2. 河北科技师范学院, 秦皇岛 066600;
3. 西北农林科技大学动物科技学院, 杨凌 712100;
4. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193
, WANG Han3, ZHANG Xiu-ling1,4, LIU Chun-yang1, WANG Qi1, ZHOU Rong-yan1, LI Lan-hui2
, LI Lan-hui1
2. Hebei Normal University of Science & Technology, Qinhuangdao 066600, China;
3. College of Animal Science and Technology, Northwest A & F University, Yangling 712100, China;
4. Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
A.S.Serebrovsky首次提出影响羽毛生长发育的羽速基因位于Z染色体，其中快羽基因k+为野生型隐性基因，而慢羽基因K为显性突变基因[1]。快慢羽速表型表现为雏鸡主翼羽和副主翼羽长度的明显差异，利用羽速表型进行雏鸡性别自体鉴别的技术在种禽业已被广泛推广使用[2-3]。Z染色体基因序列180 kb的重复是慢羽形成的原因之一，慢羽K基因至少在一条Z染色体上存在两个同源区域：整合有内源白血病毒ev21基因的占位区(OS)和无ev21的非占位区(US)，慢羽鸡部分复制的PRLR和SPEF2基因将两个整合位点分隔开，US区位于Z染色体PRLR和SPEF2基因间，而快羽k+基因只有US区[4-6]。内源逆转录病毒ev21插入与羽速相关，但并不是慢羽表型的唯一原因[7]。
羽速类型的分子基础研究较深入，并建立了多种分子检测方法，M.H.Tixier-Boichard等建立了基于OS和US区差异的ev21检测方法[8]。I.Levin等发现慢羽OS区存在1个A＞G转换，引起TTAGTTAG 8个碱基的插入，破坏了US区Hae Ⅲ的酶切识别位点GGCC序列，基于该位点变异建立了羽速表型的分子检测方法，并认为慢羽表型与ev21插入存在完全的遗传相关[9-10]。F.Iraqi等利用US区1 450 bp片段Hae Ⅲ酶切位点的差异性对白来航慢羽公鸡的基因型进行了鉴别[11]，认为该酶切检测方法可能不适用其他品种。M.G.Elferink等建立了基于176 324 bp重复区域内PRLR和SPEF2基因连接断裂点的慢羽基因型检测方法[12]。
近年来，1 450 bp酶切鉴定快慢羽的方法在国内广泛用于种鸡群的建立，李培周等利用该技术检测了贵妃鸡的羽速基因[13]，并对清远麻鸡进行了羽速分型[14]；李珊珊等利用该方法建立了麒麟公鸡纯合慢羽群体[15]。李竞一等采用同样的方法对慢羽鸡的ev21内源病毒进行了筛选[16]。
本试验利用1 450 bp酶切检测方法[11]，分析不同品种鸡US区结构特征与慢羽表型关系的差异性，建立US和OS区共有区域以及OS区特异区域的Hae Ⅲ酶切方法，分析鸡的US和OS区以及ev21插入的结构特征，明确1 450 bp酶切方法应用于快慢羽鉴别和ev21病毒检测的分子基础欠缺性，为慢羽的遗传育种以及快慢羽表型的分子鉴定方法提供理论依据和参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料采集不同品种的鸡血液DNA，包括河北省石家庄赞皇县天然公司柴鸡养殖场的太行鸡(经表型鉴定)、张家口坝上长尾鸡(经表型鉴定)、河北满城种鸡孵化场的海兰灰鸡(羽速自别雌雄，公鸡为慢羽杂合，母鸡为快羽)、河北满城种鸡孵化场的海兰褐鸡(羽色自别雌雄，羽速表型鉴定)、河北徐水大午农牧集团种禽有限公司的大午粉祖代慢羽公鸡(白莱航品系)、河北邯郸华裕家禽有限公司的海兰灰祖代A、B、C和D四系鸡(A和B为快羽公鸡和母鸡，C和D为慢羽公鸡和快羽母鸡)。
1.2 试验方法 1.2.1 引物设计参考李竞一等[16]的鸡羽速基因型分子鉴定引物(F9和R23) 扩增1 450 bp序列。根据NCBI数据库ev21病毒未占位区序列(X54093) 和占位区序列(X54094) 的共有序列，设计包含Hae Ⅲ酶切位点的引物对538S和538A；基于X54094特异序列，设计包含Hae Ⅲ酶切位点的引物对1440S和1440A。引物序列见表 1。
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表 1 PCR反应引物 Table 1 Primers for PCR |
1 450、538和1 440 bp序列PCR体系均：Mix 5 μL，正、反引物(10 μmol·L-1)各0. 5 μL，基因组0.5 μL，ddH2O 2.5 μL。1 450 bp序列反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火90 s，72 ℃延伸2 min，32个循环；72 ℃延伸15 min。538 bp序列反应程序：95 ℃预变性5min；95 ℃变性30s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸33 s，32个循环；72 ℃延伸7 min。1 440 bp序列PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，68 ℃退火90 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。
Hae Ⅲ酶切体系和反应程序：1 450、538和1 440 bp PCR产物各4 μL，ddH2O 13 μL，10×M Buffer 2 μL，Hae Ⅲ酶1 μL。混匀离心后，37 ℃过夜酶切9~12 h，酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶检测。
2 结果 2.1 ev21的US区1 450 bp序列PCR和Hae Ⅲ酶切鉴定ev21内源病毒US区1 450 bp PCR扩增目的条带(图 1A)，经Hae Ⅲ酶切后，凝胶检测如图 1B所示。
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A.1 450 bp PCR产物。B.1 450 bp片段Hae Ⅲ酶切结果：2、4、8、10.野生型；5、6、7.突变型；1、3、9.杂合型 A. PCR products of 1 450 bp. B. Hae Ⅲ digestion result of 1 450 bp: 2, 4, 8, 10. Wild type; 5, 6, 7. Mutant type; 1, 3, 9. Heterozygous type 图 1 太行鸡US区1 450 bp PCR和酶切结果 Figure 1 Result of PCR and digestion of 1 450 bp in US of Taihang chicken |
经华大测序获得的1 450 bp碱基序列与NCBI中Nucleotide数据库比对后，明确1 450 bp序列为鸡内源白血病毒ev21未占区序列，其中g. CTTGGCCACT的GGCC为Hae Ⅲ内切酶的识别位点，酶切后表现为1 068和392 bp两条带(图 1B的第2、4、8和10泳道)为野生型；g. CTTGGCCACT序列中的第1个G突变为A，并在第2个G后插入TTAGTTAG 8个碱基，序列变为g. 
参照F.Iraqi和李竞一等的研究结果[11, 16]：公鸡野生型酶切后2条带为快羽，突变型酶切后1条带为慢羽纯合体，杂合型酶切后3条带为慢羽杂合体；母鸡突变型为慢羽，野生型为快羽。对经表型鉴定的太行鸡(126只)、坝上长尾鸡(36只)、大午粉祖代鸡(20只)、海兰褐鸡(47只)、海兰灰鸡(10只)和海兰灰祖代A、B、C和D四系鸡(74只)进行1 450 bp的RFLP检测，汇总6个品种/系快慢羽公母鸡的酶切结果，见表 2。
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表 2 6个品种/系鸡1 450 bp片段酶切结果 Table 2 Digestion result of 1 450 bp for 6 breeds/strains of chicken |
根据US区1 450 bp酶切结果，从表 2得出各品种/系鸡表型与酶切结果的矛盾性。25只太行快羽公鸡中, 2只鉴定为慢羽杂合体；35只慢羽公鸡中21只为快羽，14只为慢羽杂合体；37只快羽母鸡中1只鉴定为慢羽；29只慢羽母鸡中21只为快羽个体，8只为慢羽杂合体。太行快羽公鸡、慢羽公鸡、快羽母鸡和慢羽母鸡酶切结果与表型分歧率分别为8.0%、60.0%、2.7%和72.4%。36只慢羽坝上长尾公鸡中10只鉴定为慢羽杂合体、25只为快羽、1只慢羽纯合体，与表型鉴定分歧率为71.4%。可以发现慢羽表型与酶切结果出现严重矛盾。20只大午粉祖代慢羽公鸡全部鉴定为慢羽纯合体，8只海兰灰商品代慢羽公鸡全部鉴定为慢羽杂合体，2只海兰灰商品代快羽母鸡鉴定为快羽，海兰灰祖代A、B系鉴定为快羽，C系鉴定为慢羽公鸡纯合体，D系鉴定为快羽母鸡，这6个品系的表型与酶切结果完全一致，分歧率为0.0%。但需要指出的是海兰灰祖代D系为直接引进慢羽祖代种鸡，但经1 450 bp酶切检测为快羽(课题组采用其他分子检测方法验证为快羽母鸡)。海兰褐11只快羽公鸡和13只快羽母鸡酶切结果均为2条带，酶切鉴定与表型鉴定完全一致；而12只慢羽公鸡和11只慢羽母鸡酶切也为2条带，鉴定结果与表型完全不符。
以上结果表明，太行鸡、坝上长尾鸡和海兰褐的US区1 450 bp八碱基插入突变与羽速表型不相关，但该突变在海兰灰系列即白莱航品系中与慢羽表型紧密连锁。
2.2 OS区和US区共有区域538 bp酶切鉴定结果Blast比对分析发现, 1 450 bp序列与ev21病毒US区序列(X54093) 和OS区序列(X54094) 的覆盖率分别为100%和90%，相似度为99%和98%。比对X54093和X54094发现二者具有1 363 bp的序列同源性，相似度为98%，并且Hae Ⅲ酶切位点包含在同源序列中。
设计引物538S和538A扩增OS区和US区同源序列538 bp，对扩增产物进行Hae Ⅲ酶切，PCR和酶切电泳检测结果见图 2。
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A.538 bp PCR产物。B. 538 bp片段Hae Ⅲ酶切结果：1、6、8、9.野生型；10.突变型；2~5、7、11~14.杂合型 A. PCR products of 538 bp. B. Hae Ⅲ digestion result of 538 bp: 1, 6, 8, 9. Wild type; 10. Mutant type; 2-5, 7, 11-14. Heterozygous type 图 2 OS区和US区共有序列538 bp PCR产物和酶切结果 Figure 2 Result of PCR and digestion for 538 bp common sequence for OS and US regions |
图 2A显示538 bp PCR结果条带单一清晰，对538 bp扩增产物进行Hae Ⅲ酶切，图 2B显示1、6、8和9泳道为2条带，分别为333和205 bp；2~5、7、11~14泳道为3条带，分别为538、333和205 bp；泳道10为1条没有被切开的538 bp条带。按照1 450 bp酶切结果判断羽速表型，酶切1条带为快羽，2条带为慢羽纯合，3条带为慢羽杂合，汇总太行鸡(121只)、海兰灰鸡(5只)和海兰褐鸡(24只)538 bp的酶切结果，见表 3。
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表 3 太行鸡、海兰灰和海兰褐鸡538 bp酶切结果 Table 3 Digestion result of 538 bp for Taihang, Hy-line Gray and Hy-line Brown chickens |
由表 3可知，25只太行快羽公鸡中23只酶切为2条带鉴定为快羽，2只酶切为3条带鉴定为慢羽杂合体；34只太行慢羽公鸡全部酶切为3条带，鉴定为慢羽杂合；33只太行快羽母鸡中32只酶切为2条带鉴定为快羽，1只酶切为1条带鉴定为慢羽；29只太行慢羽母鸡中27只酶切为3条带鉴定为慢羽杂合体，2只为2条带鉴定为快羽。太行快羽公鸡、慢羽公鸡、快羽母鸡和慢羽母鸡酶切结果与表型一致率分别达到92.0%、100.0%、97.0%和93.1%。海兰灰慢羽公鸡和快羽母鸡的鉴定结果与表型一致率达到100%，海兰灰是羽速自别雌雄群体，整齐度较好，只代表性的检测了慢羽公鸡3个样本，快羽母鸡2个样本。海兰褐快羽公鸡、慢羽公鸡、快羽母鸡和慢羽母鸡各16只，除快羽公鸡与表型鉴定一致率为0.0%，其他均为100.0%。海兰灰祖代四系鸡各15只，鉴定结果与表型完全一致。
以OS和US区同源序列538 bp片段进行Hae Ⅲ酶切鉴定羽速表型显著提高了太行鸡的鉴定准确度，海兰灰系列的鉴定准确度为100%，海兰褐除快羽公鸡不能鉴定外，其他表型与鉴定结果完全一致。
2.3 占位区1 440 bp序列PCR和酶切结果设计1440S和1440A引物扩增OS区特异序列1 440 bp，琼脂糖凝胶电泳可见亮度很高的目的条带(图 3A)。1 440 bp产物与T3载体连接测序后显示序列Hae Ⅲ酶切位点处确有8个碱基插入，酶切位点消失。
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A. 1 440 bp片段PCR产物；B.1 440 bp片段的Hae Ⅲ酶切结果 A. PCR products of 1 440 bp; B. Hae Ⅲ digestion result of 1 440 bp 图 3 太行鸡OS区特异序列1 440 bp PCR产物和酶切结果 Figure 3 PCR and digestion result of 1 440 bp for OS special region of Taihang chicken |
图 3A显示11、18、19、21和22泳道没有目的条带，1 440 bp产物为占位区特异序列，上游引物与内源病毒ev21基因结合，鸡基因组中如无ev21插入，则扩增不出该目的片段。图 3B为太行鸡1 440 bp酶切结果，均未被Hae Ⅲ切开。太行鸡121个个体中的52个为1 440 bp扩增阳性，海兰灰祖代四系鸡60个个体中的15个为扩增阳性，全部没有被Hae Ⅲ切开。
由表 4可知，1 440 bp扩增检测的121只太行鸡，其中34只慢羽公鸡阳性率94.1%，29只慢羽母鸡阳性率65.5%，25只快羽公鸡阳性率为0.0%，33只快羽母鸡阳性率为3.0%。海兰灰A、B和D系45个快羽个体全部为阴性，C系15个慢羽个体全部为阳性。课题组采用其他分子检测方法对ev21的阳性率进行了检测，ev21阳性个体的1 440 bp扩增也为阳性。
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表 4 太行鸡和海兰灰祖代鸡1 440 bp片段PCR结果 Table 4 PCR result of 1 440 bp for Taihang and progenitor of Hy-line Gray chickens |
OS区1 440 bp序列的Hae Ⅲ酶切位点消失，同时该片段的PCR结果与鸡内源白血病毒ev21的检测完全一致，可以将1 440 bp的PCR检测作为ev21的筛查方法。
2.4 占位区、未占位区和ev21插入结构特征由US区1 450 bp、ev21占位区1 440 bp、US区和OS区共有序列538 bp Hae Ⅲ酶切以及ev21的检测结果，推断得出太行鸡、海兰灰鸡、海兰褐鸡快慢羽Z染色体上US区、OS区的Hae Ⅲ酶切位点以及ev21插入的结构特征(图 4)。
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图 4 鸡Z染色体占位区、未占位区和ev21结构特征 Figure 4 Structure characteristics of OS, US and ev21 on Z chromosome of chicken |
由表 5可知，太行慢羽公鸡的主要结构特征(图 4A)占总体的58.1%，US区Hae Ⅲ酶切位点为野生型，OS区有ev21的插入并失去酶切位点；第二种结构特征为：US区酶切位点为杂合型、OS区有ev21插入并失去酶切位点，该类型结构占总体的35.5%(图 4B)；第三种结构US区酶切位点为杂合型、OS区是US区的完全重复或酶切位点发生突变，占6.4%(图 4C)。
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表 5 不同表型太行鸡占位区和未占位区酶切结果 Table 5 Digestion for occupied-site and unoccupied-site regions of Taihang chickens with various phenotype |
太行慢羽母鸡也有3种结构特征，第1种与慢羽公鸡的主要结构(图 4A)一致，占65.5%；第2种与慢羽公鸡的第3种结构(图5C)一致，占27.6%；第3种结构特征为US区的Hae Ⅲ酶切位点呈野生型纯合状态，OS区为US区的完全重复(图 4D)，占6.9%。快羽太行公鸡有两种结构特征，第1种US区Hae Ⅲ酶切位点呈野生型纯合状态(图 4E)，占92.0%；另一种结构只占8.0%，US区的Hae Ⅲ酶切位点为杂合型(图 4F)。快羽太行母鸡全部为US区Hae Ⅲ酶切位点为野生型纯合状态的图 4E结构。
海兰褐慢羽公鸡和慢羽母鸡均呈典型的慢羽结构特征：US区酶切位点为野生型，OS区有ev21插入无酶切位点(图 4A)；快羽母鸡为典型的快羽结构(图 4E)；而快羽公鸡结构与慢羽鸡的典型结构一致(图 4A)，存在US区的重复结构OS区，并且有ev21插入。
海兰灰商品代慢羽公鸡US区的酶切位点呈杂合状态，OS区有ev21插入无酶切位点(图 4B)；海兰灰商品代快羽母鸡呈快羽的典型结构特征(图 4E)。海兰灰祖代A系和B系分别为快羽公鸡和母鸡，表现为快羽的典型结构特征(图 4E)，D系同样为快羽母鸡，结构如图 4E；C系为慢羽公鸡：US区酶切位点为突变纯合型、OS区有ev21插入无酶切位点(图 4G)。
3 讨论1 450 bp序列为ev21未占位区序列，该序列在海兰灰及其祖代的快羽群体中存在内切酶Hae Ⅲ的识别序列：g. CTT GGCCACT，而在其慢羽群体中该位点突变为g. CTTAGTTAGTTAGCCACT，失去内切酶Hae Ⅲ的识别位点。F.Iraqi等以此为基础建立了白莱航鸡慢羽基因型的检测方法[11]，1 450 bp序列Hae Ⅲ酶切后2条带为快羽，3条带为慢羽杂合体，1条带为慢羽纯合体。L.D.Bacon等发现, 白莱航鸡的慢羽表型与ev21的插入完全相关[6]，其US区Hae Ⅲ酶切位点的基因型与OS区完全一致，OS区有ev21插入酶切位点为突变型，慢羽鸡的US区无ev21插入但酶切位点也为突变型，但快羽鸡只有US区，并且其酶切位点为野生型，所以可以通过US区Hae Ⅲ酶切位点的特征判断白莱航品系(海兰灰及其祖代)的羽速表型和基因型。
但国内品种太行鸡和坝上长尾鸡以及引进品种海兰褐的羽速表型与ev21未占位区Hae Ⅲ酶切位点的基因型并不相关。太行慢羽鸡和快羽公鸡US区酶切识别位点有两种基因型：野生纯合型和杂合型，快羽母鸡为野生纯合型，而慢羽OS区有ev21插入的酶切位点为突变型，也有慢羽OS区仅是US区的重复，所以不能根据US区酶切位点基因型判断羽速表型。而快羽和慢羽的海兰褐US区酶切位点均为野生纯合型，也不能利用此位点作为表型判断依据。
本试验通过OS区特异序列1 440 bp的扩增，明确了OS区即为ev21插入的区域，所以可以通过1 440 bp片段的扩增结果判断ev21的整合性，并可作为筛选无内源ev21病毒种鸡的检测方法。携带有内源白血病毒ev21的慢羽白莱航鸡对外源淋巴白血病病毒免疫性能减退，并且有生产性能下降和死亡率升高等不良性状[9]。快慢羽的种鸡配套系利用羽速表型进行雌雄鉴别不仅节约生产成本，并有利于雏鸡的生产发育，所以筛选无内源病毒的慢羽种鸡群对提高种鸡的生产水平是非常必要的。A.Smith等利用PCR技术检测内源白血病毒遗传元件[17]。本试验利用1 440 bp片段的扩增检测太行鸡发现, 慢羽公鸡有5.9%的ev21阴性率，慢羽母鸡有34.5%的阴性率。
1 440 bp片段扩增阳性的太行鸡52个个体和海兰灰祖代C系15个个体进行Hae Ⅲ酶切检测，发现全部为突变型，酶切位点全部为AG突变后插入TTAG四碱基的2次重复序列，形成TTAG的3次重复，该特异重复序列与ev21插入的关系需要进一步深入研究。
为进一步分析该突变位点与鸡羽型的关系，选取OS和US区包含该突变位点的共有区域为模板设计引物，对目的产物538 bp片段进行Hae Ⅲ酶切。除海兰褐快羽公鸡外，酶切结果与表型鉴定结果的一致率在92%以上。与US区1 450 bp酶切相比，鉴定准确率大大提高，可以作为快慢羽的粗略鉴定方法。陈忠等利用双重PCR鉴定快慢羽获得了高于94%的准确率[18]，M.G.Elferink等提出了荧光定量PCR技术鉴定快慢羽基因型的方法[12]，G.X.Bu等检测了慢羽PRLR基因重复的结构特征[19]，本课题组利用双重PCR灰度值的检测方法对鸡羽速基因进行鉴定，准确率高，操作简单方便(已申报专利)。
4 结论鸡US区Hae Ⅲ酶切位点变异不能作为慢羽和内源病毒ev21的鉴定依据，而OS区的ev21插入与1 440 bp序列酶切位点的A→G突变和八碱基重复是紧密连锁的，1 440 bp PCR扩增可以作为筛选ev21阴性的慢羽种鸡检测方法。
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