERβ主要参与精子的生成和释放[24]。本研究结果表明，NE对ERα mRNA的表达有上调作用，而Ach上调ERβ mRNA的表达，并且β2受体阻断剂和M1受体阻断剂均不能阻断其作用，说明NE和Ach对间质细胞ERα和ERβ mRNA表达的调节作用并不是由β2受体和M1受体介导的。NE和Ach调节睾丸间质细胞的功能一方面通过β2受体和M1受体介导直接影响3β-HSD酶的表达，另一方面可能通过其他受体介导影响间质细胞雌激素受体ERα和ERβ的表达间接作用。
4 结论β2受体和M1受体主要在睾丸间质细胞表达；植物性神经递质NE和Ach主要通过作用睾丸间质细胞的β2受体和M1受体促进间质细胞增殖；NE和Ach抑制间质细胞睾酮合成关键酶3β-HSD表达，可能与ERα和ERβ mRNA的上调有关。
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