氟中毒是全世界广泛存在的一种人畜共患性地方病,也是我国危害严重的地方病之一。氟中毒的非骨相损害中,生殖系统的损伤一直引起人们的关注[1-3],本实验室长期从事氟中毒对生殖系统损伤的研究[4-7]。大量研究表明,氟中毒可以降低人和动物的生育率[8-10]。氟可以突破血睾屏障,在生殖部位蓄积,进而对睾丸的形态功能及精子发生过程产生毒副作用[11-13]。氧化应激(oxidative stress,OS)学说是氟中毒研究的重要机制之一。在生物的抗氧化体系中,过氧化损伤的防御和修复是极为关键的一个方面。谷胱甘肽系统是机体抗氧化体系的重要组成部分,主要由还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)、谷胱甘肽硫转移酶(glutathione transferase,GST)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)构成,这些物质可能对氟引起的氧化损伤有防御作用。
然而,目前除了氟影响睾丸组织抗氧化系统酶活性和相关基因的研究外[14],缺少氟对睾丸GSH抗氧化系统的全面报道。本试验通过检测小鼠睾丸的总抗氧化能力(T-AOC)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、GSH的含量及GPx、GR、GST的活性,以及GPx1、GPx4、GST-mu5和GR基因的表达,从而为进一步阐明氟的生殖毒性奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试验动物分组与处理24只3周龄ICR雄性小鼠,体重20~25 g,购自北京海淀兴旺实验动物养殖场。小鼠适应性饲养1周,之后随机分成四组,每组6只,分笼饲养。对照组饮用蒸馏水,染氟组分别供给含25、50、100 mg·L-1 NaF的蒸馏水[7, 15]。饲养环境保持干净整洁,温度20 ℃左右,湿度适宜,各组小鼠自由饮水、采食。饲养60 d后,各组小鼠全部断颈处死,摘取睾丸。
1.1.2 主要试剂和仪器氟化钠(NaF,AR)购自天津市化学试剂三厂;PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR®Primix Ex TaqTMⅡ购自TaKaRa;T-AOC测定试剂盒、ROS测定试剂盒、MDA测定试剂盒、GST测定试剂盒、GPx测定试剂盒、GR测定试剂盒和BCA法蛋白质定量测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。全波长扫描多功能读数仪(Thermo Scientific Varioskan® Flash);实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems QuantStudio 7);超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司)。
1.2 方法 1.2.1 检测T-AOC、ROS、MDA和GSH的含量及GPx、GST和GR的活性各指标都严格按照南京建成试剂盒说明书进行检测。按说明将睾丸组织匀浆后采用化学比色法检测T-AOC、GPx、GST、GR和GSH,硫代巴比妥酸(TBA)法检测MDA,化学荧光法检测ROS。
1.2.2 Real-time PCR反应按照RNAiso Plus (TaKaRa)试剂盒提取睾丸的总RNA,通过Nanodrop-2000测定其浓度及A260 nm/A280 nm,保存于-80 ℃。按照TaKaRa试剂盒步骤合成cDNA,使用SYBR®Primix Ex TaqTMⅡ试剂盒对内参基因和目的基因进行相对定量分析。反应体系为:含酶混合液5 μL,ROX液0.2 μL,上下游引物各0.4 μL,cDNA模板1.0 μL,ddH2O 3.0 μL,总体积10 μL。扩增条件是: 95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,45个循环。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成,序列见表 1。
小鼠灌流后,立即取出睾丸,采用原位固定法制备小鼠睾丸电镜样本,制备超薄切片,透射电子显微镜观察。
1.3 统计方法结果采用GraphPad Prism 5统计软件的One-way analysis of variance (ANOVA)方法进行Dunnett事后检验,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 小鼠相关指标检测各组小鼠在染氟60 d后,其相关指标检测结果如表 2。与对照组相比,随着染氟组氟化钠浓度的提高,小鼠睾丸的T-AOC逐渐降低,100 mg·L-1NaF组显著降低(P<0.05),GSH极显著降低(P<0.01),ROS含量逐渐提高,MDA含量逐渐升高,100 mg·L-1NaF组显著升高。与对照组相比,随着染氟组氟化钠浓度的提高,GPx、GST、GR的活性逐渐降低,其中,50、100 mg·L-1NaF组除50 mg·L-1 NaF组GR指标外均显著降低(P<0.05)。
各组小鼠睾丸提取的总RNA纯度A260 nm/A280 nm均在1.8~2.0,经实时荧光定量PCR测定,与对照组相比,随着染氟组氟化钠浓度的提高,小鼠睾丸的GST-mu5、GPx1、GPx4和GR的基因转录量逐渐降低,100 mg·L-1 NaF组显著降低(图 1)。
氟中毒小鼠睾丸内支持细胞和精母细胞发生损伤,线粒体(mitochondria)、粗面内质网(rough endoplasmic reticulum)及高尔基体(Golgi apparatus)等细胞器都出现不同程度的损伤。从图 2可以看出,对照组(图 2A、B)支持细胞的线粒体、粗面内质网及高尔基体较完整。与对照组相比,25 mg·L-1NaF组(图 2C、D)支持细胞线粒体轻微肿胀突出、空泡化、嵴缺失;粗面内质网轻微扩张,其上附着的核糖体部分缺失;高尔基体平行排列的大囊泡结构部分缺失。50 mg·L-1NaF组(图 2E、F)支持细胞的线粒体肿胀突出,空泡化,嵴缺失增多;粗面内质网扩张程度增加,其上附着的核糖体部分缺失严重;高尔基体平行排列的大囊泡结构缺失。100 mg·L-1NaF组(图 2G、H)支持细胞的线粒体肿胀、空泡化,嵴缺失明显增多;粗面内质网扩张程度明显增加;高尔基体大囊泡明显肿胀。
从图 3中可以看出,对照组(图 3A、B)精母细胞的线粒体、粗面内质网及高尔基体较完整。与对照组相比,25 mg·L-1NaF组(图 3C、D)精母细胞线粒体嵴缺失,粗面内质网上附着的核糖体部分缺失,高尔基体平行排列的大囊泡结构稍肿胀。50 mg·L-1NaF组(图 3E、F)精母细胞的线粒体肿胀突出,空泡化,嵴缺失增多;粗面内质网扩张程度增加,其上附着的核糖体部分缺失严重;高尔基体平行排列的大囊泡结构明显肿胀。100 mg·L-1NaF组(图 3G、H)精母细胞线粒体肿胀空泡化,嵴缺失明显增多;粗面内质网的核糖体部分缺失且出现肿胀;高尔基体大囊泡肿胀最严重。
睾丸组织分裂代谢旺盛,富含线粒体及黄嘌呤氧化酶等生成活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)酶类,且具有多量不饱和脂肪酸,睾丸组织对于氧化应激损伤更加敏感。ROS包括羟基自由基、超氧阴离子自由基、过氧化氢和脂质过氧化的不稳定中间体。D. Ghosh等[16]研究了饮水型氟中毒对大鼠睾丸组织氧化应激效应,发现过量氟所致的生殖系统毒性效应与睾丸氧化应激密切相关。总抗氧能力(T-AOC)可以反映机体清除氧自由基的能力[17]。MDA的含量可以反映细胞膜脂质过氧化作用的程度。MDA是脂质过氧化反应过程中不饱和脂肪酸氧化分解释放出的反应性醛,是脂质过氧化反应的终产物,能交联蛋白质、脂类及糖类,使生物膜变性,造成细胞膜流动性降低,进而引起细胞损伤。本试验结果显示,与对照组相比,染氟组的T-AOC逐渐降低,且100 mg·L-1NaF组显著降低;ROS含量逐渐增多,MDA含量逐渐增多,且100 mg·L-1NaF组显著增多。表明氟可导致睾丸的抗氧化能力减弱,睾丸内自由基和脂质过氧化物等积累,氧化系统和抗氧化系统失衡。
氟中毒时,机体内自由基水平升高,导致氧化应激[18-20]。谷胱甘肽是生物体内抗氧化防御系统中最重要的小分子活性寡肽,在肝中含量最高,分为氧化型谷胱甘肽(GSSG)和GSH。谷胱甘肽抗氧化系统包括GSH及相关代谢酶,构成机体内最为重要的抗氧化防御系统,保护细胞免受ROS的攻击[21]。在酶的调控下,生物体内GSH和GSSG通常处于稳恒性动态平衡,即当机体内由于GSH的清除自由基作用导致积累较多的GSSG时,GR将作用底物GSSG还原成GSH。GSH是主要的形式,占总谷胱甘肽的98%[22-24]。真核细胞有三个主要的GSH库。大多数(80%~85%)的细胞GSH是在细胞质中,10%~15%是在线粒体,极少部分是在内质网[25-27]。大鼠肝细胞质GSH迅速翻转,半衰期为2~3 h。线粒体GSH在抵御生理和病理情况下产生的氧化应激时特别重要[28-29]。因为线粒体是细胞进行氧化呼吸的场所,在正常生理条件下,氧化呼吸过程中通过酶促反应或非酶促反应可产生少量的氧自由基,GSH及与之相关的酶是一道非常重要的抗自由基防线。线粒体内GSH只能由细胞质来提供,同时线粒体又不能将GSSG输出,所以在病理性氧化应激状态下,细胞死亡与线粒体GSH浓度的相关性比与细胞质中GSH的浓度相关性更大。本试验结果显示,与对照组相比,线粒体出现不同程度的损伤,特别是50和100 mg·L-1NaF组的支持细胞,线粒体肿胀、嵴缺失明显增多。
研究显示,氧化应激是由细胞内多细胞器协同参与的一个复杂的生化过程。氧化应激可导致粗面内质网内未折叠或错误折叠蛋白积累,受损的粗面内质网和线粒体之间存在相互干扰,受损的粗面内质网会诱导细胞的整体应激,其他细胞器受到威胁,如高尔基体等。高尔基体是细胞内有着重要生理作用的细胞器,会出现形态、结构和功能上的变化,发生高尔基体应激[30]。本试验结果显示,与对照组相比,100 mg·L-1NaF组的支持细胞和精母细胞的高尔基体明显肿胀。50和100 mg·L-1NaF组的支持细胞的粗面内质网明显扩张,50 mg·L-1NaF组精母细胞的粗面内质网明显扩张。
GSH的含量与GPx、GST和GR活性密切相关,共同参与了体内自由基代谢的调节。GSH是机体内重要的抗氧化分子,可以在小鼠氧化应激时,作为GPx或GST的作用底物,清除其体内的氧自由基或脂质过氧化物(ROOH),导致GSSG含量升高,在GR的催化下GSSG还原成GSH。本试验结果显示,与对照组相比,各染氟组GSH的含量显著降低,GSSG的含量显著升高,GPx、GST和GR的活性显著降低。GPx或GST以谷胱甘肽作为底物,清除机体内的H2O2和ROOH,各染氟组GSH的含量显著降低,GPx或GST反应底物含量降低,不能及时清除机体内的H2O2和ROOH,使其转换成脂肪酸和水。谷胱甘肽抗氧化系统遭到破坏,提示氟中毒小鼠睾丸组织GSSG还原成GSH的过程可能受阻,大量的GSSG积累在细胞液中,并破坏氧化还原动态平衡,给小鼠带来不良影响,导致氧化损伤加剧。GSH参与细胞信号转导,通过修饰细胞内参与信号转导的许多蛋白质分子结构中的巯基从而改变蛋白质的分子结构及活性。GSH通过清除ROS从而抑制其介导的细胞信号转导,这也间接影响了氧化应激诱导的细胞信号转导。
当小鼠氟中毒处于氧化应激状态时,睾丸细胞内的细胞器都将针对氧化应激作出适应性反应以抵抗氧化损伤。线粒体是细胞内活性氧(如O2-、H2O2)的主要来源[31],ROS损伤线粒体膜脂质,导致线粒体功能受损[32]和细胞凋亡升高[33]。GPx1主要分布于细胞质、线粒体中,在抗氧化应激、降低活性氧水平方面起重要作用,主要是通过特异性催化GSH对H2O2的还原反应并分解脂质过氧化物来对抗氧化应激[34]。GPx1在附睾上皮细胞也表达,被认为在精子抗ROS中发挥作用。本试验结果显示100 mg·L-1NaF组GPx1基因转录显著下调,催化GSH对H2O2的还原反应的能力降低,不能及时分解ROOH,使H2O2和ROOH在睾丸内积累。GPx4在睾丸组织中特异性表达,可以直接作用于细胞膜系统上的磷脂氢过氧化物,在抗氧化防御中催化活性酶。成熟精子中GPx4是维持精子尾部线粒体结构不可或缺的结构蛋白,GPx4表达减少与男性不育相关[35]。100 mg·L-1NaF组GPx4基因转录显著下调,作用于细胞膜系统上的磷脂氢过氧化物的GPx4含量减少,细胞内氧化还原失衡。本试验结果显示氟可导致睾丸内ROS含量逐渐增多,MDA含量逐渐增多,GSH的含量显著降低,提示睾丸内自由基和脂质过氧化物等积累;GPx、GST和GR的活性显著降低,T-AOC逐渐降低,提示睾丸的清除氧自由基的能力减弱;GPx1和GPx4基因转录显著下调,睾丸细胞内细胞器如线粒体、粗面内质网和高尔基体产生不同程度的损伤。
精液中含有丰富的GST,GST在精子发生过程中起保护作用[36]并且在精子的抗氧化应激中发挥重要的作用[37-38],GSTs-mu5在冻融精子中高表达就是精子抗氧化应激的一种表现[39]。GST活性降低,细胞内ROS水平增加,导致精子膜损伤[40]。研究发现GST-mu1、GST-mu3和GST-mu5与男性不育症相关,可以降低精子活力和浓度及引起对精子DNA的氧化损伤[41-42]。GR是谷胱甘肽抗氧化系统中的重要酶,以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶,把氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原为GSH。本试验结果显示,与对照组相比,100 mg·L-1NaF组的小鼠体内氧化还原失衡,处于氧化应激状态,抗氧化能力减弱,导致睾丸GST-mu5和GR基因转录显著下调。
小鼠氟中毒后,谷胱甘肽抗氧化系统在机体内氧化与抗氧化系统作用过程中起到了重要的作用。睾丸抗氧化能力降低,处于明显的氧化应激状态,这与睾丸组织的线粒体、内质网和高尔基体等细胞器出现不同程度的损伤,GPx、GST和GR等酶活性受到抑制,GPx1、GPx4、GST-mu5和GR基因表达下调相关。
4 结论经水给予小鼠氟化钠可使睾丸T-AOC减弱,ROS、MDA含量升高,GSH含量显著降低,细胞内氧化水平升高,线粒体、内质网和高尔基体出现不同程度的损伤,GPx、GST、GR的活性降低,GPx1、GPx4、GST-mu5和GR基因转录下调。小鼠氟中毒后,睾丸抗氧化能力降低,处于明显的氧化应激状态,这与谷胱甘肽抗氧化系统酶活性降低及其相关基因转录下调有关。
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