2. 内蒙古农业大学兽医学院, 呼和浩特 010018
2. College of Veterinary, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
能量调控对动物维持基本的生命活动至关重要，在雌性动物发育过程中雌二醇可通过介导α型雌二醇受体(estrogen receptor α)发挥生理功能[1-2]，且雌二醇基因敲除鼠均在一定程度上出现了体重上升、脂肪增加、葡萄糖代谢不平衡等异常生理现象[3]，及产热量减少等症状[4]。Ghrelin是一种28氨基酸多肽，可通过循环系统作用于下丘脑弓状核(arcuate nucleus, ARC)区域发挥相应的采食调控功能[5-6]，那么ghrelin同血清中雌二醇水平或分布于下丘脑区域的α型雌二醇受体之间具有潜在调控作用则成为了可能。随着脑部研究发展，ERα神经元亚群在小鼠下丘脑ARC区域和下丘脑腹内侧核(ventromedial hypothalamus, VMH)区域的分布被阐明[7-8]，其在采食方面具有的中枢能量调控作用被揭示[9]。前人通过原位杂交技术证明ghrelin特异性受体(gonadotophin-releasing hormone，GnRH)广泛分布于小鼠下丘脑[10]，并在GnRH神经元内参与G偶联蛋白活性的调控，最终影响机体能量代谢[11]。与此同时，在小鼠性周期变化中，随着血清中雌二醇浓度的上升，采食量逐步下降[12-13]。雌二醇对雌性小鼠采食和体重变化的影响在发情前期较为显著，而在间情期和发情后期无显著性变化[2, 14]。目前有研究指出，ghrelin参与小鼠性周期变化过程中血清雌二醇激素水平的调控[15]；且ghrelin对于采食过程中食欲的调控具有短效性(120 min内作用效果显著)[16]。该调控发生在性周期的哪个时期？在该时期ghrelin对采食活动有着怎样的影响？需要进一步进行研究。对此，拟利用免疫荧光技术，对ghrelin注射后ARC区域c-Fos神经元的活动进行评估[17]，同时对ghrelin和ERα神经元的荧光信号的分布进行定位。利用竞争性免疫测定电化学发光检测，对ghrelin同循环系统中雌二醇水平之间的关系提供证据。最终结合小鼠采食量的变化，从宏观功能的角度，对ERα神经元参与的ghrelin介导的小鼠采食调控机制进行初步的研究。
1 材料与方法 1.1 动物饲养使用的小鼠品种为C57BL/6雌性小鼠(4周，16~18 g)，购自北京维通利华公司。试验前一周每天定时进行腹腔注射生理盐水，避免药物注射应激。试验期间小鼠自由饮水和进食，并在12 h昼夜交替的环境下进行饲养，于灌注前3 h，移除小鼠的水和食物。小鼠在取材前2 h，腹腔注射药物(9:00)，ghrelin(50 μg·kg-1)，并以注射同等剂量生理盐水组作为对照。
1.2 样品获取取材依据已发表论文进行定位[16, 18]，在小鼠腹腔注射ghrelin 2 h后进行。为使小鼠脑组织能够充分固定，使用心肺灌注的方法对脑组织进行固定。小鼠在手术前使用10%水合氯醛(0.4 g·kg-1)进行麻醉。使用冷的生理盐水预灌注2 min，之后转为4%多聚甲醛(PFA，pH 7.40, 158127，Sigma)，灌注时间20 min, 速度为6 mL·min-1。小鼠灌注完毕后迅速分离组织，并浸泡在4%PFA(pH 7.40)中进行后固定，4 ℃过夜。
组织块经30%蔗糖溶液脱水，存放于4 ℃。脑组织使用SLEE冰冻切片机进行修片和切片，厚度30 μm。为使得荧光信号统计的准确性，利用小鼠脑部立体定位仪，参照《The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, second edition》所示位置进行定位、切片。
切片使用0.01 mol·L-1磷酸盐生理盐水缓冲溶液(PBS，pH 7.45)进行清洗，清洗后的组织切片放置在含有0.3%叠氮化钠的12孔板中备用。
1.3 性周期测定选取体重、健康状态相近的小鼠(n=5)，50 μL室温的生理盐水对小鼠的阴道上皮细胞进行冲洗，之后将小鼠的阴道上皮细胞滴加在防脱载玻片上，待液体自然风干后，滴加95%的乙醇固定10 min，之后使用蒸馏水进行冲洗。自然风干后向其中滴加1%龙胆紫溶液，作用10 min，冲洗干净后使用光学显微镜进行观察(奥林巴斯XSP-2C)以确定所处发情周期。
1.4 免疫荧光技术测定下丘脑荧光信号分布及表达量变化切片在1% TritonX-100中4 ℃过夜进行预处理后，0.01 mol·L-1 PBS进行清洗，10 min·次-1，共3次。3%正常驴血清封闭1 h (017-000-121, Jackson)，之后移入Rabbit anti-c-Fos (1:1 000, ab190289, Abcam)，Mice anti-ERα (1:200, ab3575, Abcam)中，4 ℃过夜孵育。漂洗方式同上，切片转入二抗Alexa Flour 647 Donkey anti-Rabbit (1:1 000, ab150075, Abcam), Alexa Flour 488 Donkey anti-Mice(1:1 000, ab150117, Abcam)中室温孵育2 h。
组织清洗完毕之后在多聚赖氨酸处理过的防脱载玻片上进行贴片，风干过夜。成像系统使用Nikon C2 plus Confocal (Japan)。在保证扫描背景参数一致的条件下，对神经元细胞表达数目进行统计。
1.5 血清中雌二醇水平测量注射药物2 h后，经眼球采血方式收集血液于不含有抗凝药物的采血管中。血凝后于3 000 r·min-1离心10 min收集上层血清，-80 ℃保存备用。雌二醇含量的测定分析使用Roche Cobas c 701仪器，并配合雌二醇Ⅱ试剂盒(Roche Diagnostics，Bromma, Sweden)进行竞争性免疫测定电化学发光检测。
1.6 采食量测定选取不同性周期18~20 g的雌性C57BL/6小鼠进行采食量的测定(n=10)。为保证数据的稳定性，采食测定之前进行12 h的饥饿处理。试验中，小鼠腹腔注射生理盐水(10倍体重，等同于其他组注射药物体积)、ghrelin(50 μg·kg-1)，之后给予小鼠定量的食物，在60、90、120 min节点测定采食量。
1.7 数据统计使用GraphPad Prism 6软件(GraphPad Software Inc, San Diego, CA)对目的神经元表达量进行统计学分析。其中数据组之间使用配对非配对t检验进行分析。数据以“x±sx”的方式进行统计，P＜0.05视为具有显著性差异。
2 结果 2.1 小鼠性周期鉴定试验前，对所有购买小鼠的性周期进行了鉴定。
染色结果显示(图 1)发情后期的小鼠阴道上皮细胞以角化鳞状上皮细胞和白细胞为主；间情期的阴道上皮细胞则存在有核上皮细胞、角化鳞状上皮细胞和白细胞。而发情前期仅存在有核上皮细胞；发情期仅含有角化鳞状上皮细胞。
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Metestrus.发情后期；Diestrus.间情期；Proestrus.发情前期；Estrus.发情期 图 1 通过阴道上皮细胞形态判定小鼠性周期 Figure 1 Staging identification of vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle |
结合前人的试验结果[19]，在保证小鼠正常生理活动的同时，选择具有稳定性周期变化的小鼠进行后续的试验。
2.2 Ghrelin促进小鼠下丘脑弓状核区域神经元活动为了研究腹腔注射ghrelin是否会引起小鼠下丘脑弓状核区域神经元活动的改变，我们利用免疫荧光技术对神经元活动的标志性蛋白c-Fos的表达进行了分析。在雌鼠各个性周期中，与生理盐水组(Saline)相比，ghrelin(50 μg·kg-1)均在一定程度上促进小鼠ARC区域神经元的表达活动。其中发情后期和间情期的促进作用显著[图 2，Metestrus: ghrelin (90.67±8.69) vs saline (43.00±7.00)，Diestrus: ghrelin (133.70±15.86) vs saline (79.67±10.74)，P＜0.05, n=3]；发情前期和发情期的促进作用极显著[Proestrus: ghrelin (145.70±14.15) vs saline (72.33±4.63), Estrus: ghrelin (94.33±4.98) vs saline (37.33±9.24)，P＜0.01, n=3]。以上免疫荧光结果和统计分析显示，腹腔注射ghrelin会在2 h内显著促进ARC区域神经元的活动。
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腹腔注射ghrelin可显著促进各个性周期中小鼠弓状核区域神经元活动的指示性信号蛋白c-Fos(红)的表达，发情后期(A，P=0.012 9)，间情期(B，P=0.047 9)，发情前期(C，P=0.007 9)，发情期(D，P=0.005 6)。*.P＜0.05; **.P＜0.01 After injected ghrelin by intraperitoneal injection, ghrelin increased c-Fos (red) expressing in all mice estrous cycle in mice ARC nucleus. Metestrus (A, P=0.012 9), Diestrus (B, P=0.047 9), Proestrus (C, P=0.007 9), Estrus (D, P=0.005 6). *.P < 0.05; **. P < 0.01 图 2 Ghrelin促进小鼠下丘脑神经元活动(n=3) Figure 2 Ghrelin enhanced neuron activation in mice ARC (n=3) |
为了研究ghrelin引起的ARC区域神经元活动是否同该区域的ERα神经元亚群相关，利用免疫共定位的方式，对性周期不同阶段ghrelin和ERα神经元荧光信号分布进行了研究。
结果显示(图 3)，ghrelin同ERα之间的共表达数目随着性周期的不同而发生变化，其中发情前期共表达率相对较高[Metestrus(73.67±3.28) vs Proestrus(169.70±8.45), P = 0.000 5; Diestrus(106.30±9.02) vs Proestrus(169.70±8.45), P=0.006 9; Estrus(138.30±7.62) vs Proestrus(169.70± 8.45) P=0.051 2]。
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A.发情后期；B.间情期；C.发情前期；D.发情期；E.神经元共表达数目。**.P＜0.01; ***.P＜0.001 A.Metestrus; B.Diestrus; C.Proestrus; D.Estrus; E.The number of co-localization neurons. **.P < 0.01; ***.P < 0.001 图 3 Ghrelin(红)可直接作用于ARC区域的α型雌二醇受体神经元亚群(绿)(n=3) Figure 3 Ghrelin (red) directly act on the subsets of ERα neurons (green) in ARC nucleus (n=3) |
因此，ghrelin在小鼠性周期的各个阶段均可以作用于ARC区域的ERα神经元，且在发情前期共表达数目较多。
2.4 Ghrelin抑制血清雌二醇浓度并促进小鼠发情期采食活动既然ghrelin能够直接作用于小鼠下丘脑ARC区域的ERα神经元，那ghrelin是否改变小鼠性周期过程中的雌二醇血清浓度？
激素测定结果(图 4A)显示，ghrelin极显著抑制小鼠发情前期雌二醇水平(P＜0.01)，并将其尽量维持在较低的水平。通过对小鼠发情前期的采食量测定(图 4B)，ghrelin在抑制血清中雌二醇水平的同时还促进小鼠采食(P＜0.05)。
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A. Ghrelin显著抑制发情期血清中雌二醇浓度(P＜0.01，n=4)；B. Ghrelin在60、90、120 min均促进发情前期小鼠采食(60 min: t=3.154, P=0.011 7; 90 min: t=2.744, P=0.022 7; 120 min: t=2.299, P=0.047 1, n=6) A. Ghrelin suppressed the concentration of estrogen in mice serum (P < 0.01, n=4); B. Ghrelin increased mice food intake in mice proestrus (60 min: t=3.154, P=0.011 7; 90 min: t=2.744, P=0.022 7; 120 min: t=2.299, P=0.047 1, n=6) 图 4 Ghrelin抑制发情前期小鼠血清中雌二醇水平，且促进采食 Figure 4 Ghrelin decreased the concentration of estrogen in serum and enhanced mice food intake in mice proestrus |
结果提示ghrelin调控小鼠发情前期的采食可能与其对循环系统中雌二醇水平的抑制相关。
3 讨论在动物的生长发育过程中，生殖系统和能量调控系统之间具有一系列调控机制，下丘脑-垂体-性腺轴则是其中的关键性调控机制[20-21]。其中，ghrelin作为一种食欲促进因子，可通过调控ARC部位神经肽Y/刺鼠相关肽(NPY/AgRP)神经元，促进与食欲相关的肽类物质释放[22-23]，继而参与下丘脑对于动物机体的能量调控；同时ghrelin也在不同程度上调控着卵巢的周期性活动[24]。
ERα神经元作为雌二醇在中枢系统中的特异性受体，也参与着下丘脑对于能量的调控过程，例如，ERα神经元活动的增强可在一定程度上抑制AgRP/NPY神经元活动；而ARC区域ERα敲除后，动物的体重出现了不同程度的上升[14, 25-26]。且ghrelin的特异性受体(GnRH)同ERα神经元共表达于下丘脑的多个区域[27]。本研究中，ghrelin可引起各个性周期中下丘脑神经元活动显著性增强(图 2A~D)，特异性地作用于下丘脑ARC区域的ERα神经元(图 3A~D)。另外，有证据表明ghrelin对于能量调控的方式主要为作用于AgRP神经元上分布的GnRH受体，而并非ERα神经元[28]。因此，我们猜测ghrelin与ERα神经元之间可能存在直接的联系，而非完全通过GnRH产生作用。
由于ARC区域缺乏血脑屏障，可对外界激素变化做出快速回应[29]，因此ghrelin抑制发情前期血清中雌二醇表达水平的变化(图 4A)，可通过循环系统被下丘脑率先感知。雌二醇水平的下降，预示着雌二醇对采食相关神经元活动的抑制作用被削弱[14]，从一定程度上促进了ghrelin的促食欲作用，而这种作用在小鼠发情前期被观察到(图 4B)。基于ghrelin在调控小鼠能量摄取的同时也对小鼠卵巢活动相关激素的分泌具有一定的调控作用[15]，且ghrelin的促食欲作用在一定程度上能够被雌二醇所抑制[30]。我们猜测这种ghrelin和雌二醇之间对能量的调控是相互的，且伴随着发情前期雌二醇水平的上升，并不在其他发情周期中有显著体现。另外，在发情前期，ERα在ARC区域的表达处于较高水平[31]，ghrelin与ERα之间的共表达率也处于较高水平(图 3E)。推测正常小鼠发情前期ARC区域ERα神经元表达量的上升，可能为ghrelin抑制血清中雌二醇水平进而解除雌二醇对采食的抑制作用提供了一定的基础。
4 结论Ghrelin在小鼠发情前期能够通过下丘脑分布的ERα特异性受体抑制发情前期小鼠血清中雌二醇的表达水平，从而解除该时期雌二醇对采食活动的抑制作用，介导小鼠发情前期采食活动。
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