肾是动物机体最重要的排泄器官，其正常结构对于维持机体内环境稳态具有重要的作用[1]。到目前为止，有关肾组织结构的研究主要集中于人(Homo)[2]、小鼠(Mus musculus)[3]、双峰驼(Camelus ferus)[4]、牦牛(Bos grunniens)[5-6]、大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)[7]、非洲犀牛(Diceros bicornis)[8]和兔(Leporidae)[9]等，而肾的增龄性变化研究仅限于小鼠[10]和人[11]。尚未见到系统的有关牦牛肾增龄性变化的研究资料。因此，本研究运用组织学和图像分析的方法对牦牛肾组织的各部分结构进行观察并测量分析，来阐述不同年龄段牦牛肾结构组织学变化特征，为进一步研究牦牛肾发育和生理学功能提供可靠的数据资料及形态学依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物本试验以牦牛为研究对象，分别采集新生(1~7日龄)、成年(3~6岁)及老年(7~10岁)健康牦牛肾，每个年龄段各5头份，所有牦牛经颈动脉放血处死后，迅速采集肾组织并固定于4%多聚甲醛溶液中。其中新生牦牛购自甘肃省甘南藏族自治州，其余组别牦牛购自青海省。
1.2 组织样品的制备取上述经多聚甲醛固定的肾组织，沿肾长轴剖成对称的两半，在两半组织上各随机取3个大小为0.5 cm×0.6 cm×0.7 cm组织块，常规石蜡包埋，连续切片(6 μm)，进行HE染色，Masson’ s三色(苯胺蓝)染色和AB-PAS染色，中性树胶封固。利用Olympus DP71显微照相系统进行观察并拍照。
1.3 数据测量及统计分析肾小球(G)个数：在100×下，选取10个单位视野(2.3×106 μm2)[10-11]对肾小球(G)进行计数。
皮质(C)和髓质(M)肾小管上皮细胞数：在1 000×下，选取10个单位视野(2.3×104 μm2)，采用V.K.Goyal等的方法[10-11]，对皮质(C)和髓质(M)肾小管上皮细胞进行计数。
肾小球(G)和肾小体(MC)的最大切面面积：在40×下选取50个肾小体，对每一个肾小体从出现至消失进行观察，直至临近最大面积时，选取三张在1 000×下测量肾小体和肾小球最大切面面积的平均值[12]；肾小球内细胞数和细胞核的大小参照K.M.Newbold等的方法[13]，即在1 000×下测量。
近曲小管(PCT)、近直小管(PST)、远曲小管(DCT)、远直小管(DST)上皮细胞核大小与上述肾小球内细胞数和细胞核的直径的测量方法相同。
所有数据均采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行统计，结果以平均值±标准误(x±sx)表示。运用SPSS19.0统计学软件进行单因素方差分析，其中P＜0.01代表差异极显著，P＜0.05代表差异显著，P＞0.05代表差异不显著。
2 结果 2.1 牦牛肾的组织结构观察牦牛肾表面被覆一层由胶原纤维(图 1A)组成的被膜，被膜下为实质。实质主要包括肾小体和肾小管，其中肾小体呈椭球形，从内到外分别是肾小球及肾小囊；肾小球主要由一团毛细血管网盘绕而成，肾小囊壁层富含胶原纤维(图 1B)。另外通过AB-PAS染色发现肾小体基膜上呈现PAS阳性，并且观察到肾小体基膜是不连续的(图 1C)。
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A.新生牦牛肾被膜，Masson’ s三色(苯胺蓝)染色，1 000×；B.成年牦牛肾小体，Masson’ s三色(苯胺蓝)染色，1 000×；C.成年牦牛肾小体基膜，AB-PAS染色，1 000×；D.成年牦牛皮质肾小管，Masson’ s三色(苯胺蓝)染色，1 000×；E.成年牦牛髓质肾小管，Masson’ s三色(苯胺蓝)染色，1 000×；F.成年牦牛肾小管基膜，AB-PAS染色，1 000×；Ca.被膜；MC.肾小体；G.肾小球；RC.肾小囊；PCT.近曲小管；DCT.远曲小管；PST.近直小管；DST.远直小管；CF.胶原纤维；Gly.糖原 A. Capsule of newborn yak' s kidney, Masson' s trichrome (aniline blue) stain, 1 000×; B. Malpighian corpuscle of adult yak' s kidney, Masson' s trichrome (aniline blue) stain, 1 000×; C. Basal membrane in the Malpighian corpuscle of adult yak' s kidney, AB-PAS stain, 1 000×; D. The kidney cortex of adult yak, Masson' s trichrome (aniline blue) stain, 1 000×; E. The kidney medulla of adult yak, Masson' s trichrome (aniline blue) stain, 1 000×; F. Basal membrane in the tubule of adult yak' s kidney, AB-PAS stain, 1 000×; Ca. Capsule; MC. Malpighian corpuscle; G. Glomeruli; RC. Renal capsule; PCT. Proximal convoluted tubule; DCT. Distal convoluted tubule; PST. Proximal straight tubule; DST. Distal straight tubule; CF. Collagen fiber; Gly. Glycogen 图 1 牦牛肾组织结构 Figure 1 Histological features of the yak kidney |
肾小管主要包括皮质的近曲小管和远曲小管(图 1D)以及髓质的近直小管和远直小管(图 1E)，肾小管外围富含胶原纤维(图 1D~E)。另外，肾小管上皮基膜呈现PAS阳性(图 1F)。
2.2 牦牛肾小体增龄性变化对牦牛肾小体增龄性变化的研究发现，随年龄增长，牦牛肾皮质中肾小球数量减少(图 2A~C)。肾小体随年龄增长而增大，其中新生牦牛肾小球内细胞分布密集，尤其在边缘区域，细胞排列紧密规则；而到成年和老年肾小球内细胞之间间隙增大，细胞排列疏松，并且边缘区域细胞数量减少(图 2D~F)。
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A~C.新生、成年及老年牦牛肾皮质，HE染色，100×；D~F.新生、成年及老年牦牛肾小体，HE染色，1 000×；G.肾小球；RC.肾小囊；MC.肾小体；MD.致密斑 A-C. The kidney cortex from newborn, adult and old yaks respectively, HE stain, 100×; D-F. Malpighian corpuscle from newborn, adult and old yaks respectively, HE stain, 1 000×; G. Glomeruli; RC. Renal capsule; MC. Malpighian corpuscle; MD. Macular densa 图 2 不同年龄牦牛肾小体组织结构特点 Figure 2 General histological features of yak malpighian corpuscle at different age groups |
经测量，单位视野(2.3×106 μm2)内新生牦牛肾小球数为(41.61±1.76)个，肾小球内细胞数为(78.82±1.55)个，肾小球细胞核直径为(4.56±0.04)μm；成年牦牛肾小球数为(13.45±0.67)个，肾小球内细胞数为(124.72±4.03)个，肾小球细胞核直径为(4.88±0.05)μm；老年牦牛肾小球数为(11.36±0.32)个，肾小球内细胞数为(126.07±1.63)个，肾小球细胞核直径为(5.17±0.07)μm。新生牦牛的肾小球数量极显著高于成年和老年(P＜0.01)，而肾小球内细胞数量极显著低于成年和老年(P＜0.01)，肾小球细胞核的直径极显著低于成年和老年(P＜0.01)(表 1)。此外，由表 1还可以看出，肾小球及肾小体的最大切面面积随年龄的增长，呈先增大后减小的趋势，其中新生牦牛最小，成年牦牛最大，而老年牦牛肾小球及肾小体最大切面面积介于新生牦牛和成年牦牛之间。另外，差异性分析结果显示，新生牦牛肾小球最大切面面积极显著低于成年及老年牦牛(P＜0.01)；而肾小体最大切面面积各年龄组差异极显著(P＜0.01)。
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表 1 不同年龄牦牛肾的肾小体相关测量数据 Table 1 The related measurement data of MC in the kidney at different age yak |
牦牛各年龄组肾小管结构的研究如图 3A~F所示，结果发现相比成年(图 3B、E)和老年(图 3C、F)牦牛的肾小管，新生牦牛肾小管结构还未发育完全，近端小管(图 3A)管壁不明显，而远端小管(图 3D)较为明显。同时，通过测量单位视野(2.3×104 μm2)中新生牦牛、成年牦牛及老年牦牛肾皮质和髓质中肾小管上皮细胞数(表 2)发现，新生牦牛肾脏皮质和髓质中肾小管上皮细胞数最多，其次是成年，老年最少；另外，牦牛肾皮质和髓质中肾小管上皮细胞数差异性分析显示，各年龄组之间差异极显著。
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A~C.新生、成年及老年牦牛肾皮质，HE染色，1 000×；D~F.新生、成年及老年牦牛肾髓质，HE染色，1 000×；PCT.近曲小管；DCT.远曲小管；PST.近直小管；DST.远直小管 A-C. The kidney cortex of newborn, adult and old yaks, HE stain, 1 000×; D-F. The kidney medulla of newborn, adult and old yaks, HE stain, 1 000×; PCT. Proximal convoluted tubule; DCT. Distal convoluted tubule; PST. Proximal straight tubule; DST. Distal straight tubule 图 3 不同年龄牦牛肾的肾小管上皮组织结构特点 Figure 3 General histological features of yak tubule epithelial cells in the kidney at different age groups |
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表 2 不同年龄牦牛肾的肾小管相关测量数据 Table 2 The related measurement data of tubules in the kidney at different age yak |
另外，对牦牛肾近端小管和远端小管上皮细胞核的直径进行了测量，结果显示，近端小管上皮细胞核的直径随年龄增长而增大，其中近曲小管和近直小管上皮细胞核的直径在各年龄组中差异均极显著(P＜0.01)；远端小管上皮细胞核的直径，随年龄增长先增大后减小，其中成年远曲小管上皮细胞核的直径极显著高于新生及成年牦牛(P＜0.01)；新生牦牛远直小管上皮细胞核的直径极显著低于成年及老年牦牛(P＜0.01)(表 2)。
3 讨论赵善廷等[5]和莫重存等[6]分别对牦牛肾的解剖形态结构、肾小体和肾小管的直径进行了描述，但并未对不同年龄牦牛肾进行测量比较。本研究首次对不同年龄牦牛肾内肾小球的数量、肾小球和肾小体最大切面面积、肾小球内细胞数和细胞核直径进行了研究。结果发现，随年龄增长，单位视野内牦牛肾的肾小球数量减少，这与G. Pannarale等[14]和A. Denic等[15]对人肾的研究结果一致，该结果表明随着年龄的增长，肾小球逐渐发生硬化，从而导致肾小球数量减少。同时，V. K. Goyal[11]对鼠肾小球和肾小体的研究发现，随年龄的增长，肾小球及肾小体的直径增大；另外，J. R. Nyengaard等[16]和E. M. Darmady等[17]研究发现人的肾小球体积随年龄增长而下降；H. Tauchi等[18]对日本人肾小球大小的研究发现，肾小球直径随着年龄增长而减小；而本研究结果发现，牦牛肾小球和肾小体最大切面面积随年龄先增大后减小，该结果与上述学者研究结果不一致，推测可能与物种差异等因素有关[17]。此外，本试验还测量了牦牛肾小球内细胞数和细胞核的直径，发现随年龄增长，肾小球内细胞数逐渐增多，细胞核逐渐增大，这与V. K. Goyal等在鼠[10]和人[11]上的研究结果完全一致，表明可能是由于随年龄的增长，实质性细胞减少，从而导致肾小球内其余细胞出现代偿性肥大[17]。
H. Tauchi等[18]对人肾小管上皮细胞数进行测量发现，老年人肾小管上皮细胞的数量相比其他年龄有所减少；V. K. Goyal等[10]对小鼠肾的研究结果表明，随年龄增长肾小管上皮细胞的数量逐渐减少。本研究分别测量了肾皮质与髓质中的肾小管上皮细胞数，发现这两个区域的肾小管上皮细胞数都随年龄增长而减少，这一结果与H. Tauchi等[18]对人肾小管上皮细胞数及V. K. Goyal等[10]对小鼠肾的研究结果一致，说明肾小管上皮细胞数的变化与年龄相关的实质性细胞数量减少有关，而与其在肾中的分布位置无关。另外，本研究还测量了牦牛肾近端小管及远端小管上皮细胞核的直径，结果发现近端小管上皮细胞核的直径随年龄变化逐步增大，而远端小管上皮细胞核直径随年龄变化先增大后减小，这与V. K. Goyal[11]在人肾皮质近端小管上皮细胞核直径的研究结果类似。目前，对远端小管上皮细胞核的变化鲜有报道，仅蔡广研等[19]对人肾小管研究发现随年龄增长，远端小管开始退化，其细胞核出现收缩现象。通过大量查阅文献，我们推测出现这种现象可能是由于近端小管与远端小管在肾中所发挥的功能不同[20-22]。
Masson’ s三色(苯胺蓝)染色、PAS染色常用于确定肾的病理变化[23-24]。X. L. Wang等[25]和R. Schmitt等[26]通过对人和C57BL/6J小鼠肾进行Masson’ s三色及PAS染色，来评估肾的纤维化程度和病变程度。本研究通过对牦牛肾进行Masson’ s三色(苯胺蓝)染色发现，蓝色的胶原纤维主要分布在肾被膜、肾小囊壁层及肾小管外围，而其在肾间质内的含量较少。另外，通过AB-PAS染色发现，牦牛肾小体及肾小管基膜上呈PAS阳性，肾小体基膜不连续，这可能与其滤过功能相关。本研究通过对牦牛正常肾组织结构的Masson’ s三色(苯胺蓝)染色和AB-PAS染色，可以为病理状况下肾组织的结构变化提供参考。
4 结论首次对不同年龄组牦牛肾组织结构进行了观察和测量。牦牛肾组织结构与其他哺乳动物相似。单位视野(2.3×106 μm2)内肾小球数随年龄增长而减少，肾小球和肾小体最大切面面积随年龄增长先增大后减小。单位视野(2.3×104 μm2)内皮质与髓质肾小管上皮细胞数随年龄增长而减少。说明肾的组织结构变化与年龄相关，这种变化的原因可能与肾中，肾小球发生硬化，实质性细胞减少有关，其具体机制还有待进一步研究。
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