2. 江苏省肉羊产业工程技术研究中心, 南京 210095;
3. 启东瑞鹏牧业有限公司, 南通 226227
, JIN Peng-jin1, WANG Ruo-cheng1, SUN Ling-wei2, WANG Feng2, LI Peng3, CHENG Zhi-jun3, MAO Da-gan1
2. Jiangsu Engineering Technology Research Center of Mutton Sheep & Goat Industry, Nanjing 210095, China;
3. Qidong Ruipeng Animal Husbandry Co., Ltd, Nantong 226227, China
骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins, BMPs)系统在动物的生长、发育和繁殖过程中起着重要作用[1-3]。J. A.Visser与L. Gouédard等[4-5]研究指出，胚胎将与子宫产生关联时，子宫内膜间质细胞中的BMP2表达量上升，胚胎着床后的BMP2也持续表达。BMP信号通路的受体BMPR1B基因敲除的小鼠子宫形态结构遭到严重的破坏，子宫内腺体的形成受阻[6]。研究表明，BMP2、BMP4及其受体BMPR1B在小鼠发情周期的子宫中亦呈细胞特异性与阶段特异性表达[3]。
RGMb(Repulsive guidance molecule b)是排斥导向分子(RGM)家族的成员之一，广泛表达于神经系统、消化系统及生殖系统[7]，作为BMP2和BMP4的辅助受体，可增强BMP信号通路的转导。S.Yura等[8]研究表明，RGMb和BMP通路的功能元件在小鼠生殖轴上共表达，可调节细胞和组织水平BMP信号转导。本课题组[9]前期试验表明，RGMb在大鼠发情周期的子宫而非卵巢中呈细胞和阶段特异性表达，同时子宫中RGMb蛋白的表达受到外源类固醇激素的影响。尽管有研究表明，定点敲除小鼠卵巢与睾丸中的RGMb基因并不影响卵巢与睾丸的机能[10]，但RGMb在子宫中的作用尚不清楚。
产于中国江浙沪太湖流域的湖羊是世界著名的多胎绵羊品种。为了探讨湖羊的多胎性能，研究人员从激素分泌[11]、多胎基因[12]与子宫内环境[13]等方面进行了研究。笔者近期研究表明，对妊娠湖羊进行50%限饲处理导致羔羊宫内发育迟缓[14]。多数研究表明，限饲可影响动物的子宫和胎盘功能，引起胚胎宫内发育迟缓[15-16]。因此本研究首先分析3月龄湖羊的RGMb组织表达谱，同时分析不同发育阶段湖羊子宫中RGMb的表达定位；然后以妊娠母羊为对象，研究限饲对子宫RGMb和BMP及其受体表达的影响，为深入研究RGMb参与湖羊子宫机能调控提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物组织表达谱试验选取体重相近的3月龄湖羊(体重为(21.01±0.30) kg)3只，屠宰后收集卵巢、垂体、下丘脑、心、脾、肾、肝、嗅脑、大脑、小脑、脑桥、子宫角、乳腺、松果体、视网膜共15种组织样品，于液氮保存。
限饲试验选取生理状态相似的18月龄湖羊30只(体重为(40.1±1.2) kg)，单栏饲养，放置阴道栓(30 mg；Pharmp PTY，Herston City，Australi)诱导同期发情，人工授精(授精当日为妊娠第0天)。在妊娠第35天通过B超监测，选取怀双羔的母羊(16只)分为2组：对照组饲喂100% NRC日粮；限饲组饲喂50% NRC日粮[14]。于妊娠第110天采集子宫组织样品(n=8)。部分组织置于4%对聚甲醛中固定，部分组织置于液氮中保存。
1.2 实时荧光定量参照C.L.Meng等[17]的方法，应用Trizol(Invitrogen)提取子宫组织总RNA，利用反转录试剂盒(TaKaRa，RR036A)对总RNA进行反转录，利用定量试剂盒(TaKaRa，RR420A)进行qPCR。引物由上海英骏生物技术有限公司合成，序列见表 1。采用ΔΔCt=(Ct目的基因－Ct内参基因)法计算基因的相对表达量。
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表 1 qPCR引物 Table 1 Primers used for qPCR |
参照N.N.Guo等[18]的方法对3月龄、7月龄黄体期和妊娠110 d的子宫组织制作常规石蜡切片，检测子宫组织中RGMb的表达。RGMb抗体(abcam，ab96727) 以1:200进行稀释，阴性对照采用BSA替代一抗。应用Nikon摄像机拍照分析。
1.4 蛋白免疫印迹分析参照Q.W.Wei等[19]的方法对妊娠110 d湖羊子宫组织提取总蛋白进行免疫印迹分析。RGMb与GAPDH(碧云天)抗体均以1:1 000稀释。利用Kodak Digital Sciences Image Station 440 (Eastman Kodak，Rochester，NY，USA)对目的条带显影摄像，使用Image J软件对目的条带进行分析。
1.5 数据分析应用GapdhPad5.0软件对数据进行分析。所有数据以“平均数±标准误”表示，采用t检验进行差异显著性分析，不同字母表示差异显著(P < 0.05)。
2 结果 2.1 RGMb mRNA在湖羊机体不同组织中的表达应用实时定量PCR技术检测3月龄湖羊RGMb基因在包括生殖系统在内的15种组织中的相对表达量(图 1)。以下丘脑组织中的相对表达量为1，RGMb在心、大脑和视网膜的表达量大于1，在小脑、子宫、乳腺和松果体的相对表达量介于0.5与1之间，而在剩余的垂体、卵巢等7种组织的相对表达量低于0.5，在脾中几乎不表达。
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图 1 qPCR检测RGMb在3月龄湖羊机体组织中的表达 Figure 1 RGMb expression in different tissues of 3-month-old Hu ewes detected by qPCR |
应用免疫组织化学技术检测RGMb在性成熟前(3月龄)、性成熟后黄体期(7月龄)和妊娠期湖羊(110 d)子宫组织中的表达模式(图 2A，2B，2C)。观察不同阶段湖羊子宫形态发现，子宫内膜腺体随着年龄增加也逐渐变大，直至妊娠期达到最大。免疫组化结果显示，RGMb在3月龄(图 2A)、7月龄(图 2B)与妊娠期(图 2C)湖羊子宫的腔上皮(图 2C-g)和腺上皮(图 2C-f)细胞中均为强表达，在各个阶段湖羊子宫的环形肌层亦有弱表达(图 2C-h)。
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A.3月龄；B.7月龄黄体期；C.妊娠110 d。b，f.腺上皮(GEC)；c，g.腔上皮(LEC)；d，h.肌环。NC.阴性对照; RG. RGMb A. 3-month-old; B.Luteal phase of 7-month-old; C. Pregnant D110.b, f.Glandular epithelial cells; c, g. Luminal epithelial cells; d, h. Circle muscle. NC. Negative control; RG. RGMb 图 2 RGMb在3月龄、7月龄及妊娠时期湖羊子宫中的定位 Figure 2 Localization of RGMb protein in the uterus of 3-month-old, 7-month-old and pregnant Hu ewes |
应用实时定量PCR与WB技术检测限饲对妊娠湖羊子宫组织RGMb mRNA与蛋白水平的影响。结果发现，限饲对RGMb mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05，图 3A)，但限饲显著降低了RGMb蛋白的表达量(P < 0.05，图 3B)。
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A.RGMb mRNA表达量；B. RGMb蛋白表达量。不同字母表示差异显著(P < 0.05)，下同 A. Relative expression of RGMb mRNA; B. Relative expression of RGMb protein. Bars with different letters are significantly different (P < 0.05), the same as below 图 3 限饲对妊娠湖羊子宫RGMb蛋白和mRNA表达的影响 Figure 3 Effect of food restriction on uterine expression of RGMb protein and mRNA in pregnant Hu ewes |
BMP2与BMP4是BMP系统中的重要成员，参与调控动物生长发育过程，且在维持雌性动物子宫稳态中发挥着重要的作用。应用实时定量PCR技术检测湖羊子宫组织BMP2和BMP4 mRNA的表达。结果显示，与对照组相比，限饲组中BMP2与BMP4 mRNA表达量显著上升(P < 0.05，图 4A，4B)。
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A.BMP2相对表达量；B.BMP4相对表达量 A. Relative expression of BMP2; B. Relative expression of BMP4 图 4 限饲对妊娠湖羊子宫BMP2和BMP4 mRNA表达的影响 Figure 4 Effect of food restriction on uterine expression of BMP2 and BMP4 mRNA in pregnant Hu ewes |
BMP受体可分为Ⅰ类与Ⅱ类受体，BMPR1A与BMPR1B属于Ⅰ类受体，BMPR2属于Ⅱ类受体。应用实时定量PCR技术检测湖羊子宫组织受体BMPR1A、BMPR1B和BMPR2 mRNA的表达。与对照组相比，限饲组中的BMPR1A、BMPR1B与BMPR2 mRNA表达水平均显著降低(P < 0.05，图 5A，5B，5C)。
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A.BMPR1A相对表达量；B.BMPR1B相对表达量；C.BMPR2相对表达量 A. Relative expression of BMPR1A; B. Relative expression of BMPR1B; C. Relative expression of BMPR2 图 5 限饲对妊娠湖羊子宫BMP受体mRNA表达的影响 Figure 5 Effect of food restriction on uterine mRNA expression of BMP receptors in pregnant Hu ewes |
T.A.Samad等[20]于2005年指出RGMb是BMP信号通路的辅助受体。同年，Y.Xia等[21]指出，RGMb在生殖系统的多种细胞中有表达，如睾丸生精细胞、卵巢初级卵母细胞等。本课题组对雄性湖羊的研究发现RGMb在生殖系统中表达量较高[22]。本试验以限饲湖羊为模型，探讨RGMb与BMP信号通路在湖羊子宫组织中的潜在作用。
作为BMP2与4的辅助受体，RGMb可以增强BMP的信号，促进细胞低水平配体的敏感性[23]。本研究中，RGMb在3月龄湖羊的14种不同组织(脾中未检测到)中均有表达，在心、大脑、视网膜表达量高，与已报道的RGMb在心血管、中枢神经等系统中参与重要的生理与病理过程[7, 21, 24]一致。RGMb在子宫组织中的相对表达量大于0.5，笔者前期的研究表明，RGMb在大鼠子宫有表达，且其表达量随发情周期的不同阶段而变化[17]。因此，RGMb基因可能对雌性湖羊的生殖活动具有重要的调控作用。
为了证实RGMb在湖羊子宫中的表达，我们应用IHC对不同阶段湖羊子宫中的RGMb定位进行了研究。结果发现，湖羊子宫RGMb主要定位于腔上皮和腺上皮细胞，在环形肌层有弱表达，这与先前大鼠子宫中的定位结果一致[17]。子宫RGMb在性成熟前(3月龄)、性成熟后(7月龄)与妊娠阶段(18月龄)的细胞定位模式一致，这不同于雄性小鼠RGMb在睾丸中的定位具有阶段特异性[21]。G. F. Erickson等[25]研究发现，BMP信号通路中的大多数成员均定位于子宫内膜细胞与腔上皮细胞中，如BMP4与BMP2蛋白定位于子宫内膜腔上皮、腺上皮与肌环层[3]；BMP2 mRNA在小鼠子宫表达[3]；BMPR1A与BMPR2B表达于子宫内膜与子宫肌膜上。RGMb与BMP信号途径功能元件的共定位提示，RGMb可能协同BMP信号通路在生殖系统方面发挥着重要的生物学作用。因此，RGMb可能参与BMP对湖羊子宫结构的维持与功能的调控。
为了研究RGMb与子宫机能之间的关系，通过对湖羊进行50%的限饲处理，结果发现，RGMb蛋白的表达水平下降，这可能是由于RGMb mRNA在湖羊子宫的表达量较高，转录后翻译的蛋白质表达量相对较低，从而导致限饲对RGMb蛋白表达量影响较大[26-27]。进一步研究发现，限饲升高了RGMb配体即BMP2与BMP4 mRNA水平，降低了BMP经典通路的受体BMPR1A、BMPR1B与BMPR2 mRNA水平，这种配体与受体相反的变化趋势，可能是由于子宫对限饲后的稳态维持反应，从而维持胎儿的生长发育与存活。大量前期研究指出，BMP信号通路通过影响细胞的增殖与凋亡进而调节动物妊娠过程[28-29]。BMP2/4可参与调控早期妊娠子宫蜕膜退化的过程[30]；P.S.Tanwar等[31]指出，BMP4是维持调节子宫内膜稳态的潜在调控者。BMP受体亦是影响雌性动物生殖系统的重要因素之一。在BMPR1B基因敲除小鼠中子宫腺体的形成受阻[6]；BMPR1A是胚胎植入期的关键因子[32]。RGMb与BMP信号在调控机体稳态中发挥着重要的生物学功能。转染RGMb cDNA可增强BMP的信号通路转导，但这种增强的效果具有BMP配体依赖性。RGMb可与BMP信号通路受体互作，发挥一定功能作用。研究指出，在转染RGMb的HEK293细胞中，通过免疫共沉淀技术发现，RGMb可与Ⅰ类受体(ALK2、ALK3和ALK6) 和Ⅱ类受体(ACTRIIA、BMPRII和ACTRIIB)相结合形成复合物[20]。另外，人与啮齿动物嗜酸性细胞产生的BMP2与BMP4能促进子宫环形肌与平滑肌细胞的凋亡[33-35]。本试验中，BMP配体与受体mRNA表达量出现的差异性变化，提示限饲影响了BMP信号通路系统在妊娠期湖羊子宫正常发挥功能，然而BMP信号通路与RGMb在湖羊子宫中的具体作用机制有待进一步研究。
4 结论RGMb在湖羊机体各组织中的表达为研究RGMb参与湖羊机体生长发育调控奠定了基础。限饲影响了子宫组织BMP系统成员尤其是RGMb蛋白的表达，提示RGMb可能参与湖羊子宫机能的调控，为进一步研究BMP在子宫中的作用机制提供了试验依据。
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