牦牛作为青藏高原地区的重要经济动物之一,长期生活在极度寒冷和缺氧的环境中,已经成为当地人生活的必需品,可提供肉、奶和皮毛等,同时也是当地重要的交通工具[1]。牦牛的繁殖性能具有明显的季节性,实际繁殖水平仅为两年一胎或三年二胎,与其他哺乳动物相比繁殖率较低[2-4]。体外胚胎生产技术对提高牦牛繁殖效率尤为重要,而精子活性作为体外胚胎生产的重要因素更不能忽视[5]。近几年,生长因子在胚胎发育中的作用已作为提高家畜繁殖的研究热点,如表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)[6]、胰岛素样生长因子(Insulinlike growth factor,IGF)[7]、转化生长因子(Transforming growth factor,TGF)[8]等。
表皮生长因子作为重要的细胞因子,可提高体外胚胎的发育能力,促进细胞的分化和增殖[6]。研究显示,EGF在雄性和雌性哺乳动物生殖系统中均具有不可忽视的作用[9],大鼠和人的精液中均可检测到EGF[10],不同哺乳动物精子的顶体区域均可检测到表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR),如小鼠、兔、牛和人[11-12]等。体外条件下,EGF可调控小鼠、牛和人精子的获能、运动性能和顶体反应[11, 13],但其对精子的影响是否会影响后续胚胎的发育未见报道。性成熟雄性小鼠中手术摘除下颌腺,精液中EGF显著降低,睾丸中精细胞显著降低,附睾中成熟的精子也显著降低[14]。课题组前期研究显示,牦牛睾丸发育过程中精细胞和精子均可表达EGF和EGFR[15],这些研究均表明EGF对哺乳动物精子功能的调节具有重要作用。
细胞凋亡在雄性不育疾病起重要作用,改变细胞凋亡程序与雄性不育、精子质量等紧密相关[16-17]。凋亡发生过程中,抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax作为重要的信号,有助于维持细胞平衡,这两个蛋白表达水平的失衡将会引起细胞凋亡[18-19]。精子生成过程中,Bax作为调节细胞凋亡的关键因素,对精子的数量和质量至关重要[20]。EGF作为主要的代谢因子,在许多哺乳动物细胞类型中发挥生物学效应,如细胞的发育和增殖[21-22]。本课题组近期研究显示,EGF可通过调控Survivin和HSP70提高牦牛附植前胚胎发育能力,也可通过调控Bax和Baxi提高牦牛卵母细胞的成熟率和后续发育能力,但是EGF对精子细胞凋亡的影响及其对后期胚胎发育的作用在家畜中未见报道。
研究生长因子对牦牛冻精活性的影响及可能的作用机制,可为改善牦牛冻精体外获能方法提供新的思路,其研究结果不仅有助于牦牛辅助繁殖技术的高效发展,也为生长因子调控哺乳动物精子活性的分子机制研究提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂双抗、DPBS购自Gibco公司,表皮生长因子、M199培养液,BSA购自Sigma公司(美国),Bax(ab32503)、Bcl-2(ab117115) 购自Abcam公司(美国),荧光二抗和普通二抗(bs-0294D-FITC、bs-0294D、bs-0295G-AF488、bs-0295G)购自博奥森公司(北京)。微量RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCRmix购自OMEGA生物公司(美国),SYBR Green Ⅱ荧光定量PCR试剂盒购自宝生物公司(大连)。Western blot和免疫荧光检测所用的其他试剂均购自碧云天生物公司(南京),卵母细胞和胚胎培养其他试剂均购自Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。
1.2 牦牛冻精的解冻与获能牦牛冻精购自青海省大通牦牛优质品种繁殖基地,冻精分装于250 μL细管,冻存于液氮,试验所用冻精均为同一个雄性牦牛。研究中采用上浮法(Swim-up)[23-24]对牦牛冻精进行分离。主要程序:将冻精管完全侵入35 ℃的水浴中进行冻精解冻,试验设计6组,每组3支冻精,将解冻的精液移入1.5 mL离心管,常温120 g离心10 min,弃掉上清液,加入1 mL精子获能培养液(Tyrodes mediums for sperms cultures,Sp-TALP)[25]对精子再次进行清洗,将精子混匀,常温120 g离心10 min,弃上清,重复2次,向离心沉淀的精子中轻轻加入1 mL Sp-TALP进行精子获能,同时在Sp-TALP液中分别加入0、50、75、100、150和200 ng·mL-1 EGF(Sigma,美国),置于37.5 ℃、5% CO2和饱和湿度下受精获能1.5 h,将上层约0.5 mL获能液转入10 mL的圆锥形离心管,再用加入了对应浓度EGF的Sp-TALP液将稀释上浮精子到5 mL,120 g离心10 min,弃掉上清,然后用受精液(G-IVFTM PLUS,Vitrolife,德国)将沉淀精子稀释到浓度为(5~8)×109·mL-1,取微量精液进行精子运动性能检测,剩余精液用于体外受精(In vitro fertilization,IVF)。
1.3 检测精子活性获能完成后,取20 μL(1×109·mL-1)精子悬液,将其滴于细胞计数板中,用18 mm×18 mm的盖玻片覆盖后,立即置于37 ℃的恒温板上,借助倒置显微镜和精子分析仪(Computer-assisted semen analyser, CASA, Microptic, Barcelona, Spain)评估精子活性,主要的分析参数为总精子活率、前向运动精子率(Progressive forward motility,PR)、直线速率(Straight line velocity,VSL)、线性比率、侧摆幅值等[26]。每次测量连续分析25个视野,每个样品进行3次测量,且每次测量至少分析500个精子。
1.4 牦牛精子中细胞凋亡基因表达的检测 1.4.1 RNA提取、cDNA合成及PCR扩增将每个处理组中获能的精子通过离心方法用PBS清洗3遍,每个处理组重复3次,每次为200 μL获能后的精液,参照微量总RNA提取试剂盒方法提取精子总RNA,并参照反转录试剂盒说明合成第一链cDNA,合成的cDNA保存于-20 ℃,备用。
1.4.2 Real-time PCR检测Bax、Bcl-2的表达根据GenBank公布的牛的Bax、Bcl-2和GAPDH的基因序列设计特异性引物,其具体信息和反应条件见表 1。反应体系为20 μL:1 μL cDNA,上下游引物各0.5 μL (0.2 μmol·mL-1),2×SYBR Green Ⅱ,PCR mix 10 μL,Passive Reference Dye Ⅱ 0.4 μL,ddH2O 7.6 μL。反应条件:95 ℃预变性20 s;95 ℃变性10 s、退火10 s(具体温度见表 1)、72 ℃延伸10 s,共40个循环,所用荧光定量PCR仪为ABI ViiATM 7。内参基因为GAPDH,重复3次。采用相对定量分析法分析基因表达[27]。
离心法用PBS洗涤获能精子3遍,蛋白裂解液裂解精子4 h后,10 000 g离心15 min,回收上清液。BCA蛋白浓度测定试剂盒定量提取蛋白浓度,分装、置于-80 ℃冰箱保存备用,所有操作4 ℃进行。蛋白上清液中加入5×SDS上样缓冲液,100 ℃水浴10 min,以20 μg蛋白/泳道上样,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE),电转膜至聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene fluoride, PVDF),室温摇床封闭2 h,分别加Bax或Bcl-2一抗,4 ℃过夜孵育,DPBS摇床洗涤3遍后,再加辣根过氧化物酶(Horse radish peroxidase, HRP)标记二抗,37 ℃孵育1 h,DPBS摇床洗涤3遍,电化学发光(Electrochemiluminescence, ECL)试剂盒进行曝光,显色清晰时,立刻拍照,记录结果。
1.6 EGF对牦牛胚胎发育能力的影响 1.6.1 卵母细胞收集和体外成熟培养将从屠宰场采集的牦牛卵巢置于加有双抗的生理盐水中,33~35 ℃,4 h内带回实验室,洗3遍,5 mL注射器收集直径约4~10 mm卵泡中的卵泡液,体视显微镜下挑选周围带有3层以上致密卵丘细胞、形态完好、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocyte complexes,COCs)(图 1A),用洗卵液(M199+5% FBS)清洗3遍后,将COCs移入含有预平衡成熟液(M199+10% FBS+100 μg·mL-1 FSH+50 μg·mL-1LH+100 μg·mL-1 E2+100 μg·mL-1青霉素+100 μg·mL-1链霉素)的四孔板中,每孔400 μL成熟液,200 μL矿物油覆盖,移入40枚COCs,37.5 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h,成熟卵母细胞见图 1B。
用受精液将精子稀释终浓度为(2~4)×106·mL-1后,置于4孔板中,每孔400 μL成熟液,200 μL矿物油覆盖,细胞培养箱中平衡0.5 h。筛选卵丘充分扩散并带有黏性的成熟COCs,用受精液清洗两次后,移入含有精子的四孔板中进行IVF,每孔40枚COCs,在37.5 ℃、5% CO2和饱和湿度培养箱中受精12~16 h。用移液枪微吹打COCs去除卵丘细胞,将假定的卵子置入含1% BSA的SoFaa液[28]中,每100 μL SoFaa微滴含有20个受精卵,在条件为37.5 ℃、5% CO2和饱和湿度的细胞培养箱中进行培养,受精后48和192 h, 分别统计卵裂胚胎(图 1C)和囊胚(图 1D)。
1.7 数据分析采用SPSS 19.0统计软件对数据进行单因素方差分析,卵裂率和囊胚率以受精卵数为基数进行比较,每组至少重复3次。对符合二项分布的数据中<30%和>70%,采用反正弦数据转换[ARSIN(SQRT(x))]。用SPSS 19.0软件对转换数据进行统计分析,Duncan多重比较法对数据进行比较分析(P < 0.05,表示差异显著),最后将处理的反正弦转换数据的平均数转换回百分数,以用于结果分析。
2 结果 2.1 EGF对牦牛冻精活性的影响EGF对牦牛获能精子总活率、前向运动精子率和其他运动参数的影响见表 2,与对照组(0 ng·mL-1 EGF)相比,EGF对牦牛获能精子总活率和前向运动精子率作用显著(P < 0.05),EGF可提高牦牛精子活力和线性运动能力。75、100、150 ng·mL-1 EGF处理组中精子活力和线性运动能力差异不显著,但显著高于其他处理组(P < 0.05)。200和50 ng·mL-1处理组中精子活力和线性运动能力均低于其他3个浓度的EGF处理组,但仍显著高于对照组(P < 0.05)。在75、100、150 ng·mL-1 EGF 3个处理组中精子的直线速率VSL和线性比率显著提高,但是侧摆幅值在对照组和处理组之间差异不显著(P>0.05)。
EGF在冻精获能过程作用后,获能牦牛精子中Bax和Bcl-2基因相对表达水平检测结果如图 2和3所示,Bax基因的相对转录水平在75、100、150 ng·mL-1 EGF处理组显著降低(P < 0.05),在3个处理组中Bcl-2基因表达显著高于其他处理组(P < 0.05),且3个处理组中Bax和Bcl-2基因的相对表达水平差异不显著(P>0.05)。对照组中,Bax基因的相对转录水平最高(P < 0.05),Bcl-2基因表达最低(P < 0.05),50和200 ng·mL-1处理组中Bax和Bcl-2基因相对转录量介于对照组和75、100、150 ng·mL-1 EGF处理组之间,两者之间的表达差异不显著(P>0.05)。
不同浓度EGF在牦牛冻精获能后,精子中Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平结果如图 4和图 5所示,75、100、150 ng·mL-1 EGF处理组中,Bax蛋白的表达水平显著低于对照组、50和200 ng·mL-1 EGF处理组(P < 0.05),但该3个处理组中Bcl-2蛋白的相对表达水平最高(P < 0.05)。对照组中,Bax蛋白相对表达量最高(P < 0.05),Bcl-2蛋白相对表达量最低(P < 0.05)。50 ng·mL-1 EGF处理组中Bax和Bcl-2蛋白的相对表达量介于对照组和75、100、150 ng·mL-1 EGF处理组之间。200 ng·mL-1处理组中Bax蛋白的表达水平显著高于50~150 ng·mL-1 EGF处理组(P < 0.05),但与对照组差异不显著(P>0.05)。Bcl-2蛋白的相对表达水平在200 ng·mL-1处理组中显著高于对照组和50 ng·mL-1处理组(P < 0.05),与75、100、150 ng·mL-1 EGF处理组差异不显著(P>0.05)。
通过上浮法和加入EGF获能后的精子用于体外受精后体外受精胚发育能力如表 3所示,75、100、150 ng·mL-1 EGF处理组精子用于受精后,胚胎卵裂率分别为(68.09±2.79)%、(70.79±3.35)%和(69.13±0.97)%,囊胚率分别为(18.75±0.59)%、(19.04±2.08)%和(17.86±2.41)%,3组的卵裂率显著高于200 ng·mL-1 EGF处理组和对照组,囊胚率有所提高,但与其他试验组和对照组差异不显著,对照组中卵裂率和囊胚率分别为(54.65±4.16)%和(17.02±1.34)%,50和200 ng·mL-1处理组胚胎卵裂率和囊胚率差异也不显著(P>0.05),卵裂率分别为(59.75±1.42)%和(56.99±2.15)%,囊胚率分别为(18.36±2.91)%和(16.98±1.49)%。
EGF作为重要的细胞生长因子,已证实在哺乳动物精子生成[9, 29]、卵母细胞成熟和胚胎发育过程中具有重要生物学作用[30-31]。本课题组先前研究显示EGF可通过调控细胞凋亡提高牦牛卵丘细胞质量[32]、卵母细胞的成熟和胚胎发育[33-34],且在牦牛睾丸发育过程中作为重要的分泌因子[15],但牦牛及其他家畜冻精体外获能过程中EGF是否具有调控作用未见报道。因此,本研究以长期生活在高寒地区的牦牛为研究对象,分析EGF对精子运动性能的调控,有助于通过生长因子的作用提高冻精的运动性能,改善牦牛辅助繁殖技术,增加体外胚胎生产的成功率,对牦牛的快速繁殖、品种资源的改良与保护具有重要意义。
上浮法和Percoll梯度分离法作为哺乳动物冻精体外获能主要方法[35-36],Percoll梯度法主要提高精子密度,但不能保证精子活性[36]。本研究采取上浮法分离牦牛冻精,并在获能过程中加入不同浓度EGF,结果显示浓度为75~150 ng·mL-1可显著提高冻精运动性能(表 2),而课题组先前研究显示100 ng·mL-1 EGF显著提高牦牛卵母细胞和胚胎发育能力,为了更加精确测量EGF对牦牛精子作用浓度,本研究又设立了75和150 ng·mL-1 EGF处理组,结果显示在75、100、150 ng·mL-1 EGF处理组精子运动性能和受精胚发育能力差异并不显著(表 2),证实浓度为75~150 ng·mL-1均可作为EGF最佳作用浓度,且作用效果与IGF的作用效果相似[23]。受精胚卵裂率作为受精效果最佳评估指标[35, 37],本研究不仅检测EGF对精子运动性能的影响,又检测了受精后胚胎的发育能力,其作用效果与精子运动性能提高的作用浓度具有一致性(表 3),但在牛和猪的IVF胚胎体外生产过程中,0和100 ng·mL-1的作用效果相似[38-39],可见不同的物种间EGF作用浓度存在一定差异,因此牦牛精液中的EGF生理学浓度仍需证实。
相关研究显示牦牛精子也可表达EGFR[15],因此推测EGF提高冻精运动性能可能与EGFR表达存在一定关联性,这也可能是200 ng·mL-1 EGF处理组中牦牛冻精运动性能和受精胚卵裂率降低的原因。EGFR可以与很多配体结合,如EGF、TGF-α、肝素结合表皮生长因子(Heparin-binding epidermal growth factor,HB-EGF)等,而这些配体之间的相互干扰在一定程度上影响其生理学作用[40-41]。因此,牦牛精子TGF-α、HB-EGF、TGF-α、HB-EGF的表达是否影响EGF的作用效果?TGF-α、HB-EGF是否也可以影响牦牛冻精运动性能?这些均有待进一步研究。
本研究显示EGF在牦牛冻精获能过程中可调控Bax和Bcl-2的表达(图 2~4),且这两者的失衡将会造成精子细胞的凋亡,这与IGF-1对牦牛冻精的作用效果具有相似性[23],表明哺乳动物冻精获能过程受多种生长因子调控。除Bax和Bcl-2之外,细胞凋亡还受多种生物信号调控,如生存素(Survivin)、热休克蛋白(热休克蛋白,HSP)等,研究证实Survivin和HSP70的表达失衡影响牦牛胚胎的发育能力[33],且Survivin和HSP70的表达水平受EGF调控,表明生长因子多途径调控细胞凋亡。生长因子在冻精获能过程中通过细胞凋亡影响精子的整体质量和数量,但启动凋亡后的精子和凋亡精子均不能完成正常受精[16]。精子miRNA或精子中相关从合子型~胚胎性转变基因的甲基化水平均对受精成功率具有重要影响[42-43],进而影响后续胚胎发育潜力,而EGF等生长因子可以调控相关细胞中miRNA和基因的甲基化水平[44],可见研究这些生长因子是否通过调控精子中miRNA和相关基因的甲基化水平影响IVF后胚胎的发育潜力,对哺乳动物辅助繁殖技术研究具有重要意义。
4 结论牦牛冻精体外获能过程中,EGF可阻滞精子凋亡,提高牦牛冻精的运动性能及IVF后胚胎的发育潜力,其最佳作用浓度为75~150 ng·mL-1。研究结果为通过相关生长因子作用改善哺乳动物冻精运动性能,促进辅助繁殖技术发展等相关研究提供重要参考。
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