, 李欣1, 宁官保1, 张鼎1, AliRaza Jahejo1, 李宏全1, 马海利1, 郝卫芳2, 高文伟1, 赵宇军1, 高诗敏1, 李桂兰1, 李建慧1, 闫芳1, 高荣琨1, 田文霞1
2. 太原市动物疫病预防控制中心, 太原 030024
, LI Xin1, NING Guan-bao1, ZHANG Ding1, Ali Raza Jahejo1, LI Hong-quan1, MA Hai-li1, HAO Wei-fang2, GAO Wen-wei1, ZHAO Yu-jun1, GAO Shi-min1, LI Gui-lan1, LI Jian-hui1, YAN Fang1, GAO Rong-kun1, TIAN Wen-xia1
2. Taiyuan Center for Disease Control and Prevention, Taiyuan 030024, China
肉鸡胫骨软骨发育不良(tibial dyschondroplasia，TD)是肉鸡常发的一种骨骼性疾病，使家禽生长板不能经历成骨转变，最终在胫骨近端形成一个增厚的、无血管的软骨栓[1-2]。目前对TD机制研究主要集中在TD中晚期营养代谢、细胞分化、血管生成等方面，但TD是否导致肉鸡生长板软骨细胞凋亡及可能的作用机制尚无相关的报道。线粒体凋亡通路是引起细胞凋亡的重要途径，其促凋亡过程受Bcl-2家族抗凋亡与促凋亡成员的相互调控[3]。项目组前期用基因芯片技术筛选出了TD肉鸡软骨细胞中与凋亡相关的差异性表达基因[4-5]。为了进一步研究TD肉鸡病变区软骨细胞凋亡情况和机制，笔者利用饲喂福美双建立肉鸡TD模型，采用HE染色和TUNEL法分别对肉鸡软骨细胞的形态学损伤和凋亡分布进行观察，同时采用Real-time PCR和免疫组织化学技术分别对软骨细胞中凋亡相关基因Bax、Caspase-3和BAG-1的mRNA转录水平及Bax的蛋白表达水平进行分析，以探明TD肉鸡软骨细胞凋亡的机制，为肉鸡TD的发病和预防提供有力的依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及分组1日龄健康AA(艾维茵)肉仔鸡80羽，购自山西省文水县大象农牧集团有限公司。基础日粮预饲1周后，随机分为对照组和处理组，每组40羽，试验组于8日龄和9日龄饲喂添加100 mg·kg-1福美双的日粮，之后恢复基础日粮饲喂。
1.2 试验试剂福美双(JL131223002)购自美国Amresco公司；Trizol(AA909-1)购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司；反转录试剂盒(AK3020)购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司；细胞凋亡检测试剂盒(MK1020)购自武汉博士德生物工程有限公司；SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ(AK6003)试剂盒购自TaKaRa大连宝生物工程有限公司；DAB(AR1022)购自武汉博士德生物工程有限公司；Bax抗体(BS1031，兔抗人、大鼠、小鼠)购自Bioworld公司。
1.3 试验方法 1.3.1 动物处理参照文献[6]进行。
1.3.2 组织切片制作及HE染色 1.3.3 细胞凋亡检测(TUNEL)将经4%多聚甲醛溶液固定的组织用10% EDTA脱钙，石蜡包埋后进行切片，切片厚度为4 μm。切片脱蜡至水，用3%的H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min，蒸馏水洗涤5 min×3次。将切片用0.01 mol·L-1 TBS (pH7.5)稀释的ProteinaseK(1:200)37 ℃消化3 min；随后用TBS洗涤切片5 min×3次。阳性切片滴加20 μL阳性标记缓冲液，对照组切片用20 μL阴性标记缓冲液替代，置于湿盒内37 ℃反应2 h。TBS洗涤切片5 min×4次，滴加封闭液50 μL，置于湿盒内37 ℃封闭30 min。甩掉封闭液后不进行清洗，滴加50 μL的抗体稀释液(1 mL抗体稀释液中加入10 μL生物素化抗地高辛抗体)，置于湿盒内37 ℃反应30 min。TBS洗涤切片5 min×4次，用抗体稀释液稀释SABC(1:100)，混匀后每张切片滴加50 μL，置于湿盒内37 ℃反应30 min。TBS洗涤切片5 min×4次，DAB室温显色5~10 min，水洗后用苏木素轻度复染2 min。对切片进行盐酸酒精分化(70 s)、氨水返蓝(30 s)、梯度酒精脱水和二甲苯透明后用中性树胶封片，置于显微镜下观察。
1.3.4 生长板RNA提取及质量检测分别取两组肉鸡生长板样品，利用Trizol改进法提取总RNA，对提取的RNA分别用琼脂糖凝胶电泳和核酸测定仪进行质量和浓度检测。检测合格后对剩余RNA进行反转录，用于后续Real-time PCR试验。
1.3.5 Bax、Caspase-3和BAG-1的引物设计与合成根据前期基因芯片分析结果，试验对与细胞凋亡相关的差异表达基因Bax、Caspase-3和BAG-1进行Real-time PCR检测。试验根据目的基因mRNA序列设计PCR引物，交由上海捷瑞公司合成(表 1)。
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表 1 引物序列和Real-time PCR扩增条件 Table 1 Sequence of primers and condition of Real-time PCR amplification |
按照SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒要求进行Real-time PCR，反应体系10 μL，其中SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)5 μL，上、下游引物各0.15 μL，ROX Refe-rence Dye Ⅱ(50×)0.1 μL，cDNA模板0.6 μL，加去离子水补足10 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，40个循环，样本重复4次。
1.3.7 数据分析利用18S rRNA作为内参基因，使用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量，并利用SPSS Statistics 17.0统计分析软件进行差异显著性分析。P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
1.3.8 免疫组化染色由武汉谷歌生物公司完成。
2 结果 2.1 TD肉鸡生长板组织病理学变化与对照组相比，处理组肉鸡胫骨生长板在诱发第1、2、4和6天均出现明显的病理学损伤，且随着时间的推移严重程度不断增加。TUNEL法染色分析发现增殖区、前肥大区和肥大区软骨细胞在不同时间凋亡情况不同。试验第1天，生长板增殖区细胞凌乱、变圆，厚度增加，前肥大区夹杂有少许增殖区细胞，肥大区加长，软骨细胞核固缩，细胞质减少，出现空的软骨囊，增殖区和前肥大区软骨细胞凋亡较少，肥大区出现凋亡细胞，细胞核呈棕色染，核皱缩，体积变小，形成凋亡体，染色质聚集在核膜边缘呈新月状(图 1)；试验第2天，增殖区变薄，与前肥大区细胞界限不明显，细胞排列错乱，肥大区较第1天稍严重，增殖区、前肥大区和肥大区软骨细胞凋亡情况与第1天相似(图 2)；试验第4天，增殖区变薄，细胞形态发生改变，前肥大区增厚，肥大区加长，三个相邻区域的细胞互相掺杂，肥大区空软骨囊增多，血管减少，增殖区无可见凋亡细胞，凋亡软骨细胞大都集中在前肥大区和肥大区，且较第2天凋亡细胞数量增多(图 3)；试验第6天，增殖区、前肥大区加长，细胞凌乱、互相掺杂，肥大区极厚，核固缩、细胞质减少，血管坏死或无血管，增殖区和前肥大区无凋亡细胞，肥大区出现大量凋亡细胞(图 4)。
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C.对照组；T.处理组；P.增殖区；PH.前肥大区；H.肥大区；棕色颗粒(在黑白图中以箭头标出)为TUNEL法检测的凋亡细胞。下图同 C. Control group; T. Treated group; P. Proliferative zone; PH. Prehypertrophic zone; H. Hypertrophic zone. The brown particles(represented by arrows in the diagrams, because the pictures are black and white) were detected apoptotic by TUNEL technology. The same as below 图 1 第1天TD肉鸡胫骨生长板HE和TUNEL染色(376×) Figure 1 Broiler tibial growth plate stained with HE and TUNEL on day 1 (376×) |
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图 2 第2天TD肉鸡胫骨生长板HE和TUNEL染色(362×) Figure 2 Broiler tibial growth plate stained with HE and TUNEL on day 2 (362×) |
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图 3 第4天TD肉鸡胫骨生长板HE和TUNEL染色(377×) Figure 3 Broiler tibial growth plate stained with HE and TUNEL on day 4 (377×) |
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图 4 第6天TD肉鸡胫骨生长板HE和TUNEL染色(376×) Figure 4 Broiler tibial growth plate stained with HE and TUNEL on day 6 (376×) |
对凋亡相关基因Bax、Caspase-3和BAG-1的转录水平进行分析，结果发现，与对照组比较，处理组在试验第1、2、4和6天时，肉鸡软骨细胞Bax基因转录量均有所上调，差异极显著(P＜0.01)。Caspase-3基因在试验第1、2和4天转录水平均极显著增加(P＜0.01)，而在第6天出现转录下调(P＜0.01)。与Bax和Caspase-3变化趋势不同，抗凋亡基因BAG-1在试验第1和2天表达量降低，与对照组比较差异极显著(P＜0.01)，而在第4天转录量出现显著增加(P＜0.05)，第6天表达量极显著增加(P＜0.01)(图 5)。
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C.对照组；T.处理组；*.P＜0.05，**.P＜0.01 C. Control group; T. Treated group; *.P < 0.05, **.P < 0.01 图 5 TD肉鸡软骨细胞中Bax、Caspase-3和BAG-1的转录变化 Figure 5 Transcription changes of Bax, Caspase-3 and BAG-1 in chondrocyte of TD broiler |
对试验第1、2、4和6天正常组和处理组肉鸡生长板Bax免疫组化结果分析得出，Bax在对照组和处理组肉鸡胫骨生长板增殖区和前肥大区均无表达，而在肥大区表达，主要定位于细胞质中。Bax在对照组和处理组肉鸡生长板的表达有差异，第1和4天处理组表达量明显高于对照组(图 6)。
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图 6 Bax在第1、2、4和6天对照组和处理组肉鸡生长板的表达变化(287×) Figure 6 Expression changes of Bax in control and treated group growth plates on day 1, 2, 4 and 6 of the experimental period (287×) |
田文霞等用福美双诱导TD后，增殖区软骨细胞大量增殖，细胞分化异常，导致细胞死亡，软骨钙化受阻，血管坏死[7-8]。N. C. Rath等采用TUNEL法研究表明，早在10日龄TD症状不明显时，福美双导致生长板的毛细血管内皮细胞发生凋亡，随后几天，毛细血管内皮细胞死亡增加，并伴随着生长板过渡区软骨细胞的大量死亡[9]。本试验诱发第1、2、4和6天对照组与处理组TUNEL结果显示，肉鸡胫骨生长板软骨细胞凋亡在增殖区、前肥大区和肥大区均有发生，尤以处理组肥大区软骨细胞凋亡较多。异常软骨细胞不能全部分化成肥大区的软骨细胞，出现空的软骨囊，以及核固缩的凋亡软骨细胞。
Bax是Bcl-2家族中典型的促凋亡基因，主要分布于细胞质中[10]，当接受凋亡信号刺激后，从细胞质转移到线粒体膜上形成PT孔道，破坏线粒体膜的完整性，与Bcl-2形成异二聚体，或自身形成同源二聚体来抑制或促进Cyt-C的释放，从而调控细胞凋亡的发生[11-12]。Bax的过表达不仅可诱导软骨细胞通过线粒体途径发生凋亡，也可促进多种因素诱导的多种细胞发生凋亡。本试验Bax mRNA的转录量在第1、2、4和6天均上调，表明TD肉鸡胫骨生长板软骨细胞受Bax的调控进入线粒体凋亡途径，将进一步激活下游凋亡蛋白酶的级联反应，最终软骨细胞将发生凋亡。免疫组化结果表明Bax在对照组和处理组肉鸡生长板的表达有差异，第1和4天处理组表达量明显高于对照组，与荧光定量结果一致。
Caspase-3又称为死亡蛋白酶，是有序级联反应下游关键的凋亡执行者之一。Caspase-3通常以酶原形式存在，被激活后细胞则进入不可逆的凋亡阶段，它的激活主要则依赖于Cyt-C的释放[13]。Bcl-2、Bax蛋白位于线粒体上游，通过调控线粒体膜的通透性来改变Cyt-C等物质的释放[14]，在dATP存在的条件下，Cyt-C与Apaf-1结合形成多聚体，并招募procaspase-9在其上寡聚[15]，形成凋亡体，进而激活凋亡执行者Caspase-3，启动Caspase级联反应[16]，引起细胞发生凋亡。本试验结果显示，Bax与Caspase-3的转录量显著上调且呈正相关，进一步证明肉鸡发生TD后软骨细胞中Bax过表达，进而诱导Caspase-3前体的激活，Caspase-3执行凋亡作用，使软骨细胞发生凋亡。
BAG-1(Bcl-2-associated athanogene 1)是由S. Takayama等于1995年首次发现，是一种具有抗凋亡特性，但又不同于Bcl-2家族成员的抗凋亡基因[17]，可与Bcl-2一起协同抑制细胞的凋亡[18]。BAG-1主要是通过结构功能域与Bcl-2结合形成复合物增强Bcl-2的抗凋亡作用，从而延长细胞DNA受损后的生存期，导致肿瘤的发生[19]。而BAG-1在正常的组织中一般不表达或微表达[20]。在肉鸡TD中，试验第1和2天BAG-1的表达量极显著下调使抗凋亡作用丧失，以及Bax和Caspse-3的转录上调，进一步促使软骨细胞凋亡趋势增加，致使肥大区软骨细胞不能正常钙化，血管入侵受阻，进而影响了前肥大区软骨细胞的有序分化形成软骨栓。本研究将为探明TD的发病机制提供科学依据。
4 结论肉鸡TD的发生可以引起病变区软骨细胞，尤其是肥大区软骨细胞凋亡程度的增加。TD肉鸡软骨细胞的凋亡有可能是通过促进Bax、Caspase-3等促凋亡基因的表达增强和抑制BAG-1等抗凋亡基因表达的双重途径来实现。
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