竹鼠(Rhizomyidae)属竹鼠科、竹鼠属，又称冬毛老鼠、芒狸和竹狸等。野生竹鼠栖息于亚洲南部及非洲东部的热带与亚热带树林、灌木和竹林中。其体大肉多，味道鲜美，营养丰富，毛皮绒厚柔软，具有较高的经济价值。自20世纪90年代初竹鼠最早在桂北一带驯养成功以来，我国已大规模养殖竹鼠，成为具有经济效益的养殖产业之一。目前广西是我国竹鼠养殖量最大的省份，南宁、桂林、柳州、玉林、梧州、河池等地均建有竹鼠养殖基地。

作为一项新型产业，竹鼠驯化时间不长，规模化养殖起步较晚，其常见疾病的调查与研究资料十分欠缺。特别是规模养殖后，由于养殖方式的改变，竹鼠的生活习性、机体性能等方面也随之发生变化，引发出许多疾病。竹鼠的细菌性疾病最为常见，已报道的病原有大肠杆菌、巴氏杆菌、链球菌、肺炎克雷伯菌等^[1-4]。但是没有关于弗氏柠檬酸杆菌引起竹鼠疾病的报道。因此，研究竹鼠源弗氏柠檬酸杆菌对竹鼠相关疾病的防治具有重要意义。

1 材料与方法 1.1 样品

2013年12月，广西桂林市某竹鼠种鼠养殖场发生竹鼠幼鼠陆续死亡，该养殖场存栏种鼠1 000只以上，幼鼠约1 000只，发病多为哺乳或刚断奶不久的幼鼠，发病率占总幼鼠的20%左右，每天死亡幼鼠占总幼鼠的0.2%~2%。病鼠被毛粗乱，非常消瘦，形如干尸，部分发生腹泻、肛门周围有污物。剖检症状：病鼠肝出血且有灰白色坏死点，肠道有轻微出血。送检活幼鼠18只，冰冻幼鼠约40只。

1.2 主要试剂和实验动物

5%山羊鲜血营养琼脂培养基、常规试剂为实验室自制；药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司；PCR Mix、胶回收试剂盒购自北京康为世纪公司；中性福尔马林组织固定液按照文献方法配制^[5]。4周龄昆明小白鼠购自广西医科大学。

1.3 细菌分离纯化

剖杀6只症状典型的竹鼠，无菌条件下，分别取病鼠的肺、肝、肾及脾样品接种于5%山羊血平板，37 ℃恒温培养20 h后，挑选形态特征一致的单个菌落反复划线纯化培养，观察菌落颜色、形态特征，并分别挑取单个菌落进行革兰染色、镜检。根据菌落、菌体形态，染色特性进行初步判定，然后将典型菌落接种于LB培养基中进行增殖培养备用。

1.4 16S rRNA序列测定及分析

以培养好的细菌菌液为模板，利用16S rRNA基因扩增引物(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′)^[6]进行PCR扩增；回收PCR产物由深圳华大基因科技服务有限公司进行序列测定，利用BLAST进行同源性比对，采用MEGA 5.0的Neighbor-Joining(NJ) ^[7]法构建系统进化树。

1.5 药物敏感性检测

采用Kirby-Bauer琼脂扩散法测量抑菌圈直径(IZD)，进行3个重复，取平均值。依据CLSI的抗菌药物敏感性试验标准，判定分离菌株对药物的敏感性。

1.6 分离菌对小鼠及竹鼠的致病性试验

将4周龄健康昆明小白鼠随机分成4组，每组4只，1~3组分别通过腹腔注射稀释梯度为10⁰、10^-1和10^-2的细菌稀释液，0.2 mL·只^-1；第4组每只腹腔注射等量细菌培养基。注射后连续观察记录小白鼠发病死亡情况，按照中华人民共和国兽药典载录的Reed-Muench方法计算各菌株半数致死量LD₅₀。参照该菌对小白鼠的LD₅₀，设计同样的试验，将该菌接种于10~20日龄的竹鼠，接种后连续观察记录竹鼠发病死亡情况，测定其对竹鼠的LD₅₀。并及时收集频死竹鼠无菌剖解，肉眼观察大体病理损伤，取心、肝、脾、肺、肾及小肠，用中性福尔马林进行固定后，送洛阳中科基因检测诊断中心有限公司制备切片，进行组织病理学观察。

2 结果 2.1 分离菌的形态特征

将病鼠的肺、肝、肾及脾样品划线于山羊血平板，经培养后接种肝样品的区域生长出半透明呈灰白、光滑、湿润、边缘整齐的中等大小圆形菌落。经纯化后获得分离菌，经涂片、染色、镜检为两端钝圆的革兰阴性短杆菌(图 1)。

2.2 分离菌16S rRNA基因扩增及序列分析

以分离菌的菌液为模板，采用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，获得大小约1.3 kb片段。测序结果经BLAST比对显示，与弗氏柠檬酸杆菌FJ592991相似性高达99.5%。进一步将其与GenBank中登录的弗氏柠檬酸杆菌菌株的16S rRNA序列进行比对分析，构建系统发育树(图 2)，进化树分析显示该菌与来自棉花红蜘蛛的弗氏柠檬酸杆菌FJ592991株亲缘关系最近，但该分离株单独处于独立的分支上。结合分离菌株的形态特征，确定分离株为弗氏柠檬酸杆菌，并将其命名为ZS-6。

2.3 分离菌药敏特性测定

对分离菌株进行药敏检测，结果见表 1。分离菌株对头孢曲松、庆大霉素、阿米卡星、氧氟沙星、左氧氟沙星5种药物高度敏感，对链霉素和恩诺沙星中度敏感，对青霉素、头孢唑啉、氟苯尼考、林可霉素、强力霉素等20种药物不敏感。

2.4 对小白鼠及10~20日龄的竹鼠致病性试验

从5%山羊血琼脂平板无菌挑取单个菌落，接种于普通LB培养基，37 ℃恒温培养16 h，进行细菌计数为4.5×10⁹ CFU·mL^-1。小白鼠腹腔注射0.2 mL细菌原液(10⁰)，人工感染4 h后开始发病，表现为精神萎靡，活跃程度下降，不食，被毛松乱，流泪并浸润眼眶周围被毛，严重者眼睛有脓状物，腹泻。接种后24 h内全部致死。小白鼠腹腔注射稀释梯度为10^-1及10^-2的细菌稀释液，出现不同程度的症状，但未发生死亡；对照组观察7 d，无异常症状。剖检死亡小白鼠发现肺、肝出血，将小白鼠肝无菌接种于5%山羊血琼脂平板，分离到与接种病原菌形态特征一致的菌株，经细菌16S rRNA测序鉴定为分离的弗氏柠檬酸杆菌。

10~20日龄的竹鼠接种10 h后开始发病，表现为离群，到处乱爬，不吸乳，腹泻。在2.0×10⁹ CFU的接种量下小竹鼠20 h内全部致死，接种2.0×10⁸ CFU的接种量的小竹鼠出现发病症状，脱水、消瘦、腹泻，但接种72 h后症状减轻，并出现好转，连续观察两周基本康复。接种2.0×10⁷ CFU的接种量的小竹鼠症状轻微。对照组观察两周，无异常症状。剖检频死的小竹鼠，可见其皮下呈胶冻样、透亮；腹腔、肝表面有白色纤维素渗出物，肝出血、变黑；肺表面有密集出血点、出血斑；肾表面有散在的少量的针尖大小出血点(图 3)；脾有出血点。用血琼脂平板从死亡竹鼠的肝、脾、肾可以分离到所接种的细菌。

2.5 人工感染10~20日龄的竹鼠发病后病理组织学变化

将该菌接种10~20日龄的竹鼠，接种后连续观察竹鼠发病情况，并及时收集频死竹鼠无菌剖解，肉眼观察大体病理损伤后，取肺、肝、脾、肾等用中性福尔马林进行固定，制成切片并观察。可见肺肺泡间隔增宽、间隔内可见炎性细胞浸润(图 4E)。肝被膜增厚，被膜外见大量坏死的细胞，中央静脉、窦状隙等血管扩张、淤血，肝边缘可见数个出血性坏死灶(图 4F)。脾被膜增厚，被膜外见大量坏死的细胞和纤维素性渗出物(图 4G)。肾的肾小管上皮细胞肿胀，颗粒变性，管腔变小(图 4H)。

3 讨论

笔者从患病的竹鼠肝组织分离到一株细菌。基于该菌的形态学及16S rRNA基因序列分析，确定该菌为弗氏柠檬酸杆菌。16S rRNA序列高度保守，分析显示该菌与分离于棉花红蜘蛛的弗氏柠檬酸杆菌FJ592991株遗传关系最近，相似性高达99.5%。但该分离株单独处于独立的进化分支上，这是国内外首次从竹鼠体内分离到弗氏柠檬酸杆菌。

弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)为肠杆菌科、沙门菌族柠檬酸杆菌属(Citrobacter)的代表菌^[8]。该菌为革兰阴性杆菌, 需氧或兼性厌氧，是一种典型的人-畜-鱼共患条件性致病菌^[9]。弗氏柠檬酸杆菌广泛分布于自然界，土壤、水体、食物都有其分布, 此外在哺乳动物、鸟类、爬行动物和两栖动物等体内也可分离。人类可因弗氏柠檬酸杆菌感染而发生腹泻、食物中毒、脑膜炎、脑脓肿、败血症等^[10-12]。关于弗氏柠檬酸杆菌导致水产动物大量死亡的报道较多，包括草鱼、鲫鱼、斑马鱼、鲟鱼、中华鳖、红螯螯虾等^[13-18]。近年来，关于弗氏柠檬酸杆菌导致哺乳动物患病报道也在不断增加。雷静等从犊牛腹泻病料中分离到2株弗氏柠檬酸杆菌^[19]。孙洋等报道弗氏柠檬酸杆菌可导致东北虎出血性腹泻^[20]。刘会胜等报道弗氏柠檬酸杆菌可导致小尾寒羊死亡^[21]。目前而言弗氏柠檬酸杆菌可能是一种尚未被人们充分认识的病原菌，且有危害加重的趋势。本试验分离到的弗氏柠檬酸杆菌，经接种小白鼠及10~20日龄的竹鼠都显示了很强的致病性，引起小竹鼠发病死亡。通过竹鼠幼鼠的致病性试验及病理切片观察，丰富了该病的第一手资料，对竹鼠相关疾病的防治具有重要意义。

药敏试验结果显示，分离菌株对头孢曲松、庆大霉素、阿米卡星、氧氟沙星、左氧氟沙星5种药物高度敏感，对链霉素和恩诺沙星中度敏感，对青霉素、头孢唑啉、氟苯尼考、林可霉素、强力霉素等20种药物有耐药性，这是否与养殖过程中大量滥用抗生素导致细菌产生耐药性有关仍需进一步深入研究，虽然竹鼠规模化养殖时间很短，但滥用抗生素的老问题仍然值得警惕。

4 结论

从广西桂林某竹鼠种鼠养殖场发病竹鼠肝组织分离到一株细菌，并确定分离菌株为弗氏柠檬酸杆菌。该菌与来自棉花红蜘蛛的弗氏柠檬酸杆菌遗传关系最近，但处于独立的分支。分离菌株对头孢曲松、庆大霉素、阿米卡星、氧氟沙星、左氧氟沙星药物高度敏感，对青霉素、头孢唑啉、氟苯尼考、林可霉素、强力霉素等有耐药性。分离菌对小白鼠及10~20日龄的竹鼠有很强致病性，引起竹鼠发病死亡。发病竹鼠肺、肝、脾、肾等组织有明显病变。弗氏柠檬酸杆菌是引起桂林竹鼠发病和致死的病原菌。