2. 天康生物股份有限公司 动物用生物制品技术国家 地方联合工程实验室, 乌鲁木齐 830000;
3. 新疆畜牧科学院兽医研究所 动物临床医学研究中心, 乌鲁木齐 830000
2. National & Local Joint Engineering Laboratory for Animal Biological Products Technology, Tecon Bio-technology Co., Urumqi 830000, China;
3. Animal Clinical Medicine Research Center, Institute of Veterinary Medicine, Xinjiang Academy of Animal Science, Urumqi 830000, China
口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)属小RNA病毒科口疮病毒属，为无囊膜病毒，其基因组为单股正链RNA，全长约8.5 kb[1-2]。P1基因编码的FMDV结构蛋白是构成病毒衣壳的基础，能诱导与感染性FMDV粒子相同的免疫反应。衣壳蛋白中VP1能诱导动物产生中和抗体，VP2具有抗原性，VP3具有无规则卷曲的柔性，在物理形态上表现出可动性和生化上的多功能性，在很大程度上增加了FMDV的抗原性[3-4]，它还具有多段抗原决定簇，是机体免疫攻击的对象，在影响病毒衣壳组装和分解中起重要作用[5]。VP4蛋白在不同血清型中高度保守，具有1个主要的T细胞表位，在免疫应答中起决定性作用[6-7]。P1是引起宿主机体免疫及产生中和抗体的主要抗原蛋白，其编码也决定着FMDV的抗原性和血清型，是研究FMDV生物学特性、分子流行病学、毒株演化关系和基因工程疫苗的热点和基础，国内外相关研究机构正积极开展针对这一领域的科学研究。3A基因位于高度保守的非结构蛋白P3编码区，有疏水基，能与细胞结合，在正链RNA合成起始时能把VPg锚定在细胞膜上。它的后半段C端(76—153氨基酸)易突变，前半段N端(1—75氨基酸)呈零星散在的突变，具有高度的保守性。有研究报道3A基因缺失与其对猪的嗜性降低有关[8]，可导致宿主范围的变化[9-10]。J. M. Pacheco等、张显升等[11-12]认为3A蛋白上的某些特征性氨基酸变化可能与病毒的表型变化相关。
P1基因或3A基因上编码的某些关键性的氨基酸位点可能涉及病毒的感染性和宿主因子[12]。因此，分析P1和3A基因的遗传变异趋势，有可能预测病毒在宿主范围和毒力方面的变化，目前还未有详细的研究对此进行验证。笔者首次通过将O型口蹄疫病毒(缅甸98谱系)在牛、乳鼠、猪、BHK-21细胞四种宿主进行适应性传代，获得各宿主适应性毒株，运用分子生物学技术和生物分析软件，筛选出不同宿主间P1(VP4、VP2、VP3、VP1) 和3A基因的变异位点，通过研究其遗传变异趋势，对FMDV的基因组结构以及对不同宿主间传染关系有了新的认识，对重组O型口蹄疫病毒的前期科学研究和筛选O型口蹄疫种毒株具有一定的指导意义。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂MiniBEST viral RNA/DNA Extration Kit Ver 5、Primer Script TM RT Reagent kit(Perfect Real Time)、DNA Ligation Kit Ver 2.1、T-Vector pMD19购自TaKaRa公司；PCR Master Mix Taq酶购自Thermo公司；DNA纯化回收试剂盒、DH5α感受态细胞购自TIANGEN公司；Gibco培养基、10%胎牛血清购自宝生物工程(大连)有限公司；口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所。
1.1.2 毒株与细胞O型口蹄疫病毒缅甸98谱系(O/XJ/10-11) 由兰州兽医研究所国家参考实验室分离鉴定，由天康生物股份有限公司保存，作为原始毒种；不同宿主适应毒、幼仓鼠肾细胞(BHK-21) 均由天康生物股份有限公司保存、提供。
1.1.3 实验动物4日龄BALB/c乳鼠，购自新疆医科大学(实验动物合格证编号65000700000099)；2月龄犊牛、40日龄仔猪由天康生物股份有限公司动物房饲养，试验前采牛、猪血样，通过口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒(批号20160608101-2) 检测动物的血清抗体效价，抗体效价＜1:32，判为阴性，即为未感染过FMDV的动物。
1.1.4 引物的设计与合成用生物学软件Vector NTI 11.5，对O/XJ/10-11毒株的基因序列按P1(1A、1B、1C、1D)和3A基因序列的顺序设计引物(表 1)，委托北京博迈德科技发展有限公司合成。
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表 1 引物序列信息 Table 1 Primers sequences information |
将O型口蹄疫病毒液5 000 r·min-1离心5 min，吸取上清攻毒于10只4日龄乳鼠，颈背皮下注射，每只注射0.2 mL，待其发病，观察30 h左右出现典型口蹄疫症状的乳鼠：运动不灵活，四肢麻痹，呼吸迫促，最终死亡。将乳鼠头、四肢、尾剪去，剥去皮，剪开胸腔和腹腔，剔除内脏，用1:50新洁尔灭清洗，再用PBS(pH 7.6、0.05 mol·L-1)冲洗，加1%的双抗、石英砂，充分研磨，稀释成悬液，置4 ℃冰箱，浸毒过夜，离心，吸上清，记作RF 1代。如上述方法连续传代至RF 5代，取收获的5只乳鼠的适应毒液，离心后将上清移入离心管，4 ℃冰箱保存。
1.2.2 猪、牛适应毒株的收取将RF 1鼠适应毒株5 000 r·min-1离心5 min，吸取上清，猪采用颈背部皮下肌肉注射，每只1 mL(含103.0 LD50)；犊牛采用两点舌面注射，每头0.2 mL(含104.0 LD50)。待其发病后，采集病变部位的水疱皮和水疱液，加石英砂，充分研磨，用PBS稀释成1:10悬液，猪适应毒株记作SF 1代，牛适应毒株记作BF 1代。用同样的方法连续传代，猪适应毒株传至SF 5代，牛适应毒株传至BF 4代，各收集5只(头)动物病料，4 ℃冰箱保存。
1.2.3 BHK-21细胞适应毒株的收取选择细胞形态正常，形成良好单层的BHK-21细胞，倾去旧的Gibco培养基，用不含血清的培养基洗细胞面两次，然后接种RF 1鼠适应毒株，置于37 ℃温箱内吸附1 h。加新的培养基，以覆盖细胞层为度，37 ℃恒温箱内培养，每隔12 h镜检一次，观察细胞病变情况，于48~72 h收病毒，记作KF 1代。将KF 1代作为种毒，继续进行细胞传代，当传至KF 5代，BHK-21细胞死亡、变圆、有脱落现象，继续传代，传至KF 25代。
1.2.4 病毒RNA的提取与cDNA的制备取牛、乳鼠、猪、BHK-21细胞适应毒株各200 μL病毒液。按照试剂盒提供的方法提取RNA。按照反转录试剂盒操作说明书，制备各宿主适应性毒株的cDNA。
1.2.5 DNA克隆、连接和转化以“1.2.4”制备的cDNA为模板进行PCR扩增反应，50 μL反应体系如下：Taq DNA聚合酶(0.05 U·μL-1 Taq DNA polymerase，reaction buffer，4 mmol·L-1 MgCl2，0.4 mmol·L-1 dNTPs) 25 μL，模板5 μL，上、下游引物(10 pmol·L-1)各2.5 μL，无核酸酶纯水15 μL。扩增条件：94 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 10 s，30次循环；72 ℃延伸10 min。经1%琼脂糖电泳检测，DNA纯化回收试剂盒回收，连接至pMD19-T载体，体系为：DNA 4.5 μL，pMD19-T载体0.5 μL，SolutionI 5 μL。将连接产物转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞。挑取单克隆菌落接种于含有氨苄西林的LB培养液中培养。
1.2.6 目的基因的核苷酸序列的测定及翻译经PCR鉴定，同一基因挑取多个阳性菌液，送至北京博迈德科技发展有限公司测序。使用Vector NTI 11.5软件对测序所得序列进行拼接、翻译，利用Megalign软件对序列进行比对分析。
2 结果 2.1 动物攻毒试验情况O/XJ/10-11株FMDV的乳鼠、牛、猪适应性传代过程及相关的毒力检测情况见表 2~4。
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表 2 FMDV在乳鼠的适应性传代及毒力测试 Table 2 Adaptive passage in neonatal rats and Median lethal dosed determination of FMDV |
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表 3 FMDV在牛的适应性传代及半数感染量ID50的测定 Table 3 Adaptive passage in bovine and Median infective dosed determination of FMDV |
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表 4 FMDV在猪的适应性传代及半数感染量ID50的测定 Table 4 Adaptive passage in swine and Median infective dosed determination of FMDV |
从牛、猪、鼠及BHK-21细胞适应毒株中提取RNA，反转录，用引物对基因1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1) 和3A进行PT-PCR扩增，经电泳检测，牛、猪、鼠及BHK-21细胞的四种宿主适应毒株分别在399、683、780、672、543 bp左右均出现扩增条带(图 1)，均与预期目的片段大小相符，且特异性好。
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1.阴性对照；2~6. BHK-21细胞适应毒株，2. 3A基因(543 bp)；3. 1D基因(672 bp)；4. 1C基因(780 bp)；5. 1B基因(683 bp)；6.1A基因(339 bp)；7.阴性对照；8~12.猪适应毒株，8. 3A基因(543 bp)；9. 1D基因(672 bp)；10. 1C基因(780 bp)；11. 1B基因(683 bp)；12.1A基因(339 bp)；13.阴性对照；14~18.鼠适应毒株，14. 3A基因(543 bp)；15. 1D基因(672 bp)；16. 1C基因(780 bp)；17. 1B基因(683 bp)；18.1A基因(339 bp)；19.阴性对照；20~24.牛适应毒株，20. 3A基因(543 bp)；21. 1D基因(672 bp)；22. 1C基因(780 bp)；23. 1B基因(683 bp)；24.1A基因(339 bp)；M. DL2000 DNA相对分子质量标准 1. Negative control; 2-6. BHK-21 cell adapted virus strains, 2. PCR product of 3A gene(543 bp); 3. PCR product of 1D gene (672 bp); 4. PCR product of 1C gene (780 bp); 5. PCR product of 1B gene(683 bp); 6. PCR product of 1A gene(339 bp); 7. Negative control; 8-12. Swine virus, 8. PCR product of 3A gene(543 bp); 9. PCR product of 1D gene (672 bp); 10. PCR product of 1C gene (780 bp); 11. PCR product of 1B gene(683 bp); 12. PCR product of 1A gene(339 bp); 13. Negative control; 14-18. Rat adapted virus strains, 14. PCR product of 3A gene(543 bp); 15. PCR product of 1D gene (672 bp); 16. PCR product of 1C gene (780 bp); 17. PCR product of 1B gene(683 bp); 18. PCR product of 1A gene(339 bp); 19. Negative control; 20-24. Bovine adapted virus strains, 20. PCR product of 3A gene(543 bp); 21. PCR product of 1D gene (672 bp); 22. PCR product of 1C gene (780 bp); 23. PCR product of 1B gene(683 bp); 24. PCR product of 1A gene(339 bp); M. DL2000 DNA marker 图 1 PCR扩增产物电泳结果 Figure 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products |
转化后获得的白色菌落，挑取单菌落进行培养，用所设计引物分别对挑取1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1) 和3A基因的菌液进行PCR扩增，经电泳检测，牛、猪、乳鼠及BHK-21细胞适应毒株的菌液均获得与预期条带大小为399、683、780、672、543 bp左右的片段(图 2)。不同宿主适应毒株的1A(VP4)、1B(VP2)、1C(VP3)、1D(VP1) 和3A基因已插入pMD19-T载体。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1~4. 1A基因PCR产物(339 bp)，1.牛适应毒株，2.猪适应毒株，3.鼠适应毒株，4.BHK-21细胞适应毒株；5.阴性对照；6~9. 1B基因PCR产物(683 bp)，6.牛适应毒株，7.猪适应毒株，8.鼠适应毒株，9.BHK-21细胞适应毒株；10.阴性对照；11~14. 1C基因PCR产物(780 bp)，11.牛适应毒株，12.猪适应毒株，13.鼠适应毒株，14.BHK-21细胞适应毒株；15.阴性对照；16~19. 1D基因PCR产物(672 bp)，16.牛适应毒株，17.猪适应毒株，18.鼠适应毒株，19.BHK-21细胞适应毒株；20.阴性对照；21~24. 3A基因PCR产物(543 bp)，21.牛适应毒株，22.猪适应毒株，23.鼠适应毒株，24.BHK-21细胞适应毒株；25.阴性对照 M. DL2000 DNA marker; 1-4. PCR product of 1A gene (339 bp), 1. Bovine adapted virus strains, 2. Swine adapted virus strains, 3. Rat adapted virus strains, 4. BHK-21 cell adapted virus strains; 5. Negative control; 6-9. PCR product of 1B gene (683 bp), 6.Bovine adapted virus strains, 7. Swine adapted virus strains, 8.Rat adapted virus strains, 9. BHK-21 cell adapted virus strains; 10.Negative control; 11-14. PCR product of 1C gene (780 bp), 11. Bovine adapted virus strains, 12. Swine adapted virus strains, 13. Rat adapted virus strains, 14. BHK-21 cell adapted virus strains; 15. Negative control; 16-19. PCR product of 1D gene(672 bp), 16. Bovine adapted virus strains, 17. Swine adapted virus strains, 18. Rat adapted virus strains, 19. BHK-21 cell adapted virus strains; 20. Negative control; 21-24. PCR product of 3A gene(543 bp), 21. Bovine adapted virus strains, 22.Swine adapted virus strains, 23. Rat adapted virus strains, 24. BHK-21 cell adapted virus strains; 25. Negative control 图 2 菌液PCR鉴定结果 Figure 2 PCR analysis of bacteria |
P1基因由2 208个核苷酸组成，编码736个氨基酸，与原始毒株比较，不同宿主适应毒株间，P1基因核苷酸序列相似性在99.6%~99.8%，氨基酸序列相似性在99.3%~99.9%，核苷酸相似性高，主要抗原位点稳定。核苷酸序列分析共有18处变异，其中9处突变发生在密码子第3位碱基上，未造成所编码的氨基酸突变；第2位碱基上的有5处；第1位碱基上的有4处。推导出的氨基酸序列比对中发生变异的有8处，且均由核苷酸第1、2位碱基突变而造成。可见，氨基酸变异区明显少于核苷酸变异区，这表明病毒表型变化程度低于遗传性变异程度。
1A基因由255个核苷酸组成，编码第1—85位氨基酸，其编码的VP4蛋白均未变异。
1B基因由654个核苷酸组成，编码第86—303位氨基酸，其编码的VP2蛋白上氨基酸变异位点有3处，牛适应毒株2处变异，变异位点位于核苷酸序列第235位，由T变为C，氨基酸序列第79位，由酪氨酸(Y)变为组氨酸(H)，核苷酸序列第544位，由A变为G，氨基酸序列第182位，由甲硫氨酸(M)变为缬氨酸(V)；猪适应毒株1处变异，变异位点位于核苷酸序列第398位，由A变为G，氨基酸第133位，由谷氨酸(E)变为甘氨酸(G)；乳鼠适应毒株和BHK-21细胞适应毒株在VP2上没有变异。
1C基因由660个核苷酸组成，编码第304—523位氨基酸，VP3蛋白上氨基酸变异位点有2处，均为BHK-21细胞适应毒株变异，变异位点在核苷酸序列第167位，由A变为G，氨基酸序列第56位，由组氨酸(H)变为精氨酸(R)，核苷酸序列第179位，由A变为G，氨基酸序列第60位，由天冬氨酸(D)变为甘氨酸(G)。
1D基因由639个核苷酸组成，编码第524—736位氨基酸，其编码的VP1蛋白上氨基酸变异位点有3处，鼠适应毒株1处发生变异，变异点位于核苷酸序列第472位，由C变为T，氨基酸序列第158位由脯氨酸(P)变为丝氨酸(S)，位于FMDV主要抗原区域第141—213位氨基酸区域上；猪适应毒株2处变异，变异点位于核苷酸序列第356位，由A变为G，氨基酸序列第119位，由酪氨酸(Y)变为半胱氨酸(C)，核苷酸序列第532位，由T变为C，氨基酸第178位，由酪氨酸(Y)变为组氨酸(H)；牛适应毒株和BHK-21细胞适应毒株在VP1蛋白上均没有变异。由此得出，P1基因编码的结构蛋白变异程度依次为VP1、VP2＞VP3＞VP4，各宿主适应毒的VP4上均未发生变异。
2.5 不同宿主适应毒株间3A基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列比较3A基因由459个核苷酸组成，编码153个氨基酸，测序结果表明：3A基因核苷酸序列相似性在99.6%~100%，氨基酸序列相似性在99.3%~100%，核苷酸相似性很高，均未出现碱基缺失。核苷酸序列分析仅有296位、341位2处变异，均发生在密码子第2位碱基上；推导出的氨基酸序列也仅有2处变异，且变异均由核苷酸第2位碱基突变所造成。猪适应毒株1处变异，核苷酸序列第296位由T变为C，在第99位氨基酸上，由缬氨酸(V)变为丙氨酸(A)；BHK-21细胞适应毒株1处变异，核苷酸序列第341位由T变为C，在第114位氨基酸上，由亮氨酸(L)变为脯氨酸(P)；牛、鼠适应毒株在3A蛋白氨基酸上均未变异。由此得出3A基因较稳定，变异较少；综合P1和3A基因位点的情况，不同宿主适应毒株的变异程度依次为猪适应毒株＞BHK-21细胞适应毒株＞牛适应毒株＞鼠适应毒株。
3 讨论不同血清型、不同遗传谱系混杂存在，猪牛羊交叉感染和病毒跨境传播进一步加大了我国FMD防控的难度[13-14]，FMDV在流行过程中易受外界因素的影响，特别是易感动物免疫压力的影响，病毒的毒力和抗原性都易发生变异。选择压力主要作用于抗原位点，因此病毒的变异也主要发生在编码这些位点的基因组序列中[14-15]。
P1基因编码的结构蛋白是构成FMDV衣壳的基础，P1基因编码的结构蛋白具有很好的抗原性，包含了主要的抗原位点，对诱导动物机体产生中和抗体和其他保护性免疫反应有重要作用。本研究对不同宿主适应毒株进行序列比对，P1基因核苷酸序列相似性比较高(99.6%以上)，氨基酸相似性在99.3%以上，未出现碱基缺失现象，而且主要的抗原位点稳定。刘亚丽等[9, 16-17]研究表明VP1基因上145(N)、152(D)、158(Q)、218(A)位是O型FMDV抗原的关键氨基酸位点。一般来说，与毒力相关基因的改变会引起病毒宿主范围和毒力方面的变化。何奇松等[18]研究表明，VP1是病毒结构中最重要的抗原位点及抗原变异的关键域区，可诱导动物机体产生中和抗体。本研究经适应性传代后的各宿主适应毒株在上述的氨基酸位点均未变异。由此可推断，对FMDV抗原性有重要影响的氨基酸位点并未发生变异，且与宿主嗜性密切相关的基因位点应该在VP1之外。已证实O型FMDV VP2的70—80位和131—134位氨基酸残基为抗原表位，具有明显抗原性[19-20]。本试验VP2发生变异的氨基酸为第79位、133位，均位于VP2抗原位点上，VP2上可能存在适应宿主的关键氨基酸位点。王琳萱等[21]分析FMDV毒株时发现，结构蛋白比非结构蛋白更容易变异，而结构蛋白的突变或缺失可能会帮助FMDV逃过宿主产生的免疫反应。非结构蛋白的突变和缺失可能不利于FMDV复制和蛋白质加工，王琳萱研究表明，P1结构蛋白的变异顺序为VP1＞VP2＞VP3＞VP4，最为保守的基因结构是VP4。J. I. Núñez等研究发现3A上一个或极少的几个位点氨基酸发生病毒准种突变范畴内的替换，就有可能使病毒适应新的宿主上[22]。3A基因编码氨基酸的组成及结构的变化是毒株宿主嗜性发生改变的主要分子遗传机制。张永光等[23-24]将O/China/99毒株经3个不同的宿主系连续传代后，3A基因发生突变，高代次传代毒有向“传统猪适应毒株”演化的趋势，与本次试验所获得高代次的BHK-21细胞适应毒株在传代过程中的变异趋势一致。
4 结论O型口蹄疫病毒在不同宿主传代过程中造成VP1基因的变异，但其主要抗原位点稳定；VP2基因的变异均位于抗原表位上；最为保守的是VP4基因，均未变异；在不同宿主适应性传代中，鼠适应毒株变异最小，将乳鼠适应毒株作为口蹄疫原始毒种保存更为有利。
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