2. 内蒙古自治区农牧业科学院, 呼和浩特 010019
2. Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010019, China
随着我国草牧业的不断发展,我国畜产品需求量日益增长,饲草料的质量和数量成为制约畜牧业发展的首要问题。天然草原作为牧草的主要来源之一,由于不合理的利用造成牧草利用率降低,导致饲草料制约草地畜牧业发展的问题尤为突出。在草原牧区,由于饲草加工工艺和贮存条件的落后,牧民通常将天然牧草调制成干草或者打成草捆保存,这样不仅使天然牧草营养物质损失严重,而且还造成家畜冬春季节缺乏青绿饲料而营养摄入不足。将天然牧草调制成青贮饲料较干草可使营养成分损失降低15%~20%[1-3],天然牧草青贮后具有酸香气味,可提高牧草的适口性和家畜的消化率[4]。
青贮过程主要通过附着的乳酸菌将原料中的可溶性碳水化合物转变为乳酸等作为发酵底物[5],在青贮发酵初期,pH迅速下降,霉菌、大肠杆菌等有害细菌生长受到限制[6]。天然牧草作为青贮材料存在可溶性碳水化合物含量低、乳酸菌含量低、干物质含量低的问题[5],为保证获得较高质量青贮饲料,常添加乳酸菌剂等来改善青贮品质[7]。天然牧草表面附着乳酸菌较少,通常情况下小于105 cfu·g-1 FM,添加乳酸菌可以在青贮初期保证充足的发酵底物,提高乳酸含量,降低pH,为厌氧发酵提供有利条件[8]。纤维素酶的添加可以促进细胞壁的降解,促进可溶性碳水化合物的分解,减少中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)损失。
草甸草原因其地理位置及经济、交通的限制,常采用青贮窖的形式来进行天然牧草保存,天然牧草开窖饲喂过程中,酵母菌、霉菌、梭菌的好氧繁殖,造成青贮发酵品质、营养成分发生变化从而直接影响其大面积推广应用,周天荣[9]在草甸草原青贮试验中添加2 × 105 cfu·g-1乳酸菌、0.8 g·kg-1的纤维素酶改善了草甸草原天然牧草青贮的营养品质及发酵品质,然而目前乳酸菌剂及纤维素酶对青贮品质的影响主要集中在玉米、苜蓿、燕麦等[10-12]方面,对草甸草原天然牧草青贮微生物鲜有报道。本试验在前期青贮最适添加剂研究的基础上,为了进一步改善天然牧草青贮特性,提高青贮饲料利用效率,增加农牧民收入,探讨了不同青贮方式及不同添加剂对草甸草原天然牧草青贮品质的影响。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 青贮材料试验所用青贮原料生长在内蒙古呼伦贝尔市草原生态系统国家野外科学观测研究站试验区(48.27°N, 119.44°E),海拔为620~677 m,年降水量323 mm,无霜期120 d左右,属温带半干旱大陆性气候,样地为草甸草原,优势地带性群落为羊草草原群落,草甸草原天然牧草于2015年7月25日刈割,牧草处于盛花期,试验区植物群落组成、化学成分及微生物组成如表 1所示。
试验用乳酸菌(LAB)为日本雪印有限公司生产的乳酸菌添加剂(主要成分为植物乳杆菌((L.plantarum)≥1.0×109 cfu·g-1),纤维素酶(CE)是由日本明治精华制药有限公司生产的黑曲霉((Aspergillus niger)≥1.0×105 cfu·g-1)。
1.2 试验设计与处理试验采用完全随机设计,分别设置SLAB(真空袋,乳酸菌(2×105 cfu·g-1))、SCE(真空袋,纤维素酶(0.8 g·kg-1))、SCK(真空袋,无添加,对照)、BLAB(青贮窖,乳酸菌(2×105 cfu·g-1))、BCE(青贮窖,纤维素酶(0.8 g·kg-1))、BCK(青贮窖,无添加,对照)6个组,每组3个重复。天然牧草利用电动铡刀(130DX, ARS,日本)切短至3~5 cm,小包装采用聚乙烯真空包装,袋中填充天然牧草150 g并用真空包装机真空封口;窖储采用试验室青贮窖,为容积达20 L的可加盖型聚乙烯塑料桶,室温保存。天然牧草均在青贮60 d后取样,测定其发酵品质、微生物组成及营养成分。
1.3 测定指标 1.3.1 样品处理青贮60 d后打开青贮窖,取出青贮饲料后快速混匀,采用四分法取10 g样品加入90 mL去离子水,4 ℃放置24 h,通过4层纱布和定性滤纸过滤,-20 ℃冷冻保存备用。浸提液用于测定pH、有机酸、氨态氮等指标。
1.3.2 发酵品质将制备的青贮饲料浸提液采用奥豪斯-100/B型酸度计测定pH。取5 mL加1 mL 10%三氯乙酸,旋涡振荡混匀,11 000 r·min-1离心10 min,上清液用0.45 μm滤膜过滤后上机测乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)含量,用岛津GC8A型高效液相色谱仪分析滤液中有机酸的含量(色谱柱:KC811 column, Shimadzu,日本;检测器:SPDM10AVP;流动相:3 mmol·L-1高氯酸,流速1 mL·min-1,柱温50℃;检测波长210 nm,进样量5 μL)[13]。采用苯酚-次氯酸比色法测定氨态氮含量[14]。
1.3.3 微生物测定取5 g青贮样品与45 mL无菌水均匀混合,用8.50 g·L-1无菌生理盐水稀释10-1、10-3、10-5,乳酸菌(Lactic acid bacteria)数量采用MRS(Difco)固体培养基,霉菌(Molds)和酵母菌(Yeasts)采用PDA(Potato Dextrose Agar, Nissui Ltd., Tokyo, Japan)培养基,一般好氧性细菌(Aerobic bacteria)采用营养琼脂(Nutrient Agar, Nissui Ltd., Tokyo, Japan)培养基,大肠杆菌(Coliform)采用BLB (Blue Light Broth, Nissui Ltd., Tokyo, Japan)培养基,乳酸菌30 ℃厌氧培养箱中培养48 h后计数,酵母菌、霉菌、一般好氧性细菌、大肠杆菌置于30 ℃恒温培养箱中培养48 h后计数,所有微生物数据采用log10 cfu·g-1 FM表示。
1.3.4 营养成分干物质(DM)、粗蛋白(CP)、粗脂肪(EE)、粗灰分(Ash)的测定采用AOAC (1990)[15]法,中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)的测定采用Van Soest测定法[16]。可溶性碳水化合物(WSC)利用蒽酮-硫酸比色法测定,缓冲能值采用滴定法测定[17]。
1.4 数据分析试验数据采用SAS 9.0统计软件分析,青贮60 d后发酵品质、微生物组成、营养成分均采用单因素方差分析,分析青贮方式(M)与添加剂(T)的主效应并分析其互作效应(M × T),利用Duncan’s方法进行显著性分析,P < 0.05为差异显著,P>0.05为差异不显著,结果用“平均值(±标准误)”表示。
2 结果 2.1 不同添加剂及青贮方式对天然牧草青贮发酵品质的影响不同添加剂及青贮方式对天然牧草青贮发酵品质的影响如表 2所示,青贮60 d后,各组pH均在5.0以下,与CK组比较,各添加剂处理组pH显著低于CK(P < 0.05),袋贮与窖贮在乙酸、丙酸、丁酸和氨态氮/总氮方面差异不显著(P>0.05),青贮后各添加剂组乳酸含量显著高于CK组(P < 0.05),乙酸含量显著低于CK组(P < 0.05),各添加剂组间乳酸/乙酸差异不显著(P>0.05),袋贮乳酸/乙酸高于窖贮。青贮60 d后,LAB与CE组均未检测出丙酸和丁酸,CK组丁酸含量≤2.10 g·kg-1 FM,添加剂青贮饲料中氨态氮/总氮变化显著减少且低于CK组(P < 0.05),说明青贮中添加乳酸菌和纤维素酶有利于发酵品质的提高。
不同添加剂及青贮方式对天然牧草青贮微生物组成的影响如表 3所示。不同青贮方式下乳酸菌、好氧细菌和霉菌含量差异不显著(P>0.05),添加LAB和CE组乳酸菌含量显著高于CK组(P < 0.05),LAB组乳酸菌含量最高,可能的原因是添加的乳酸菌剂作为外源乳酸菌增加了发酵过程中乳酸菌的含量。从酵母菌来看,添加剂组显著降低了青贮后酵母菌的含量(P < 0.05),但LAB与CE添加组间差异不显著(P>0.05)。青贮60 d后,各组中均未检测出霉菌和大肠杆菌。
不同添加剂及青贮方式对天然牧草青贮CP、Ash、EE、NDF、ADF、WSC及DM的影响如表 4所示,天然牧草添加LAB和CE后CP含量高于CK组,说明添加剂可提高粗蛋白的保存率。天然牧草各组间Ash差异不显著(P>0.05),添加CE显著降低了天然牧草中EE的含量(P < 0.05)。添加CE后,NDF含量显著低于CK组(P < 0.05),袋贮ADF含量显著低于CK组(P < 0.05),说明纤维素酶在降解纤维类物质方面的效果好于乳酸菌,纤维素类物质降解后可为青贮发酵提供更多底物。LAB组WSC低于CE组,可能是LAB的添加促进乳酸菌生长而消耗了可溶性碳水化合物,而CE的添加促进了纤维类物质降解,生成了更多的可溶性碳水化合物。
天然牧草青贮经60 d发酵后,各组pH均为4.01~4.91,添加剂组pH均达到了青贮临界值(4.2) 以下[18],LA含量为15.88~36.81 g·kg-1 FM,AN/TN含量<60 g·kg-1 FM,添加剂组均未能检测到PA和AA,说明天然牧草青贮具有良好的发酵品质[19],本试验分别在青贮袋及青贮窖中进行,青贮装置密封性较好,所以在未添加情况下也获得了较好的青贮饲料。
本试验中,添加纤维素酶显著提高了LA含量(P < 0.05),降低了pH(P < 0.05),青贮后未检测到丙酸和丁酸,说明生成丁酸的酪酸菌生长受到了抑制,本试验中青贮后AN/TN降低,与J.M. Wilkinson等[20]的研究结果一致。植物乳杆菌(L.plantarum)可增加发酵过程中有效活菌种数量,促进乳酸发酵[5],添加乳酸菌促进了青贮发酵初期以乳酸发酵为主的发酵进程,快速了降低环境pH,有效抑制有害微生物的生长,提高青贮发酵品质,S. Uchida和Y. Kitamura[21]在热带牧草中接种乳酸菌,发现其对发酵品质作用不明显,本试验中接种的乳酸菌以同型发酵为主,显著提高了LA/AA的比值(P < 0.05),促进了WSC的转化,与其结论不一致。
3.2 不同添加剂及青贮方式对天然牧草青贮微生物组成的影响青贮材料除附着乳酸菌外,还附着一些有害菌如霉菌、酵母菌和大肠杆菌等,天然牧草虽然表面附着乳酸菌较多(>5 log cfu·g-1 FM),但一般好氧性细菌、霉菌和大肠杆菌附着量也较大,分别为7.08 log10 cfu·g-1 FM,5.01 log10 cfu·g-1 FM和5.32 log10 cfu·g-1 FM,这些有害菌的附着可能造成青贮过程中营养物质损耗。
在青贮过程中,添加剂组乳酸菌含量均显著高于CK组,添加的乳酸菌剂和纤维素酶均很好的定植与分解,产生了一定量的乳酸,从而有效地抑制了有害微生物的繁殖,这与陈雷等[22]和M.R.Stokes等[23]的研究结果一致。青贮发酵过程中,微生物利用植物所含的糖类物质进行繁殖,在数量上有所增长,在天然牧草青贮发酵过程中,乳酸菌、一般好氧性细菌、酵母菌均大量生长,添加纤维素酶组的乳酸菌大量增长,但其他细菌生长得到了抑制,这可能与纤维素酶破坏原料细胞壁有关[24]。青贮结束后,乳酸菌添加组中一般好氧性细菌数量下降,大肠杆菌和霉菌几乎消失,是乳酸菌对其他微生物的抑制作用增强,有研究表明,青贮乳酸菌中起关键作用的是片球菌、乳球菌和乳杆菌,其中布氏乳杆菌、植物乳杆菌等同型发酵乳酸菌是促进饲料青贮成功的重要菌种[25],本试验中添加的乳酸菌以植物乳杆菌为主,在青贮中取得了很好的效果。
3.3 不同添加剂及青贮方式对天然牧草青贮营养成分的影响天然牧草WSC含量低,BC含量高,直接青贮很难达到理想效果,本试验中,袋装与窖装青贮在未做添加剂处理情况下也取得了较好的青贮品质,这可能与天然牧草的DM含量有关,本试验中天然牧草DM含量为529.37 g·kg-1 DM,与P. McDonald等[26]研究高DM青贮苜蓿增加植物细胞渗透压而导致生理干旱,从而抑制不良发酵所得结果一致,E.Charmley和D.M.Veira[27]研究发现,乳酸菌能够在低水分环境下保持活性从而获得较好的青贮品质。
添加乳酸菌后,不仅提高了天然牧草青贮的发酵品质,营养品质也得到了改善,乳酸菌的添加促进乳酸的发酵,提高青贮饲料中CP和WSC的利用率[28]。纤维素、半纤维素是植物细胞壁的重要组成部分,纤维素酶的添加降低了天然牧草中的NDF和ADF,从而将结构性碳水化合物降解为WSC,为乳酸菌的发酵提供足够的底物,贾燕霞等[29]在象草,K.K.Ni等[30]在麦秸青贮及Z.H.Sun等[31]在玉米中添加纤维素酶均得到类似结果。
4 结论添加乳酸菌和纤维素酶对天然牧草青贮品质均有改善作用。在提高乳酸菌含量方面LAB的效果优于CE,各组处理在小包装袋贮与大规模窖贮方面均差异不显著(P>0.05)。综合考虑青贮品质、微生物组成和营养成分,添加LAB可得到优良的天然牧草青贮饲料,可在草原牧区大面积推广天然牧草窖贮。
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