2. 中国农业大学动物医学院国家动物传染性海绵状脑病实验室, 北京 100193
, LIU Chun-fa2, HE Xiao-li1, LI Fan-fei1, WEI Fan-hua1, ZHAO De-ming2, ZHOU Xiang-mei2
, XU Li-hua1
2. National Animal Transmissible Spongiform Encephalopathy Laboratory, College of Veterinary Medicine, China Agricultural University, Beijing 100193, China
环磷酸鸟苷-磷酸腺苷合酶(cyclic GMP-AMP synthase, cGAS)属于核苷酸转移酶家族，是一种新发现的胞内DNA感应器。cGAS与双链DNA结合后被激活，并以GTP或ATP为底物合成环化二核苷酸(cyclic GMP-AMP，cGAMP)，cGAMP与内质网膜上的衔接蛋白STING具有较高亲和力，从而激活下游的蛋白TBK1、IRF3磷酸化，最终诱导Ⅰ型干扰素的产生[1]。cGAS信号通路在先天免疫中起着至关重要的作用，特别是对胞内菌的识别和清除作用。牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，M. bovis)是一种典型的胞内菌，可引发人畜共患病，不仅给全球养牛业造成巨大损失，而且还严重威胁食品安全与公共卫生。报道显示，cGAS信号通路在自身免疫病方面已得到验证[2]，但在树突状细胞和牛分枝杆菌中尚未明了。为了更好地探究牛分枝杆菌感染后cGAS信号通路调节小鼠髓源树突状细胞(murine bone marrow derived dendritic cell, BMDC)成熟及细胞因子分泌的调节机制，本试验建立了牛分枝杆菌与BMDC感染模型，应用siRNA沉默技术抑制cGAS基因的表达，进而探究cGAS信号通路对BMDC成熟及活化的影响。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂牛分枝杆菌(菌株号C68004) 由中国农业大学动物海绵状脑病实验室保存；C57BL/6雌性6~8周龄小鼠(北京维通利华公司，SPF级)；ON-TARGETplus Mb21d1 siRNA(Thermo Scientific Dharmacon)；RPMI-1640培养液，胎牛血清(Gibco)；cGAS抗体(Cell Signaling Technology)；β-actin抗体(Abcam)；rmGM-CSF集落刺激因子(Peprotech)PE-CD11c，FITC-CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ抗体(eBioscience)；TBK1抗体，STING抗体(武汉三鹰生物技术公司)；ELISA试剂盒(Cusabio)。
1.1.2 主要仪器设备恒温CO2培养箱(日本三洋公司)；Western blot电泳仪、成像仪(Bio-Rad)；流式细胞仪(BD)；-80 ℃超低温冰箱，全自动酶标仪(Thermo Fisher)；离心机(Sigma)；倒置显微镜、激光扫描共聚焦显微镜(Olympus)；细胞培养板(Corning)。
1.2 方法 1.2.1 树突状细胞的原代培养C57BL/6小鼠颈椎脱臼法处死后浸入75%酒精5~10 min，无菌分离出股骨、胫骨，尽可能去除表面结缔组织和肌肉，PBS清洗两遍后，浸入RPMI1640备用。分别剪断骨头两端，用1 mL无菌注射器吸取RPMI1640培养液反复吹洗髓腔，直至变白为止。以1 000 r·min-1，离心10 min，弃去上清，重复操作两次。收集沉淀放入含有10%胎牛血清、双抗、GM-CSF的15 mL RPMI1640完全培养液中，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，以分离当天记为第0天，分别于第3天添加15 mL完全培养液，第6天半量换液[3]。第7天收获后用流式细胞术鉴定。
1.2.2 分组及处理本研究设置三组：对照组BMDC，在培养过程中不加任何刺激；感染组BMDC，在培养第7天用牛分枝杆菌以感染复数(MOI)=5:1感染，相互作用3 h后更换全新RPMI1640完全培养液，此时记作0 h；cGAS沉默组BMDC，在培养第7天转染siRNA沉默cGAS基因表达，后续感染及处理步骤与感染组相同。
1.2.3 siRNA转染用无RNA酶水稀释siRNA至工作浓度，收集对数生长期的BMDC铺于24孔板，RPMI1640完全培养液调整至每孔1×105细胞·mL-1，置于37 ℃稳定培养24 h后。每孔加入5 μL siRNA工作液，再加入3 μL转染液，轻微振荡混匀，室温孵育5~10 min后置于37 ℃培养48 h，更换正常完全培养液，然后按照感染组操作流程进行感染。
1.2.4 BMDC表面标志物检测分别将正常培养及感染后24 h的BMDC离心收集(1 000 r·min-1，5 min)，PBS洗涤悬浮，调整每管5×105细胞·100 μL-1，分别加入CD86、CD80、CD40、CD11c、MHC-Ⅱ荧光标记抗体，终质量浓度为3 μg·mL-1。置于4 ℃避光孵育45 min，PBS洗涤2次，以同型IgG作为对照，流式细胞仪检测。
1.2.5 Western blot检测cGAS信号通路蛋白根据本实验室之前的方法，分别收集24 h对照组BMDC、24和48 h感染组BMDC、24 h沉默组BMDC细胞，用细胞裂解液冰上裂解5~10 min，提取总蛋白质。配制10%分离胶和5%浓缩胶的SDS-PAGE，80 V电泳90 min后将蛋白凝胶转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶37 ℃封闭1 h，分别用cGAS、TBK1、p-TBK1、STING、β-actin抗体为一抗，以1:1 000比例稀释，5 mL TBST加入5 μL抗体，4 ℃孵育过夜。分别用对应HRP标记的山羊抗兔IgG为二抗，37 ℃孵育1 h。暗室中ECL发光液孵育硝酸纤维素膜1 min后曝光显影。
1.2.6 免疫荧光检测IRF3入核分别将正常培养24 h及感染24 h的细胞玻片用PBS清洗3次，每次3 min，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次，每次3 min。加入免疫染色封闭液，室温封闭1 h，避免非特异性结合。PBS清洗后，以1:1 000比例稀释IRF3抗体4 ℃湿盒内孵育过夜，PBST清洗玻片3次，每次3 min。避光加入1:5 000山羊抗兔荧光二抗2 μL，37 ℃孵育1 h后用PBST清洗。滴加DAPI避光孵育10 min染核，用含抗荧光淬灭剂封片液封片，激光扫描共聚焦显微镜下采集图像。
1.2.7 ELISA检测细胞因子分别收集对照组BMDC、感染组BMDC、沉默组BMDC细胞培养液上清，运用间接ELISA试剂盒检测上清中IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-6的含量，检测方法严格按照试剂盒操作手册进行。终止反应后，立刻通过酶标仪检测其OD值，并绘制出标准曲线，得出相应细胞因子浓度。
1.2.8 数据处理使用GraphPad Prism 6统计软件分析数据和作图，两组之间数据比较用t检验，多组数据采用方差分析，结果以“x±s”表示。*P＜0.05，**P＜0.01，表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 BMDC的培养及鉴定图 1A示分离第0天的髓源树突状细胞，呈圆形，表面光滑无突起。培养至第7天(图 1B)，可见细胞表面形成长短不一的质膜突起，呈集落生长。针对BMDC，采用抗小鼠PE-CD11c mAb对树突状细胞进行标记，通过流式细胞仪检测纯度。当细胞纯度达到90%以上可用于后续试验，细胞纯度结果见图 2。
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图 1 BMDC体外培养形态(200×) Figure 1 Morphology of BMDC culture in vitro(200×) |
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图 2 流式细胞术检测BMDC的纯度 Figure 2 Flow cytometry analysis purity of CD11c+ BMDC |
利用Western blot技术分别检测正常培养与siRNA沉默48 h后cGAS的蛋白质表达量。由图 3可知，利用siRNA沉默cGAS后，其蛋白质表达量受到抑制，较对照组显著降低。结果表明该siRNA可有效沉默cGAS蛋白在BMDC中的表达，为后续试验奠定基础。
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CON.对照组；siRNA. cGAS基因沉默组 CON. Control group; siRNA. cGAS gene silence group 图 3 Western blot检测siRNA沉默后cGAS的表达 Figure 3 Western blot analysis of cGAS expression after knock down by siRNA |
利用Western blot和免疫细胞化学技术分别检测对照组BMDC、感染组BMDC、沉默组BMDC中cGAS信号通路相关蛋白TBK1、p-TBK1、STING和IRF3的表达变化情况。由图 4可知，BMDC感染牛分枝杆菌后，感染组较对照组cGAS的表达量显著上升，说明感染后cGAS被激活，而沉默组siRNA使cGAS表达量显著下降。STING作为cGAS下游的衔接蛋白，在cGAS激活后可与其相关信使(cGAMP)结合形成稳定的同源二聚体结构，可见在感染组中STING表现为双条带，而对照组和沉默组只表现出单一条带，说明STING被激活。TBK1位于STING下游，广泛存在于细胞质中，三组之间的表达量未见显著差异，进而检测其磷酸化蛋白p-TBK1，可见随感染时间增长其表达量逐渐增高，而沉默组则略有下降。IRF3是干扰素调节蛋白，处于TBK1下游，被激活后有入核现象。由图 5可知，感染组较对照组有明显的入核现象，而沉默组入核现象受到抑制。以上结果表明，牛分枝杆菌感染BMDC后，胞内cGAS效应器受到刺激，进而激活cGAS信号通路及下游相关蛋白的活化。
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CON.对照组；24 h.感染后24 h；48 h.感染后48 h；siRNA. cGAS基因沉默组 CON. Control group; 24 h. 24 hours post infection; 48 h. 48 hours post infection; siRNA. cGAS gene silence group 图 4 Western blot检测cGAS信号通路相关蛋白的表达 Figure 4 Western blot analysis of related protein expressions in cGAS pathway |
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CON.对照组；M. bovis.感染组；siRNA. cGAS基因沉默组 CON. Control group; M. bovis. Infection group; siRNA. cGAS gene silence group 图 5 免疫荧光检测IRF3进入细胞核现象 Figure 5 Immunofluorescence analysis phenomena of IRF3 enter the nucleus |
由图 6可知，通过流式细胞仪检测相关表面标志物CD80、CD86、CD40和MHC-Ⅱ，感染组与对照组差异极显著(P＜0.01)，表达量大幅提升，说明BMDC感染后，细胞由未成熟或半成熟状态转变为成熟状态。其中MHC-Ⅱ表达量的提升进一步说明在感染后细胞抗原提呈能力的增强。沉默组与感染组相比差异显著(P＜0.05)，表面标志物的表达量均有一定下调。以上结果说明，牛分枝杆菌可诱导BMDC的成熟及抗原提呈能力的增强，而沉默cGAS后表达量下调，可知cGAS对BMDC的成熟有促进作用。
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CON.对照组；M. bovis.感染组；siRNA. cGAS基因沉默组。*.差异显著(P＜0.05)，**.差异极显著(P＜0.01)，下同 CON. Control group; M. bovis. Infection group; siRNA. cGAS gene silence group. * represents significant difference (P < 0.05), * * represents great significant difference (P < 0.01).The same as below 图 6 流式细胞术检测BMDC表面标志物的表达 Figure 6 Flow cytometry analysis of surface marker expressions on BMDC |
图 7为通过ELISA试剂盒检测三组上清液中IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-6细胞因子的含量。可见在感染后分泌量均明显升高，感染组与对照组相比差异极显著(P＜0.01)，经siRNA沉默后分泌量则明显减少，沉默组较感染组相比差异显著(P＜0.05)。以上结果说明，牛分枝杆菌可诱导BMDC细胞因子中IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-6表达量升高，且cGAS具有促进作用。
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CON.对照组；M. bovis.感染组；siRNA. cGAS基因沉默组 CON. Control group; M. bovis. Infection group; siRNA. cGAS gene silence group 图 7 ELISA检测BMDC细胞因子的分泌 Figure 7 ELISA analysis of cytokines production in BMDC |
树突状细胞作为连接固有免疫与适应性免疫的桥梁，其意义在于通过MHC-抗原复合物与T细胞表面受体相结合，以及CD80、CD86等共刺激分子与T细胞表型CD28相结合，伴随相关细胞因子的产生，从而激活T细胞，启动适应性免疫应答，对胞内菌的清除至关重要[4]。cGAS是最近在哺乳动物细胞质内发现的一种核苷酸转移酶，作为细胞内一种重要的DNA感应器。cGAS可与双链DNA直接结合，催化合成第二信使cGAMP，后者与内质网跨膜蛋白STING相互作用，使其构象发生改变，形成稳定的同源二聚体结构[5]。下游蛋白TBK1被招募至细胞核周围，进而诱导下游蛋白IRF3磷酸化、二聚化，被激活的IRF3向细胞核内转移，从而激活Ⅰ型干扰素基因转录，启动Ⅰ型干扰素释放[6]。
R. Wassermann等[7]通过细胞化学染色法研究发现结核分枝杆菌可诱导cGAS的表达上调。转染DNA发现与cGAS共定位，在较多区域两者均有聚合现象[8]。J. W. Schoggins等[9]最近研究认定cGAS基因为关键干扰素刺激基因(ISG)。此外，cGAS的第二信使cGAMP可激活临近STING蛋白并诱导Ⅰ型干扰素产生[10]，本试验中感染牛分枝杆菌后cGAS及下游相关蛋白质表达上调同以上报道相一致。R. O. Watson等[11]研究中利用基因敲除技术，分别敲除cGAS基因和STING基因，发现IFN-β mRNA显著下降，并且cGAS信号通路下游蛋白质表达受到抑制，本试验中沉默组Western blot结果与之相同。沉默组中siRNA干扰cGAS后BMDC表面标志物下调现象与E. C. Carroll等[12]和H. F. Zhang等[13]的研究结果相似，发现在敲除或阻断Ⅰ型干扰素受体(IFNAR)后相关表面标志物也表现出下调，说明除了已知的Toll样受体外，Ⅰ型干扰素同样参与树突状细胞成熟的调节。
根据F. Ma等[14]的试验结果及推测可知，cGAS信号通路可启动IFN-β的产生，产生的IFN-β与IFNAR受体相结合，进而诱导下游STAT1和STAT2磷酸化，再与其他相关信号通路相结合，例如IRF9、MicroRNA-155、NF-κB等，共同调节树突状细胞的成熟。但树突状细胞表面标志物的调节机制较多，不同信号通路之间的相互联系有待进一步明确。细胞因子方面，C. Bode等[15]已经证实人浆样树突状细胞可通过cGAS-STING信号通路诱导IFN-β的产生，而经典途径中由TLR3和TLR9识别牛分枝杆菌所启动的信号转导同样可诱导IFN-β的产生[16]。因此本试验中cGAS基因被沉默后，虽然IFN-β表达量下降，但并未完全消失，可能与其他信号通路的激活有关。T. J. Li等[17]研究发现在抗肿瘤免疫中，cGAMP可通过cGAS-STING-IRF3信号通路促使IL-2、IL-12、TNF-α等相关细胞因子表达上调，本试验中感染组结果与其相同。R. O. Watson等[11]和J. Lienard等[18]的研究结果显示结核分枝杆菌可通过cGAS信号通路诱发自噬现象，进而激活IL-6、IL-12表达，敲除cGAS则自噬减弱，IL-6、IL-12表达量随之下调，本试验中沉默组细胞因子分泌减少现象与之相似。而TNF-α结果不尽相同，K. M. Storek等[19]分别敲除cGAS、STING、IFI204后感染弗朗西斯菌，发现TNF-α表达量同对照组并无显著差异，即TNF-α不受cGAS的调控，该结果的差异可能与感染不同病原菌相关。例如，李斯特菌、沙眼衣原体等胞内微生物具有独特的环核苷酸，可绕过cGAS感受器直接活化STING，诱导IFN-β产生[20-21]。并且研究发现李斯特菌在小鼠髓源巨噬细胞缺失cGAS情况下仍能诱发IFN-β的产生，而在人源单核巨噬细胞系中则不能产生[22]。由此可见cGAS信号通路是否被激活不仅与病原体的种类有关，而且也与宿主的细胞类型有关。目前国外关于cGAS信号通路的研究主要集中于结核分枝杆菌和巨噬细胞，而国内相关报道较少。
笔者建立了牛分枝杆菌感染BMDC试验模型，利用siRNA沉默技术抑制cGAS的表达，进而探索cGAS信号通路在牛分枝杆菌刺激下对BMDC的调控作用。结果表明，受到感染后树突状细胞相关表面标志物及细胞因子表达量显著上调，由未成熟转向成熟。此外，本研究证明了cGAS信号通路在BMDC中的存在，感染牛分枝杆菌后cGAS被激活，进而诱导下游相关蛋白活化。由沉默组中相关蛋白质和细胞因子表达量下调可知，cGAS信号通路有助于树突状细胞的成熟和活化，在免疫应答中发挥重要作用。本试验阐明了在体外感染牛分枝杆菌后，cGAS信号通路对BMDC成熟的调控机制，以及对IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-6细胞因子的调节情况，为今后cGAS信号通路的研究奠定基础。但cGAS与牛分枝杆菌之间通过何种方式相互作用，以及IFN-β对其他相关细胞因子如何调节，同其他信号通路之间如何联系等相关机制问题，有待进一步探讨研究。
4 结论牛分枝杆菌可刺激BMDC引起细胞表面标志物CD86、CD80、CD40、MHC-Ⅱ表达升高，相关细胞因子IFN-β、TNF-α、IL-12p70、IL-6分泌增加，BMDC的抗原提呈能力增强；同时cGAS信号通路被激活，下游STING、p-TBK1、IRF3蛋白活化，而沉默cGAS基因后相关指标均显著下调。牛分枝杆菌感染BMDC可激活cGAS信号通路，且cGAS有助于BMDC的成熟和活化。
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