2. 河北北方学院, 张家口 075000;
3. 河北大学中医系, 保定 071001;
4. 河北科技大学生物科学与工程学院, 石家庄 050018
2. Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China;
3. Department of Traditional Chinese Medicine, Hebei University, Baoding 071001, China;
4. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China
基因组印记(Genomic imprinting)是一种表观遗传学现象，是指一些基因在哺乳动物的发育过程中的表达具有亲本选择性，即只有来源于父本的等位基因或来源于母本的等位基因表达，而另一等位基因不表达的现象[1]。印记基因不仅调控胚胎和胎盘的生长，还会影响动物出生后的发育，与后期某些疾病的发生有关[2-3]。印记基因表达剂量的紊乱还与人类的多种先天性疾病(包括Prader-Willi，Angelman和Beckwith-Wiedemann综合征)以及癌症的发生和发展有关[4]。
印记基因通常成簇存在，而Gab1(Grb2-associated binding protein binder 1) 和Sfmbt2(Scm-like with four mbt domains 2) 是在鼠中发现的2个独立存在的父源等位基因表达的印记基因，分别定位于鼠染色体8C3 (小鼠中期染色体区，8号染色体C区第3条带)和2号染色体近端[5-6]。Gab1作为一种分布广泛的接头蛋白，能够被多种生长因子和细胞因子激活，可能在PI3K/Akt信号通路中扮有重要角色[7-8]。Sfmbt2基因是一个多梳基因(Polycomb group, PcG)，编码染色质调节蛋白[9]，在许多基因的表观遗传调控中起重要作用。目前，在牛中针对的研究很少，本研究主要对Gab1和Sfmbt2基因在牛组织和胎盘中的印记状态进行分析，为研究Gab1和Sfmbt2基因的功能奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验动物32头成年的荷斯坦奶牛(均为雌性)经屠宰后，立即采取各个体的组织(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪)装入有编号的采样袋中，放入液氮中，－70 ℃保存。
采集30头成年荷斯坦奶牛正常分娩后的胎盘，装入采样袋中，液氮运输，－70 ℃保存。
1.2 试验方法 1.2.1 RNA的提取及反转录利用RNAios plus试剂盒(TaKaRa，中国)提取组织的总RNA，加入无RNA酶的DNase-Ⅰ，去除可能的DNA污染，保存于－70 ℃。利用TransGen反转录试剂盒(全式金，中国)将总RNA反转录成cDNA。反应体系中加入大约1 μg的RNA，1 μL的Oligo(dT)引物，10 μL 2×ES Reaction Mix，1 μL RT Enzyme Mix，1 μL gDNA Remover，用无RNase-free Water补足体系至20 μL。反转录过程按照说明书进行，Oligo(dT)和反转录酶RT Enzyme Mix引导合成cDNA，gDNA Remover进一步去除基因组DNA。反应之前，先将模板RNA、引物Oligo(dT)和RNase-free Water混匀，65 ℃孵育5 min，打开RNA二级结构。随后加入反转录酶RT Enzyme Mix，2×ES Reaction Mix和gDNA Remover，42 ℃进行30 min，85 ℃终止反应。－20 ℃保存。
1.2.2 RT-PCR分析等位基因表达通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找牛Gab1 mRNA序列(Accession No.: NM_001101201.1) 和Sfmbt2 mRNA序列(Accession No.: NM_001205956.1)。利用Primer 5软件对2个基因设计引物(表 1)扩增来源于试验动物各个组织的cDNA。利用1对跨内含子的引物(表 1)Gap-F和Gap-R扩增一段375 bp大小的GAPDH(Accession No.: BTU85042) 片段作为内参。25 μL PCR反应体系：2.5 μL 10×LA Taq Buffer，2 μL 2.5 mmol·L-1 dNTPs，0.1 μL LA Taq DNA聚合酶，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板1 μL(50 ng)，补充ddH2O至25 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
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表 1 所用引物序列 Table 1 Primer sequences used in the study |
利用DNA提取试剂盒(生工，中国)提取32头荷斯坦奶牛的肝组织和30头荷斯坦奶牛胎盘的DNA。利用Primer 5软件设计的引物(表 1)分别扩增Gab1和Sfmbt2基因的DNA。PCR反应体系和反应条件与RT-PCR(1.2.2) 相同，其中模板为32头牛肝组织的DNA。扩增产物用E.Z.N.A Gel-胶回收试剂盒(Omega，美国)纯化回收，送华大基因公司测序。利用Chromas查看峰图，如果存在有效重叠峰，即为杂合子个体。
1.2.4 Gab1和Sfmbt2基因印记状态分析杂合子牛的组织(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪)和胎盘用于等位基因特异的表达分析。将杂合子牛的RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板扩增Gab1和Sfmbt2目的片段，反应体系和反应条件与1.2.2部分的RT-PCR相同。扩增产物纯化回收，测序。利用Chromas查看SNP位点的峰图，如果为双峰，则为双等位基因表达；若为单峰则为单等位基因表达。
2 结果 2.1 Gab1和Sfmbt2基因在牛7个组织中的表达应用RT-PCR方法检测Gab1和Sfmbt2基因在牛7个组织中的表达。随机提取3头牛7个组织(心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪)的RNA，以反转录生成的cDNA为模板，用Gab1引物(F2和R2) 和Sfmbt2引物(F2和R2) 进行扩增，分别得到828和572 bp大小的片段(图 1A)。在被分析的7个组织中均能检测到Gab1和Sfmbt2基因的表达。Gab1基因在心、肝、脾、肺、肾和肌肉6个组织中表达量很高，在脂肪中表达很弱，而Sfmbt2基因在7个组织中表达量都较低。
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A.Gab1和Sfmbt2在牛7个组织中的表达水平:1~7.心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪；M.DNA相对分子质量标准(DL2000: 2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；RT-.阴性对照。B.牛基因组中Gab1和Sfmbt2基因SNPs的鉴定，箭头位置为SNP位置。C.杂合子牛心、肝、脾、肺、肾、肌肉和脂肪的RT-PCR测序峰图，箭头位置为SNP位置 A.The expression levels of Gab1 and Sfmbt2 in different tissues in cattle: 1-7. RT-PCR products obtained from heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle and fat; M. DNA marker DL2000 (2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp); RT-. Negative control. B. Identification of SNPs in bovine Gab1 and Sfmbt2 genes, the arrows point the position of SNP. C. Sequence chromatograms of RT-PCR products obtained from 7 tissues of hybrid cattle, including heart, liver, spleen, lung, kidney, muscle and fat, the arrows point the position of SNP 图 1 牛Gab1和Sfmbt2在不同组织中的表达及印记状态 Figure 1 Expression and imprinting status of Gab1 and Sfmbt2 in different tissues of adult cattle |
用Gab1(F1和R1) 和Sfmbt2(F1和R1) 引物对32头牛的基因组进行PCR扩增，分别得到621和490 bp的PCR产物并直接回收测序。分析测序峰图，在Gab1基因扩增产物的407 bp处存在1个A＞G SNP(rs110004638)，在Sfmbt2基因扩增产物的176 bp处存在1个G＞A SNP(rs209028760)(图 1B)。鉴定出的杂合子牛用于Gab1(n=4) 和Sfmbt2(n=3) 基因在牛组织中等位基因特异的表达分析。
2.2.2 Gab1和Sfmbt2在牛组织中的等位基因特异的表达分析通过对比杂合子牛基因组扩增产物和cDNA扩增产物在SNP位点处的测序峰图，确定Gab1和Sfmbt2基因在不同组织中等位基因特异的表达状态。结果显示，Gab1和Sfmbt2基因在7个被检测的组织中均为双峰(图 1C)，即Gab1和Sfmbt2为双等位基因表达，是非印记的。
2.3 Gab1和Sfmbt2在牛胎盘组织中等位基因特异的表达分析 2.3.1 牛胎盘组织中SNP的检测用Gab1引物(F1和R1) 和Sfmbt2 (F3和R3) 两对引物分别对牛胎盘组织的基因组进行PCR扩增，得到621和676 bp的扩增产物，回收产物并直接测序。分析测序峰图发现，在Gab1基因扩增产物的407 bp处存在1个A＞G SNP(rs110004638)，在Sfmbt2基因扩增产物的203 bp处存在1个T＞C SNP(rs41681733)(图 2B)。在30个牛胎盘样本中包括3个Gab1基因杂合子和4个Sfmbt2基因杂合子，所有杂合子牛胎盘用于Gab1和Sfmbt2基因在胎盘组织中等位基因的特异性表达分析。
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A. Gab1和Sfmbt2在杂合子牛胎盘组织中的表达水平：1~3和1~4分别是Gab1和Sfmbt2在不同杂合牛个体胎盘组织中的表达情况；M.DNA相对分子质量标准(DL2000: 2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；RT-.阴性对照。B.牛Gab1和Sfmbt2基因中SNPs的鉴定，箭头位置为SNP位置。C.杂合子牛胎盘组织的RT-PCR测序峰图，箭头位置为SNP位置 A. The expression levels of Gab1 and Sfmbt2 in placenta in hybrid cattle: 1-3 and 1-4. RT-PCR products of Gab1 and Sfmbt2 obtained from placenta in hybrid cattle; M. DNA marker DL2000 (2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp); RT-. Negative control. B. Identification of SNPs in bovine Gab1 and Sfmbt2 genes, the arrows point the position of SNP. C. Sequence chromatograms of RT-PCR products obtained from placenta in hybrid cattle, the arrows point the position of SNP 图 2 牛Gab1和Sfmbt2在胎盘中的表达及印记状态 Figure 2 Expression and imprinting status of Gab1 and Sfmbt2 in placenta of adult cattle |
提取杂合子牛胎盘组织的RNA，将其反转录成的cDNA作为模板，用引物Gab1(F2和R2) 和Sfmbt2引物(F4和R4) 进行PCR扩增，分别得到828 bp的Gab1和524 bp的Sfmbt2的扩增产物(图 2A)，经测序验证扩增产物为目的片段。分析扩增产物在SNP位点处的测序峰图，发现Gab1和Sfmbt2基因在所有杂合个体的胎盘组织中均为双峰(图 2C)，即Gab1和Sfmbt2在胎盘组织中为双等位基因表达，是非印记的。
3 讨论Gab1作为多种受体酪氨酸激酶信号传导介质，调节多个信号多条信号转导途径[10]。缺失Gab1基因的小鼠胚胎在出生前死亡，并表现出心、胎盘和皮肤的发育异常[11]。Gab1在单性生殖囊胚中的表达水平低于受精的胚胎[12]。本研究发现，Gab1在成年牛的组织中是非印记的。这与Gab1在小鼠的胚胎组织卵黄囊以及成年组织中不印记的结果相类似[5]。Sfmbt2基因是一个PcG基因，编码的SFMBT蛋白具有MBT(Malignant brain tumor)结构域，MBT通过识别并结合组蛋白H3和H4中甲基化的赖氨酸残基，维持染色质的抑制状态，从而调控基因的表达[13-14]。最近有研究表明，Sfmbt2不仅在前列腺癌细胞的生长中起重要作用[15]，还能够负调控癌细胞的迁移和侵袭[16]。在大鼠和小鼠的早期胚胎中，Sfmbt2是印记的，表现为父源等位基因表达，在7.5 d后的组织中印记丢失[6]。本研究发现，Sfmbt2在成年牛的组织中是非印记的。这与前期对Sfmbt2在牛囊胚中印记状态的研究结果相一致[17]。
基因组印记是在哺乳动物进化过程中产生的，与胎盘的发育和功能直接相关[2, 18]。印记基因在胎盘的发育中起重要作用[19-20]。许多的印记基因在胎盘中表达，调控胎儿的营养供给[21-24]。Gab1在胎盘的发育过程中也起重要作用[11, 25]，Gab1的缺失会造成迷宫区滋养层细胞数量的减少，导致胎盘体积减小[11]。在克隆鼠胎盘中，Gab1和Sfmbt2基因的过表达可能与胎盘的肥大症有关[26]。父源等位基因表达的Sfmbt2在滋养层的维持和胎盘的发育过程中起重要作用[27]，鼠2号染色体近端父源等位基因加倍引起Sfmbt2基因过表达，会导致胎盘肥大(Placentomegaly)[28]。本研究发现，Gab1和Sfmbt2基因在牛的胎盘中都为双等位基因表达，是不印记的，这与Gab1和Sfmbt2基因在人的胎盘中的表达相类似。在大鼠和小鼠Sfmbt2基因第10内含子中，插入了一个miRNAs簇，而在人和牛的Sfmbt2中，没有相应的miRNAs簇，因而鼠中Sfmbt2基因印记的获得可能与miRNAs簇的插入相关[17]。
4 结论本研究发现，Gab1和Sfmbt2在被检测的7个组织和胎盘中均为双等位基因表达，说明Gab1和Sfmbt2在牛的组织和胎盘中是非印记的。
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