2. 广东海洋大学动物医学系, 湛江 524088;
3. 广东海洋大学农学院动物科学系, 湛江 524088
2. Department of Veterinary Medicine, Guangdong Ocean University of Agriculture, Zhanjiang 524088, China;
3. Department of Animal Science, Guangdong Ocean University of Agriculture, Zhanjiang 524088, China
巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)是最早从骨髓前体细胞中发现的一种能刺激粒细胞和巨噬细胞形成集落的细胞因子[1]。在生理状态下,GM-CSF常处于沉默状态,需要在炎性因子(Inflammatory factor)、脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、植物血球凝集素(Phytohemagglutinin, PHA)或伴刀豆球蛋白A(Concanavalin A,Con A)等刺激下,由巨噬细胞、T细胞、内皮细胞和成纤维细胞产生[2]。研究表明,GM-CSF在机体免疫调节和炎症过程中均发挥重要作用。如增强中性粒细胞和巨噬细胞对抗原的吞噬及杀伤能力,增强及刺激树突状细胞(Dendritic cells, DCs)的成熟、迁移[3],诱使造血前体细胞分化增殖并使其保持生物活性等。此外,GM-CSF还能有效刺激抗原提呈细胞向疫苗注射部位聚集,从而增强疫苗反应[4]。
GM-CSF基因具有重要的免疫调节功能和作为免疫佐剂的明显优势,研究人员先后从小鼠[5]、人[6]、牛[7]、羊[8]和猪[9]等动物克隆出GM-CSF基因的cDNA序列,并阐述了其分子特征。贾启恒等[10]通过RT-PCR方法,从犬淋巴细胞中扩增出GM-CSF基因,构建了其真核表达载体pcDNA3.1-GM-CSF并转染HEK293T细胞。发现GM-CSF基因不仅明显促进犬的体液免疫应答,还对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫原性有显著增强作用。卢燕茹等[11]成功构建了人GM-CSF真核表达载体pIGM-CSF,转染HeLa细胞后,在基因和蛋白水平检测到GM-CSF的高水平表达。舒邓群等[12]成功构建了猪GM-CSF真核表达载体pcDNA3. 1(-)-GM-CSF,并转染COS-7细胞,获得了特异性表达的GM-CSF蛋白。杨恒等[13]从猪外周血淋巴细胞中扩增出GM-CSF,将其连接至原核表达载体pet-32a(+),构建出重组表达质粒pET-GM,转染大肠杆菌BL21后诱导表达,发现该诱导蛋白能有效刺激TF-1细胞增殖。
自1992年C.Caux[14]提出GM-CSF和TNFα可以联合用于人CD34+干细胞分化为DC以来,人们开始尝试不同细胞因子组合诱导分化DC的方法。发现以GM-CSF和IL-4诱导分化外周血淋巴细胞,能获得数量可观的DC。可见GM-CSF还是体外诱导DC的重要因子,建立稳定、高效的GM-CSF表达显得尤为重要。但表达体系多为瞬时表达,无法获得稳定表达的猪GM-CSF。本研究克隆了猪GM-CSF 基因的cDNA全长序列,并将其插入载体pIRES2-EGFP中,构建出真核表达载体pIRES2-EGFP-pGM-CSF。将该重组质粒转染入IPEC-J2细胞,经G418筛选,获得能稳定表达猪GM-CSF的细胞系。为进一步开发成免疫佐剂提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物3月龄左右的健康三元杂交猪(杜洛克×长白×大约克)购自湛江某猪场,体重50 kg左右。受试猪每日饲喂3次,早、中、晚各1次,自由饮水。从前腔静脉采集猪外周血10 mL,用外周血淋巴细胞分离液(天津灏洋)分离淋巴细胞,操作步骤按照说明书进行。
1.2 主要试剂Trizol、DL 2000 DNA marker,PrimeScriptTM Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、EX Taq Mix酶、Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0均购自TaKaRa公司;FastDigest BamH Ⅰ, FastDigest Xho Ⅰ与GeneRuler DNA Ladder Mix均购自ThermoFisher公司;胎牛血清、DMEM F12培养基、0.25% Trypsin-EDTA(1X)均购自Gibco公司。脂质体lip3000购自Invitrogen公司。猪肠上皮细胞IPEC-J2(ACC 701) 购自DSMZ公司。猪外周血淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物科技公司。
1.3 引物设计根据GenBank登录的猪GM-CSF基因序列(U67175.1),利用Primer 5.0软件设计含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的扩增引物(表 1),设计好的引物交由上海英潍捷基贸易有限公司合成。
将淋巴细胞在37 ℃ CO2培养箱内培养24 h(1640培养基+脂多糖(LPS,1 μg·mL-1))后,按照Trizol试剂盒说明书提取总RNA,DEPC水充分溶解,-70 ℃保存备用。
1.5 RT-PCR 1.5.1 cDNA第一链的合成检测RNA的浓度和纯度(D260 nm/D280 nm=1.8~2.0) 后,按照PrimeScript试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。
1.5.2 GM-CSF基因的扩增PCR扩增体系(50 μL):cDNA溶液2.0 μL,上游引物1.0 μL,下游引物1.0 μL,Ex Taq酶25 μL,ddH2O 21 μL。PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min(35个循环);72 ℃延伸5 min;4 ℃保存产物。
1.5.3 产物回收与转化胶回收产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后,Gel DNA Extraction Kit回收目的片段(具体操作参考说明书),经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,插入到载体pIRES2-EGFP后,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂布于含Amp(100 μg·μL-1)的LB琼脂平板,37 ℃过夜培养。
1.5.4 重组质粒的鉴定与测序培养12 h后,挑选白色单菌落接种于10 μL LB液体培养基中,取1 μL菌液进行PCR鉴定。阳性菌液接种于含有Amp的10 mL LB液体培养基中,37 ℃,160 r·min-1振荡培养14 h。快速质粒小提试剂盒抽提质粒,送上海英潍捷基贸易有限公司测序。
1.5.5 生物信息学分析利用NCBI在线ORF Finder软件查找猪GM-CSF开放阅读框,利用DNAstar软件翻译ORF核苷酸序列;用DNAman软件中的多序列比对程序与GenBank上已发表的牛、羊、人、狗、和小鼠GM-CSF的氨基酸序列进行同源性比较;TargetP 1.1 Server软件预测亚细胞定位;通过ExpAsy的Protscale程序计算疏水性。
1.6 细胞培养用含10%胎牛血清(Gibco)的高糖DMEM F12(Gibco)将IPEC-J2细胞培养于37 ℃、5% CO2培养箱中。细胞传代时先用PBS清洗3次,再用0.25%的胰酶(Gibco)进行消化。
1.7 GM-CSF基因的转染及筛选按照脂质体Lip3000(Invitrogen)的说明书,将重组质粒转入处于对数生长期的IPEC-J2细胞中,无双抗培养基培养24 h后,添加浓度为1 000 μg·mL-1的G418进行阳性细胞筛选。培养14 d后,挑选阳性单细胞,接种于96孔板,添加500 μg·mL-1的G418继续对细胞进行扩增筛选,培养3~4周,每48 h传代1次,最终获得能够稳定表达GM-CSF基因的细胞系。
1.8 转染后细胞的生长曲线细胞经胰酶消化后,用培养液重悬,按5 000个·孔-1接种96孔板。对照组和转染组各接种6个孔,置37 ℃ CO2培养箱培养4 h后,弃上清,每孔加入含10%CCK8的细胞培养基,继续培养3 h,用酶标仪在波长为450 nm处测定吸光度(OD值)。
1.9 阳性细胞克隆的稳定性鉴定将阳性细胞接种于培养瓶中,待80%融合时,Trizol法提取RNA,实时荧光定量PCR法检测GM-CSF mRNA的表达,用2-ΔΔct 法进行计算表达量。转染后24 h、传代15次和30次的细胞在倒置荧光显微镜(Lecia DMI30008,德国)下观察绿色荧光的表达情况。
2 结果 2.1 猪GM-CSF基因的克隆及真核表达载体构建利用RT-PCR技术,以猪PBMC的cDNA为模板,扩增得到435 bp的特异性目的条带,测序正确后,连接到pIRES2-EGFP载体上,命名为pIRES2-EGFP-pGM-CSF。其质粒电泳图(图 1A)显示,pIRES2-EGFP-pGM-CSF的大小为5 735 bp, pIRES2-EGFP为5 300 bp, 与预期大小一致。扩增产物经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,得到大小为435 bp的目的片段(图 1B)。
pGM-CSF基因的ORF长435 bp(图 2)。其编码区由144个氨基酸组成,分子量为16.3 ku,PI为7.15。将该序列与GenBank中登录的绵羊(EU287484.1)、马(EU438778.1)、猫(AF053007.1)、牛(U22385.1)、狗(S49738.1) 和人(M11220.1) 的GM-CSF同源性分别为77.1%、73.6%、72.2%、71.5%、71.3%和70.8%。
猪GM-CSF蛋白中存在3个明显的疏水区,分别为57~60位、318~321位、400~402位,其中59和60位疏水性最强,均值为2.1。同时存在4个明显的亲水区,分别在36~37位、99~100位、391~392位和415~416位,其中37位亲水性最强,达-0.211。
2.4 pIRES2-EGFP-pGM-CSF重组质粒转染将重组质粒pIRES2-EGFP-pGM-CSF转染猪IPEC-J2细胞24 h后,在倒置荧光显微镜下, 观察可见绿色荧光表达(图 3)。转染GM-CSF基因后,细胞的生长趋势与对照组相比未见明显变化(图 4)。说明该基因能在IPEC-J2细胞中成功表达,且对细胞的生长没有显著影响。
转染pIRES2-EGFP-pGM-CSF重组质粒后,1 mg·mL-1 G418结合有限稀释法, 对阳性细胞进行连续筛选,每48 h传代1次。传代15和30次时,在倒置荧光显微镜下, 仍可见大量绿色荧光的表达(图 5A,5B)。
Real-time PCR相对定量结果表明,转染重组质粒的IPEC-J2细胞系中,GM-CSF mRNA的表达量极显著升高(P<0.01)。而空载体组与对照组之间无显著差异(P>0.05)(图 6)。
GM-CSF不仅在机体免疫调节、DC发育和分化及炎症过程中发挥重要作用[3, 15],还能有效刺激抗原提呈细胞向疫苗注射部位聚集,从而明显地增强疫苗反应[4],是极有应用前景的免疫佐剂。此外,在肿瘤的免疫治疗中,GM-CSF也有重要功能。K.Tani等[16]将GM-CSF转导入肾肿瘤细胞构建成GM-CSF肿瘤细胞疫苗(GM-CSF tumor cell vaccine, GVAX),注射后在患者体内发生Ⅳ型超敏反应(Delayed type hypersensitivity, DTH),增强了对肿瘤细胞的细胞毒性和体液免疫水平。另一方面,基于GM-CSF肿瘤疫苗使患者产生强烈的DTH反应,进而转移瘤体积明显减少[17]。探讨GM-CSF稳定、高效的体外表达方法将为该免疫佐剂的开发建立基础。本研究成功构建了基于猪肠上皮细胞系的GM-CSF稳定表达细胞系,为进一步开发猪的免疫佐剂提供依据。
GM-CSF蛋白属旁分泌蛋白,克隆该基因相对较为困难。这是由于GM-CSF mRNA在完成翻译后会很快被相应的酶降解[18]。另外,GM-CSF基因通常处于沉默状态, 需要某些刺激原致敏。窦永喜等[19]、景志忠等[20]曾利用PHA和LPS联合体外刺激成功克隆了猪GM-CSF基因。本研究利用LPS刺激体外培养的猪PBMC,成功克隆了猪GM-CSF基因。说明LPS刺激淋巴细胞,从而致敏GM-CSF,再用RT-PCR法克隆GM-CSF基因是一个可靠的方法。
GM-CSF基因在进化中相对保守,物种间的差异不大。C.R.Maliszewski等[7]研究了牛GM-CSF在核苷酸和氨基酸水平的分子特征,发现与小鼠和人的GM-CSF高度同源。进一步对氨基酸序列进行比对,作者发现牛GM-CSF前体含有17个氨基酸信号序列。P.M.O’Brien[21]对羊GM-CSF的研究表明,羊和牛GM-CSF序列在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为91%和81%。宋勤叶等[22]发现猪GM-CSF由435 bp组成,编码144个氨基酸。本研究发现,猪GM-CSF编码144个氨基酸,分子质量为16.3 ku,pI为7.15。与绵羊、马、猫、牛和人等物种的同源性较高。
以pIRES2-EGFP或pcDNA3.1/CT-GFP为基础构建真核表达载体,转染后G418筛选是目前运用较为广泛的稳传细胞系构建策略。该载体含有绿色荧光蛋白编码基因(GFP)[23],并携带了新霉素抗性基因neo,当载体上的neo基因未被整合时,细胞将被G418杀死[24-25]。整合的细胞通过产生大量酶可维持生存,但会造成一定的代谢负担,从而影响细胞状态[26]。李里等[27]运用G418进行筛选转染pEGFP-PAX2质粒的大鼠肾小管上皮细胞,成功构建了胚胎发育基因(Paired box2, PAX2) 稳转细胞系。管齐赛[28]将pEGFP-N1-pTLR3重组质粒转染猪肾细胞(Pig kidney cell,PK15),G418抗性筛选,获得一株稳定表达pTLR3与EGFP融合蛋白的单克隆细胞系。房永祥等[29]构建了pcDNA3.1/CT-GFP-pTLR2真核表达载体,成功建立了稳定表达猪Toll样受体2的CHO-K1细胞系。
4 结论本研究转染组与对照组的生长曲线相似,说明G418筛选对细胞生长没有明显影响。连续筛选30代时,仍可见GM-CSF基因和蛋白水平的高表达。表明成功构建了猪GM-CSF的稳定传代细胞系。
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