2. 河北农业大学, 保定 071000
2. Hebei Agricultural University, Baoding 071000, China
色彩多样的毛色不仅能丰富人们的生活,其颜色的变化通常也与自身的生长速度、对抗疾病的能力和生产性能相关[1]。黑色素是脊椎动物表层结构中最主要的色素[2],还是哺乳动物唯一能够合成的色素[3],黑色素的产生或缺乏是哺乳动物毛色形成的主要物质基础。前黑素小体蛋白PMEL(Premelanosome protein)基因是调控毛皮动物毛色的主要候选基因之一[4]。PMEL基因是稀释基因家族中最出色的一员。到目前为止该基因突变只发生在家养动物中,如马PMEL基因发生错义突变能导致黑色素稀释,引起银色被毛。E.Brunberg等[5]分析了14个品种149匹银色和非银色被毛的马,发现银色被毛的马PMEL基因第11个外显子存在一处错义突变(精氨酸突变成半胱氨酸),但未出现于非银色马中,在第9个内含子中也存在一处缺失突变。研究认为马的银色被毛与PMEL基因多态性紧密相关[6]。小鼠PMEL基因突变会导致毛囊黑色素细胞功能逐渐丧失,并导致突变体产生银色毛发[7]。鸡PMEL基因编码一种黑素细胞特异性蛋白,这种存在于前黑素体基质中的蛋白对黑色素聚积以及黑素细胞正常发育起重要作用[8]。S.Kerje等[9]分析了红色原鸡、白来航等不同品种鸡PMEL基因序列后发现,该基因第10个外显子处含有9 bp的插入突变,该突变是形成显性白羽性状的主要原因,其对应于等位基因Ⅰ,在隐性等位基因i中不存在该突变。L.A.Clark等[10]研究发现,澳大利亚牧羊犬PMEL基因插入了一处逆转录转座子引起其白色表型。A.R.Hellström等[11]研究发现,PMEL 基因敲除的小鼠中PMEL 基因表达量极少,蛋白表达检测不到,小鼠毛色明显稀释变浅。Z.P.Jiang等[12]研究发现,棕黑色黄河鲤鱼皮肤中PMEL基因表达量明显高于红色兴国红鲤。不同物种PMEL基因的突变与其毛色的变化有紧密联系,启动子又能影响基因的表达和调控。启动子作为基因表达调控的“指挥者”[13],不仅能决定转录起始,还能调控基因表达的强弱。因此研究山羊PMEL基因启动子活性及转录调控区域对于揭示PMEL基因调控山羊被毛颜色的分子遗传机制具有重要作用。
本研究克隆了山羊PMEL基因启动子序列,构建不同缺失长度的启动子荧光素酶表达载体,以明确该基因核心启动子区和重要的转录因子结合位点。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂山羊样品为太行黑山羊。EasyPure Genomic DNA Kit、TransStart Taq DNA Polymerase、2×TransStart FastPfu PCR SuperMix、EasyPure PCR Purification Kit、Trans2K Plus DNA Marker、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、GelStain购自北京全式金公司,质粒载体T-Vector pMD19(Simple)、DNA Ligation Kit、限制性内切酶KpnⅠ和Hind Ⅲ购自TaKaRa公司,SanPrep柱式质粒DNA小量提取抽提试剂盒和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工公司,无内毒素质粒DNA大量提取试剂盒购自天根公司,双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司,DMEM培养基(高糖型)和DPBS购自Hyclone公司,T4连接酶、小牛血清、0.25%胰蛋白酶、Opti-MEM培养基和Lipofectamine® 2000 Transfection Reagent购自Thermo Fisher Science公司。质粒载体pGL3-basic、pRL-TK、293T细胞和A375细胞均为本实验室保存。
1.2 山羊PMEL基因启动子的克隆和序列分析提取黑色山羊肝基因组DNA,根据美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology,NCBI)中GenBank数据库公布的山羊PMEL基因序列(登录号:NW_005100668.1),结合真核生物启动子数据库(Eukaryotic Promoter Database,EPD)公布的人PMEL启动子信息,选取基因上游1.0 kb作为预测的转录调控序列并设计引物(表 1)进行PCR扩增,利用DNASTART 7.1软件进行限制性内切酶位点分析,所有片段上游引物和下游引物分别引入Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ限制性酶切位点与其对应的保护碱基。PCR扩增体系为50 μL:0.5 μL TransStart Taq DNA Polymerase,36 μL ddH2O,5 μL 10×TransStart Taq Buffer,4 μL 2.5 mmol·L-1 dNTPs,2.5 μL DNA模板,上、下游引物各1 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;经94 ℃ 30 s,退火温度退火30 s,72 ℃延伸,共35个循环(退火温度和延伸时间见表 1);72 ℃最终延伸10 min,4 ℃保存。以327(-251/+76) 为模板,根据重叠延伸PCR点突变技术扩增突变体。重叠延伸PCR扩增体系为50 μL,以pGL3-basic-327载体为模板,分别以引物327F、Mut-X-Rm和R、Mut-X-Fm通过重叠延伸PCR技术进行上下游产物的扩增,对扩增产物进行切胶回收及等比例混合。取上述混合物为模板,以引物327F和R扩增全长突变载体,PCR反应条件同上。重叠延伸PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;经94 ℃ 20 s,退火温度退火20 s,72 ℃延伸,共30个循环(退火温度和延伸时间见表 1);72℃最终延伸5 min,4 ℃保存。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测。通过在线预测软件FirstEF预测启动子区;通过在线预测软件MethPrimer预测CpG岛;通过在线预测软件AliBaba2.1、WWW Signal SCAN、Cluster、Nsite和JASPAR数据库预测核心启动子区的转录因子结合位点(在线预测软件网址见表 2)。
PCR产物(片段名称:X)与克隆载体pMD19(Simple)重组,将重组载体pMD19-X转化至Trans1-T1感受态细胞中。将菌液PCR鉴定为阳性的样品送往北京华大基因进行测序鉴定。对重组载体pMD19-X进行双酶切,回收产物与双酶切后的pGL3-Baisc连接、转化至感受态细胞,通过菌液PCR、测序和双酶切三重鉴定重组载体pGL3-Baisc-X,对鉴定为阳性的重组载体pGL3-Baisc-X进行无内毒素质粒提取,用Nanodrop2000超微量可见分光光度计检测其浓度和纯度。
1.4 细胞培养和转染人肾上皮细胞系(293T)和人恶性黑色素瘤细胞(A375) 用含有10%小牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。正式转染前1 d,将细胞按2×105个·孔-1接种于24孔板内,待细胞贴壁生长覆盖率至70%~80%时,分别将重组报告基因质粒pGL3-Baisc-X(293T:0.98 μg;A375:0.9 μg)、内参质粒pRL-TK(293T:0.02 μg;A375:0.1 μg)和lip2000脂质体2.0 μL加入至50 μL Opti-MEM培养基中得到质粒-脂质体混合物,然后转染到细胞,培养48 h后收集细胞。试验重复3次及以上,每次3个平行。
1.5 双荧光素酶活性鉴定根据双荧光素酶检测试剂盒(Promega公司)说明书操作步骤对预测启动子片段进行检测,用DPBS洗细胞2次,每孔加入500 μL细胞裂解液,振荡30 min至细胞完全裂解,向每个1.5 mL离心管中添加10 μL刚裂解好的细胞待测样品和20 μL LAR Ⅱ试剂,通过发光仪检测pGL3质粒中萤火虫荧光素酶活性,检测10 s时的化学发光值,读值为F,向该管中加入20 μL Stop & Glo试剂,混匀后检测pRL-TK质粒中海肾荧光素酶活性,同样检测10 s时的化学发光值,读值为R。启动子的相对活性=F/R=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。
1.6 统计分析所有数据的有效性是通过每组试验至少重复3次以上进行验证,并通过“平均值±标准差”来表示,利用SPSS 22.0软件预测山羊PMEL基因启动子片段活性,进行统计分析。*表示P<0.05,**表示P<0.01。
2 结果 2.1 山羊PMEL基因5′端序列的生物信息学分析将克隆得到的山羊PMEL基因989 bp(-913/+76) 候选启动子序列与EPD数据库公布的人PMEL基因启动子(-999/+100) 区域在NCBI中进行BLAST比对,如图 1所示,山羊PMEL基因-980/-91区域序列与人PMEL基因-851/+45比对上,提示人和山羊PMEL基因启动子区同源性较高。通过FirstEF软件对-913/+76候选启动子区域进行预测,如表 3所示,位于正义链上有一个预测的启动子和第一外显子,预测的启动子区位于-813/-247,第一个外显子位于-316/-249,提示该区段可能符合FirstEF认可的第一外显子的特点。如图 2所示,MethPrimer程序预测出989 bp(-913/+76) 存在2个CpG岛,分别为-522/-314(209 bp)和-311/-13(299 bp),CpG岛有利于启动子位置的明确,同时结合EPD数据库和预测软件结果,提示-913/+76为参考的候选启动子区。
以构建的重组质粒989 bp(-913 bp/+76 bp)为模板,利用不同的引物对山羊PMEL基因候选启动子区域5′端上游序列进行缺失片段的扩增,分别扩增出不同长度的片段989 bp(-913 bp/+76 bp)、911 bp(-835 bp/+76 bp)、651 bp(-575 bp/+76 bp)、327 bp(-251 bp/+76 bp)、275 bp(-199 bp/+76 bp)、181 bp(-105 bp/+76 bp)和138 bp(-62 bp/+76 bp),1%琼脂糖凝胶电泳检测。如图 3所示,扩增的山羊PMEL基因启动子不同缺失片段与预期片段大小一致。将扩增得到的不同缺失片段连接到pMD-19载体上。
对构建的不同大小山羊PMEL基因启动子重组载体和pGL3-basic进行双酶切,切胶回收各PMEL基因启动子片段并与酶切后的pGL3-basic连接。如图 4所示,每个片段构建的荧光素酶报告基因的电泳条带单一、明亮清晰,可用于后续的转染试验。
将构建的不同长度的启动子荧光素酶表达载体转染到A375细胞,对报告基因进行双荧光素酶活性检测,如图 5所示,试验结果显示除报告基因138(P=0.978) 之外,所构建的其他6个不同长度的启动子片段的活性与pGL3-basic对照组相比较均差异极显著(P<0.01)。通过比较6个不同长度的启动子片段的活性值,发现报告基因327区域的活性值最高,其次分别是报告基因275、651、911、989、181,除275与327活性无显著差异,其余片段与327相比,均呈极显著差异(P<0.01)。与此同时,将构建的不同长度的启动子荧光素酶表达载体转染到293T细胞并检测双荧光素酶活性,结果显示,不同长度启动子的双荧光素酶的活性均低于A375细胞的活性;报告基因327的活性值在6个不同长度的启动子片段中最高,且-251/+76区域在两种细胞间的活性均最高,使PMEL基因的启动表达作用最强,表明该区域为山羊PMEL基因的核心启动子区域;但在两种细胞中,-62/+76区域无活性,提示-251/-62区域可能存在重要的调控元件对山羊PMEL基因启动子进行调控。
如表 4所示,对核心启动子(-251/+76) 区域的转录因子结合位点进行预测,综合多个预测软件和数据库的分析结果,提示在-206/-197位置存在NF-1结合位点,在-186/-174、-151/-139和-82 /-71位置存在Sp1结合位点,在-91/-82位置存在CREB结合位点。
如图 6和图 7所示,以pGL3-basic-327(-251/+76) 为野生型构建5个转录因子结合位点的突变体(图 8),转染至A375和293T细胞。如图 9所示,构建的5个突变启动子活性与野生型327(-251/+76) 相比较均差异极显著(P<0.01),启动子活性分别降低了3.33、1.61、2.01、1.87、2.36倍。表明上述5个区域对山羊PMEL基因转录活性起正调控作用。
羊毛是人类从事纺织最早使用的天然纤维之一,而山羊绒作为一种十分珍贵的动物纤维,因产量稀少及其优良的品质和特性,被认为是“纤维宝石”和“纤维皇后”,在交易中以克论价,又有“软黄金”之称。羊毛和羊绒是整个养羊业体系的重要产品之一,而颜色是其重要的品质特征,也是山羊绒/毛/羔皮及裘皮的重要质量性状[14]。动物毛色的形成过程较为复杂,主要由遗传来调控。MC1R、Agouti、TYR、CBD103、PMEL基因和KIT原癌基因等基因为调控毛皮动物毛色的主要候选基因[4]。本研究提取太行黑山羊基因组DNA,通过生物信息学方法预测山羊5′端序列,以太行黑山羊基因组DNA为模板构建PMEL基因不同缺失长度的启动子荧光素酶表达载体,同时转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测体系对山羊PMEL基因启动子活性进行检测,每个表达载体均为3个平行进行转染,并至少重复3次及以上。
本研究成功构建了7个不同缺失长度的山羊PMEL基因启动子荧光素酶表达载体,活性检测结果表明6个片段均有明显的启动子活性。有研究表明,克隆片段仅含TSS上游的区域在很多情况下都会导致假阴性的结果,若选取包含TSS、ATG及部分CDS区会使阳性率大大提高[15],本研究构建的7个片段均符合上述要求。由于不同物种相同基因的启动子区域保守性较高,将克隆出的山羊PMEL基因启动子最长区域-913/+76与EPD数据库公布的人PMEL基因的启动子比对,提示在-980/-91区域同源性较高。利用生物信息学方法预测的结果也表明-913/+76附近区域可作为候选启动子区域。山羊PMEL基因候选启动子区(-493/-480) 与人PMEL基因启动子区(-428/-415) 都存在一个CCAAT-box结构(AGAGGCCACTCACG),CCAAT-box主要调控转录起始频率,为核心启动子区的明确提供了更进一步的依据。双荧光素酶活性结果表明-251/+76为核心启动子区,与预测结果基本一致。
本研究构建的7个缺失报告基因载体中327(-251/+76) 活性最高,当从-251 bp缺失到-62 bp后,山羊PMEL基因启动子无活性,提示-251/-62区域可能存在重要的调控元件对山羊PMEL基因启动子进行调控。利用多个转录因子结合位点在线软件及转录因子数据库对-251 /-62区域进行转录因子结合位点预测,提示可能存在NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82) 和Sp1(-82/-71) 结合位点。细胞核因子(NF-1) 是一种具有组织特异性表达的重要转录因子,能特异结合启动子区域中的GC-box,激活增殖、凋亡和分化等有关基因转录[16-17]。山羊PMEL基因启动子区存在2个CpG岛,G/C碱基的使用明显高于A/T碱基,这可能有利于NF-1的结合,活性检测结果也提示NF-1结合位点突变后,转录活性下降幅度最大。特异性蛋白1(Sp1) 是一种广泛存在于转录激活结构域中的反式激活子,已被证实能介导有活性的转录起始复合物的合成来影响转录起始[18]。余瑞元等[19]研究发现,在Sp1过表达细胞中,MRP3、MRP4在mRNA和蛋白水平均增高,但Sp1表达缺失会使两者表达明显下降。cAMP应答元件结合蛋白(CREB)是一种真核生物细胞核内蛋白质,对基因转录进行调节,其与CRE结合能使CRE下游基因转录活性大大提高,有些基因的转录水平能提高20倍[20]。S.Noguchi等[21]研究发现, 在人和犬的黑色素瘤细胞中,CREB呈现高表达,当CREB表达下降时,细胞的生长受到显著抑制。Y.Q.Zhang等[22]研究发现, miR-373的启动子区包含CREB结合位点,且miR-373是CREB的靶基因。X.C.Tan等[23]研究发现,在神经胶质瘤组织和细胞中,CREB也呈现高表达,当CREB表达下降时,细胞的存活和生长都显著降低。-251/-62区域的缺失使山羊PMEL基因启动子活性从最高到消失,可推断上述预测的转录因子为该基因的正调控元件。接下来可对上述转录因子结合位点进行染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,CHIP)、DNA足纹分析(DNase Ⅰ footprinting)和凝胶阻滞分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)等试验验证其具体功能。
4 结论本研究构建了山羊PMEL基因不同缺失长度的启动子荧光素酶表达载体,转染到人恶性黑色素瘤细胞(A375) 和人肾上皮细胞系(293T)中,并对其活性进行分析,-913/+76区域存在转录活性,其中-251/+76为山羊PMEL基因的核心启动子区域;通过生物信息学方法分析和点突变技术进行进行验证发现NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-150/-139)、CREB(-91/-82) 和Sp1(-82/-71) 为山羊PMEL基因转录的正调控元件。
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