2. 甘肃省肉羊繁育生物技术 工程实验室, 民勤 733300;
3. 甘肃农业大学动物医学院, 兰州 730070
2. Sheep Breeding Biotechnology Engineering Laboratory of Gansu Province, Minqin 733300, China;
3. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China
哺乳动物的生殖活动是一个复杂而又连续的生理过程,包括配子发生、发情、排卵、受精、性别决定与分化、胚胎发育(妊娠)、分娩等环节,各个环节的正常运行是种族得以繁衍的重要保证,其间受到多种基因和级联信号通路的调控。SOX9基因作为SOX基因家族E亚族中的重要成员[1],广泛存在于高等哺乳动物直至水母等低等无脊椎动物中,是哺乳动物上继SRY基因后发现的又一性别决定基因。但近些年,随着分子生物技术的快速发展,研究者们相继研究发现SOX9作为重要的转录调控因子,广泛存在于哺乳动物各组织中,在诸多生理和病理过程中都起着关键的调控作用,如软骨细胞分化[2]、软骨形成[3]、神经角质细胞发育[4]、胰腺发育[5]、肿瘤等疾病发生[6-7]等。作为性别决定(睾丸决定)基因,SOX9在哺乳动物胚胎发育期的性别分化(雄性支持细胞和间质细胞的分化、睾丸的发生、抑制向雌性分化)过程中扮演重要的角色[8-9]。SOX9基因可以在其上游SRY基因缺失的情况下,诱导雄性动物睾丸的发育[10]。另外,SOX9基因在出生后哺乳动物睾丸支持细胞增殖[11]、睾丸间质细胞增殖及精子发生[12]等过程中也起着重要的调控作用。因此,深入了解SOX9基因的结构特点及在哺乳动物生殖活动中的分子调控机制,对揭示哺乳动物性别分化的分子机制及预防和治疗哺乳动物繁殖障碍性疾病具有重要的意义。
1 哺乳动物早期胚胎发育、性别分化概述哺乳动物的早期胚胎发育是受精卵在有丝分裂(卵裂)作用下,进行一系列复杂有序的细胞增殖与分化,同时由输卵管壶腹部向子宫迁移,在特定阶段进入子宫内,但并未在子宫内完成定位和附植,仍处于游离状态(图 1)。早期的胚胎发育始于受精卵,依次经过桑椹胚和囊胚初期发育阶段,并不与子宫内膜发生联系。随着囊胚的进一步发育,腔内液体增加,体积变大,在子宫内的活动逐步受限,随后脱离透明带并与子宫建立组织联系。当胚胎发育到囊胚后期时,在原肠作用下,形成内、中、外三胚层,三胚层的建立是胎儿组织器官形成的基础,不同的胚层具有完全不同的发育命运。
来源于中胚层的泌尿生殖嵴逐渐发育形成了生殖腺的原始胚基,但此时仍然无雌雄之分,将其称之为未分化性腺或双潜能性腺[13]。在未分化性腺中含有性腺支持细胞及类固醇生成细胞的前体细胞[14],同时含有两套生殖管道[15],即沃尔夫氏管(Wolffian duct, 又称为中肾管)和缪勒氏管(Müllerian duct, 又称为中肾旁管)。哺乳动物的性别决定是指在转录因子的精确调控下,早期胚胎中未分化的性腺向雄性(睾丸)或雌性(卵巢)方向转变的过程[16],也叫初级性别决定[17]。在这一过程中涉及到支持细胞及类固醇生成细胞前体的分化和生殖管道的分化:在雄性胚胎中,支持细胞和类固醇生成细胞的前体分别分化为睾丸支持细胞和睾丸间质细胞,而在雌性胚胎中分别分化为卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞[18];沃尔夫氏管和缪勒氏管分别分化为雄性和雌性动物的生殖道,相应的另一套生殖管道退化。Y染色体上携带的SRY基因在未分化性腺阶段开始表达,在初级性别决定中可诱导未分化性腺向雄性性腺(睾丸)方向分化[19],但其表达很短暂。而SOX9作为SRY的下游靶基因[20],被SRY基因激活后可持续表达并进一步激活相关信号通路来调控雄性性腺的发育。
2 SOX9基因编码蛋白的结构及功能特点SOX9基因最早是从人类患半致死性骨骼发育异常症(Campomelic dysplasia,CD)的患者体内分离得到的[21],之后也经过证实,SOX9基因的突变会导致其蛋白发生变异而表现为CD综合征[22-23]。CD综合征的典型症状是出现致死性骨骼发育异常、长骨弯曲畸形,并常伴有严重的呼吸窘迫、XY个体性反转等并发症[24]。在脊椎动物中,SOX9基因具有高度的进化保守性[25],但对于不同物种而言,其在染色体上的位置及结构特点有差异。如人(Homo sapiens)的SOX9基因定位在17号染色体的长臂17q24.3~25.1区,长度为3 934 bp[26];猪(Sus scrofa)的SOX9基因定位于染色体12p13-p11区段内,总共可编码509个氨基酸,具有可以编码71个氨基酸残基(104~174位)的高迁移率族蛋白(High mobility group, HMG)结构域[27];牛(Bos taurus)的SOX9基因定位于19号染色体上,含有1 575 bp的可读框(ORF),可编码524个氨基酸残基,编码蛋白不含跨膜区和信号肽[28]。以人类的SOX9基因为例,其编码蛋白特点(图 2):总共可以编码509个氨基酸,具有可以编码79个氨基酸残基(104~182位),且高度保守的HMG结构域,与SRY基因的HMG结构域同源性达到71%[26];含有N端二聚化结构域和C末端的转录激活结构域,其中,N端二聚化结构域和软骨发育密切相关,但与性别分化无关[29];在SOX9蛋白C端的结构域内富含脯氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸[1, 30],该区域也是转录激活所必需的;具有很多潜在的丝氨酸磷酸化位点,与DNA结合及转录激活密切相关[31];具有一段富含亮氨酸的核输出信号和两个独立的核定位信号区,负责蛋白分子的入核运输[32],SOX9主要通过HMG结构域C端的核定位信号与转运受体蛋白输入因子β(Importin-β)的相互作用进行入核运输[33]。S.McDowall等[30]研究发现,CD综合征患者是由于SOX9的C端结构域缺失使其转录活性降低所导致的。
SRY基因作为性别决定的总开关[34],可以激发未分化的性腺,通过抑制卵巢发育和促进向睾丸方向分化来决定睾丸支持细胞的命运,使睾丸支持细胞分化形成睾丸索,决定了性别分化的方向[16, 19]。S.G.Tevosian等[35]研究表明,SRY基因是由GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4, GATA4) 和其辅助因子FOG2(Friend of GATA4) 共同作用激活的,进而调控性腺分化。SOX9是SRY 仅有的下游直接调节靶基因[20],是继SRY基因表达后第一个在前体支持细胞中表达的基因[36]。在胚胎发育早期未分化的性腺中,SOX9基因在两性生殖嵴中的表达量很低,但在SRY基因表达及支持细胞的分化启动后,睾丸支持细胞中SOX9基因的表达快速上升,并且其位置由细胞质穿梭至细胞核中[37],而卵巢中SOX9基因表达量仍然很低甚至下调[38]。提示SOX9是SRY的靶基因,SOX9基因的激活是由SRY基因的表达来完成的,同时说明SOX9基因为性别相关基因,其高水平的表达与雄性性腺的发育密切相关。
但SOX9基因的激活及表达的维持是否只由SRY基因来完成?有关研究显示,在其上游SRY基因缺失的情况下,SOX9也可以诱导雄性动物睾丸的发育[9-10]。SOX9基因除受SRY基因的激活外,还可能存在着其他的激活路径。R.Sekido等[39]研究发现,类固醇生成因子1(Steroidogenic factor 1, SF1) 可以协同SRY结合于SOX9的性腺特异性增强子元件序列(TESCO)上, 上调SOX9的表达,而当SRY表达终止后,SOX9可与SF1结合帮助维持自身的表达水平,即SOX9的正反馈调节。当XY小鼠体内含有过量敏感的性别反转-先天性肾上腺发育不良症的关键基因1(Dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia critical region, on chromosome X, gene 1, DAX1) 时,会影响SF1协同SRY激活SOX9基因表达的能力,致使SOX9表达量下调,出现性反转[40]。J.S.Colvin等[41]研究发现,当成纤维细胞生长因子9(Fibroblast growth factor-9, FGF9) 蛋白缺失时,造成SOX9蛋白不表达,睾丸索发育停止,进而导致性反转。Y.Kim等[42]研究表明,在XY小鼠胚胎性腺中,SOX9对于FGF9基因的表达是不可或缺的,FGF9又能维持SOX9基因的表达,两个基因相互依赖而产生正反馈回路。另外,Wnt4基因(Wingless-type MMTV integration site family, member 4) 表达上调,将对FGF9基因的反馈路径产生拮抗作用,进而抑制SOX9基因表达。B.Moniot等[43]研究结果发现,小鼠睾丸中的前列腺素D合成酶(Prostaglandin D synthase, PGDS)产物可导致前列腺素D2(Prostaglandin D2, PGD2) 的累积,进而激活SOX9基因的表达,并进行入核转运。由此可知,SF1、DAX1、FGF9、Wnt4、PGD2等都可能作为单个辅助因子或以反馈回路的方式,协同调控SOX9基因的激活和表达。
3.2 SOX9基因的调控作用SOX9基因可以调控支持细胞[44]、生成类固醇间质细胞[12]的增殖与分化,进而调控雄性哺乳动物睾丸组织的发育。这是由于在雄性胎儿睾丸中,支持细胞可以分泌抗缪勒氏激素(Anti-Mullerian hormone, AMH)(又称缪勒氏管抑制因子MIS, Mullerian inhibitory substance),使缪勒氏管退化,其后睾丸间质细胞分泌的睾酮(类固醇)诱导沃尔夫氏管发育为雄性生殖器官[17]。若转基因的雌性小鼠胚胎中AMH基因过量表达,则缪勒氏管的分化受到抑制,不能分化形成子宫或输卵管,出生时小鼠卵巢中的生殖细胞数量较少,随着机体进一步的发育,生殖细胞缺失并且体细胞逐渐分化形成曲细精管[45]。这也进一步说明了AMH基因是诱导沃尔夫氏管分化为雄性动物的生殖器官并抑制缪勒氏管分化为雌性动物生殖器官的关键调控因子。AMH基因的表达由SOX9基因来激活,从而使得未分化的性腺朝睾丸方向分化[46],提示AMH为SOX9基因的靶基因。N.A.Arango等[47]研究表明,AMH基因的表达是由位于其上游的SOX9蛋白与SF1的结合序列进行调控的,SOX9只负责启动AMH的转录,而SF1调节AMH的转录水平。说明AMH基因表达水平的调控与维持是由转录因子SF1与SOX9共同作用完成的。
SOX9基因可以代替SRY的作用诱导哺乳动物睾丸发育[10]。在性别分化期间,XY胚胎中SOX9基因的失活将导致性反转[9]。而在XX胚胎中,SOX9基因突变表达上调使得雌性生殖器官的发育受到抑制,从而诱导其向雄性方向发育[8]。当SOX9基因异位表达时,也可诱导XX胚胎向雄性个体发育[48]。SOX9基因突变可引起性腺发育异常,如XX男性性别逆转和XY性发育异常[49-50],由SOX9基因突变所导致的性腺发育异常所占比例约为30%~40%[51]。XX男性性别逆转综合征患者的染色体性别与性腺性别不一致,具有女性染色体,但外生殖器通常接近正常男性,睾丸发育不良,缺乏生精能力,也有部分个体外生殖器模糊不清或雌雄同体[52];XY性发育异常患者具有男性染色体,但因男性化程度不足造成外生殖器模糊不清或表现为女性特征[53]。J.J.Cox等[49]通过对同一家族中的3例成年XX性别逆转患者研究发现,他们的第二性征、行为、生长和骨骼发育都和正常男性一样,但均表现为无精症,组织学观察发现睾丸曲细精管严重萎缩而导致精子发生障碍,进一步运用SNP、原位杂交、PCR等方法研究发现,该病是由于SOX9基因重复所导致的。说明SOX9基因只在雄性哺乳动物的胚胎中高度表达,是未分化性腺向雄性方向发育并抑制其向雌性方向分化的重要调控基因。
4 SOX9在出生后哺乳动物生殖活动中的调控作用SOX9基因对出生后动物生殖活动调控作用的研究多集中于鱼类[54-55],而在哺乳类动物中研究相对较少,目前只在人[21]、绵羊(Ovis aries)[56]、犬(Canis lupus)[57]、大鼠(Rattus norvegicus)[11]、小鼠[12]等哺乳动物上有报道。T.Wagner等[21]运用Northern blot技术检测SOX9基因在成年人各组织中的表达结果发现,SOX9基因在成年人的大脑、胰腺、心、肾、睾丸等组织中都有表达,但睾丸中表达最强烈。李讨讨等[56]通过研究SOX9基因在绵羊体组织和不同发育阶段(0、2、6、12和24月龄)睾丸组织中的表达时发现,SOX9在下丘脑、垂体、肝、肾、睾丸等组织中均有不用程度的表达,但在成年绵羊(12和24月龄)睾丸中表达量较高,进一步通过免疫组化染色发现其蛋白主要定位于睾丸支持细胞和间质细胞。说明SOX9基因的表达无组织特异性,但主要在睾丸组织中表达并发挥作用。B.Banco等[57]通过免疫组化染色发现,SOX9蛋白在正常和患有肿瘤的成年犬睾丸支持细胞中都有较强的免疫阳性反应,进而认为SOX9蛋白可能在睾丸支持细胞的正常增殖和肿瘤恶性转化中扮演重要的角色。在大鼠上,K.Fröjdman等[11]研究表明,SOX9蛋白的表达量高低与大鼠年龄及发育阶段有密切关系:在大鼠早期胚胎中,SOX9蛋白在生殖腺原基中表达,随着胚胎的进一步分化,SOX9蛋白定位于睾丸索周边的支持细胞,随后表达量逐渐下调直至出生后一段时间内都维持在很低的表达水平;15日龄雄性大鼠SOX9蛋白表达量又显著上调并在睾丸索中强烈表达;成年雄性大鼠SOX9蛋白阳性反应主要定位于大多数睾丸支持细胞,但在精子发生阶段其表达下调;在雌性大鼠卵巢中SOX9蛋白不表达。M.Daigle等[12]研究发现,SOX9在成年小鼠睾丸间质细胞中表达,有多重调控功能,如类固醇生成、精子发生等。F.Barrionuevo等[58]的研究结果显示,SOX9基因的缺失不会对生后早期小鼠睾丸曲细精管形态及睾丸的功能产生影响,但在成年小鼠睾丸支持细胞中SOX9基因的缺失会减弱支持细胞与生精细胞之间的相互作用,造成精子生成障碍。
SOX9对出生后雄性哺乳动物睾丸支持细胞和间质细胞的分化增殖及精子发生过程起着重要的调控作用,但其表达量及具体的分子调控机制却因物种的不同而有差异。精子发生是睾丸曲细精管上皮的生精细胞由精原细胞经过有丝分裂和减数分裂分化为精子细胞,并通过一系列的形态学变化转变为成熟精子的连续过程,其过程的顺利进行,是产生高品质精液(高活力、高密度)的重要前提。哺乳动物到达青春期后,动物的生殖器官逐渐发育成熟,开始具有繁殖能力,睾丸曲细精管中的精原细胞开始增殖和分化,产生能使雌性动物受孕的精子,而SOX9基因的高水平表达正好与精子的发生过程同步。哺乳动物睾丸组织主要由曲细精管和间质细胞组成,而曲细精管中由基膜向管腔依次分布着精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞等各级生精细胞,彼此层次分明,在精原细胞和初级精母细胞中间还镶嵌着许多的支持细胞。睾丸间质细胞是一种重要的内分泌细胞,可以合成和分泌雄激素,具有促进雄性动物精子成熟、生殖器官发育、提高性欲等重要的生物学功能。李振等[59]研究发现,雄激素可通过睾丸支持细胞和管周肌样细胞对精子发生过程进行调控,并对睾丸间质细胞的正常发育和分化具有重要调控作用。而支持细胞位于睾丸精曲管内,在精原干细胞(SSCs)的增殖与分化[60-61]、精母细胞的成熟分裂[61]等生精过程中都发挥重要的调控作用,精原干细胞是睾丸曲细精管基膜上存在的一类具有自我更新和定向分化功能的原始精原细胞[62],可通过有丝分裂产生精原细胞。一方面,睾丸支持细胞能为曲细精管内的各级生精细胞提供营养并阻止血液和淋巴液中的有害物质的侵入,保护生精细胞不受损害(血-睾屏障作用);另一方面,支持细胞可以促使各级生精细胞位置的移动和精子的释放。SOX9基因对出生后哺乳动物生殖活动的调控作用,主要是通过调控睾丸间质细胞和支持细胞的增殖与分化,进而使精子的发生过程顺利运行,产生具有运动能力和受精能力的高活力精液,提高精液品质。
5 总结与展望SOX9基因广泛表达于哺乳动物各组织中,可参与调控性别分化、睾丸发育、软骨发育、神经细胞发育、癌症发生等诸多生理和病理过程,尤其在哺乳动物未分化的性腺向睾丸方向分化和生后睾丸的发育等方面起着至关重要的调控作用。目前关于SOX9基因在哺乳动物生殖活动中的分子调控机制,虽已进行了大量的研究工作,但还有许多的问题尚需进一步研究解决。如SOX9基因的激活及表达水平的维持除受上游基因SRY的作用外,在此过程中,还有哪些辅助因子的参与?在SRY基因缺失的情况下,SOX9的激活机制又怎样?SOX9基因的下游靶基因有哪些?由于哺乳动物性别决定及睾丸发育等均为复杂的级联调控过程,受到许多基因和转录因子的联合作用,其调控机制十分复杂,深入了解SOX9基因的分子信号通路及与其他基因或转录因子的相互作用机制,有助于进一步利用相关分子技术控制哺乳动物性别或提高动物的繁殖力,为预防和治疗哺乳动物繁殖障碍性疾病提供新思路,同时也可为其他脊椎动物和鱼类等的性别分化、性腺发育机制研究提供重要参考。
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