当前，禽源致病性大肠杆菌在世界范围内对养禽业造成严重危害，同时菌株多重耐药情况普遍存在，导致抗生素的使用失效，因此开发抗生素替代品很有必要[1]。噬菌体是一种专性侵染细菌的病毒，在自然环境中广泛存在，有望作为抗生素替代品用于临床细菌病的防治[2]。
噬菌体根据其是否裂解细菌分为温和型噬菌体和烈性噬菌体。烈性噬菌体主要通过穿孔素-溶菌酶系统裂解细菌[3-4]。穿孔素是噬菌体在感染宿主菌后期合成的小分子量疏水性跨膜蛋白，能够在特定时间以寡聚体形式聚集于细胞膜上形成稳定的跨膜通道，造成细胞膜损伤，从而释放细胞内的溶菌酶，水解细胞壁中的肽聚糖层，引起细菌裂解，导致子代噬菌体从宿主菌内释放[5-6]。与噬菌体相比，穿孔素-溶菌酶系统不受噬菌体宿主谱的限制，对细菌具有广谱的裂解活性，具有潜在的开发价值。除此之外，穿孔素还能够控制噬菌体裂解宿主菌的时间[7]。不同噬菌体来源的穿孔素同源性很低，结构多样，成孔模式不同，其含有氨基酸数量差别很大，至今已鉴定的穿孔素分属52个家族[8]。这些穿孔素均含有1~4个跨膜区，根据其结构至少可以分为五种类型[9-10]。以λ和T7噬菌体的穿孔素为代表，已经报道的穿孔素大多含有2~3个跨膜区，而T4噬菌体的穿孔素仅含有一个跨膜区，属于Ⅲ型穿孔素[8, 11]。
笔者实验室前期分离到一株大肠杆菌噬菌体Bp7，属于肌尾噬菌体科T4类噬菌体[12]。为了检测噬菌体Bp7穿孔素holin蛋白的种类及其抑菌活性，本试验在原核系统表达holin蛋白，分析其序列特征，并测定其抑菌活性，以期为新型抗菌制剂的开发提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒与菌株噬菌体Bp7为笔者实验室分离保存(GenBank登录号：HQ829472.1)，克隆载体T购自TaKaRa公司，表达载体pCold-TF和大肠杆菌DH5α、BL21均为本实验室保存。
1.1.2 引物与主要试剂限制性内切酶购自TaKaRa公司，PCR产物回收试剂盒和T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及His-Ni蛋白纯化柱购自康为世纪有限公司。引物由上海生工公司合成，引物序列为：Holin-F 5′-CGCCATATGATGGAACCAAAAGTAG-AT-3′，Holin-R 5′-GATGGATCCTTAACGAGTTCGACCTAATG-3′，引物序列中下划线分别表示限制性酶切位点(NdeⅠ和BamHⅠ)。
1.2 方法 1.2.1 holin蛋白序列分析在NCBI数据库中，对holin氨基酸序列进行同源性比对；利用在线分析工具TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对holin蛋白进行跨膜区预测，根据同源性比对结果及跨膜区的数量判定holin蛋白的类型。与Pfam数据库(http://pfam.xfam.org)比对，确定holin蛋白所属的家族。
1.2.2 holin基因的克隆及重组表达质粒的构建以噬菌体Bp7的基因组为模板，PCR扩增holin基因。holin基因的PCR产物及pCold-TF载体分别进行NdeⅠ和BamHⅠ酶切回收，T4 DNA酶连接，构建重组表达质粒pCold-holin，进行PCR及双酶切鉴定，测序。将测序正确的表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞，获得表达holin蛋白的工程菌pCold-holin/BL21。
1.2.3 重组蛋白holin的表达及条件优化挑取单菌落接入含有100 μg·mL-1氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，备用。取50 μL新鲜菌液接入5 mL含有100 ug·mL-1氨苄青霉素的LB培养基中。分别设置不同诱导浓度的IPTG(0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1)，不同诱导时间(4、6、8、10 h)以及不同的诱导温度(16、30、37 ℃)，SDS-PAGE检测并分析各诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度对重组蛋白质表达量的影响，确定最佳诱导表达条件。
1.2.4 重组蛋白holin的SDS-PAGE及Western blot鉴定离心收集在最佳条件下诱导表达的菌体，PBS重悬后，在冰浴条件下超声破碎细胞。裂解条件：超声3 s，间歇2 s，30 min。超声后的菌液于4 ℃条件下12 000 r·min-1离心5 min，分离上清和沉淀。进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白质的表达形态。将超声裂解后的菌液上清用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化，纯化后的蛋白质进行Western blot鉴定。鼠抗His标签的单抗为一抗(稀释1:1 500)和HRP标记羊抗鼠IgG为二抗(稀释1:3 000)，DAB显色。
1.2.5 holin蛋白表达对大肠杆菌BL21生长性能的影响将生长至对数期的工程菌pCold-holin/BL21加入1.0 mmol·L-1的IPTG，同时设大肠杆菌BL21和未加IPTG诱导剂的pCold-holin/BL21对照，于37 ℃条件下振荡培养。每隔15 min，各取200 μL菌液到96孔板上，每组设3个重复，测定各孔悬液的OD600 nm值，检测holin蛋白的表达对大肠杆菌BL21生长性能的影响。于4 h时分别取样，进行革兰染色，显微镜观察菌体形态。同时每隔1 h各组取200 μL菌液，10倍比稀释后铺平板，37 ℃条件下过夜培养，进行细菌计数，检测各组在不同时间段菌液中活菌的含量。
2 结果 2.1 holin蛋白序列分析对噬菌体Bp7的holin基因、氨基酸序列进行同源性分析，发现与T4类噬菌体IME08的相似性最高，与T4噬菌体穿孔素的相似性为54%，结果见图 1。穿孔素holin是一个小分子量的跨膜蛋白，不同类型的穿孔素其跨膜区α螺旋的数量不一。用TMHMM软件对噬菌体Bp7的holin蛋白跨膜区进行预测，结果表明其N端(1~28 aa)位于胞外区，C端(49~217 aa)位于胞内区，最后10个氨基酸残基均带正电荷，存在一个α螺旋构成的跨膜区(29~48 aa)，Pfam数据库比对结果表明噬菌体Bp7的holin蛋白属于Phage-holin-T (PF11031)家族。
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图 1 holin氨基酸序列同源性分析 Figure 1 Homology analysis of holin amino acid sequence |
以噬菌体Bp7为模板，PCR扩增holin基因，测序结果表明获得正确的基因片段。将holin基因连接到pCold-TF载体，构建重组表达质粒pCold-holin，PCR及双酶切(NdeⅠ和BamHⅠ)鉴定结果见图 2。由图 2可知，在大约654 bp处出现目的条带，与预期片段大小相同。
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1. pCold-holin双酶切鉴定(NdeⅠ和BamHⅠ)；M.核酸相对分子质量标准；2. pCold-holin PCR鉴定 1. Double enzyme digestion product of pCold-holin (NdeⅠ& BamHⅠ); M. DL2000 DNA marker; 2. PCR product of pCold-holin 图 2 重组质粒pCold-holin的PCR及双酶切鉴定 Figure 2 PCR and double enzyme digestion products of recombined plasmid pCold-holin |
在E. coli BL21中IPTG诱导表达重组蛋白holin，摸索最佳的IPTG诱导浓度，诱导时间以及诱导温度，结果见图 3。由图 3可知，在1 mmol·L-1 IPTG诱导下，holin蛋白的表达量在4 h时达到最高。设不同浓度的IPTG诱导重组蛋白质表达4 h，发现holin蛋白的表达量随IPTG浓度的升高而增加，1 mmol·L-1 IPTG诱导浓度蛋白质表达量最高。分别在不同的温度条件下用1 mmol·L-1 IPTG诱导蛋白质表达4 h，当诱导温度为30 ℃时，蛋白质表达量最高。因此，30 ℃条件下，1 mmol·L-1 IPTG诱导4 h重组蛋白holin表达量最高。
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1、9、13. pCold-holin/BL21未诱导对照；2~5.依次为1 mmol·L-1 IPTG诱导4、6、8、10 h的pCold-holin/BL21菌液；6~8、10.依次为0.4、0.6、0.8、1 mmol·L-1 IPTG诱导4 h的pCold-holin/BL21菌液；11、12.依次为30、37 ℃条件下诱导的pCold-holin/BL21菌液；M.蛋白质相对分子质量标准 1, 9, 13. pCold-holin/BL21 before induced; 2-5. The total protein induced with 1 mmol·L-1 IPTG for different time (4, 6, 8 and 10 h, respectively); 6-8, 10. The total protein induced with different concentration of IPTG (0.4, 0.6, 0.8 and 1 mmol·L-1, respectively) for 4 h; 11, 12. The total protein expressed at 30 and 37 ℃; M. Protein marker 图 3 SDS-PAGE检测holin蛋白在大肠杆菌BL21中表达的最佳诱导条件 Figure 3 SDS-PAGE analysis of the best induce condition of holin protein expressed in E. coli BL21 |
对holin蛋白进行大量表达，超声后离心分离上清和沉淀，SDS-PAGE电泳检测重组蛋白质的存在形式。结果显示holin蛋白在上清和沉淀中均有表达。亲和层析法纯化上清中表达的蛋白质，SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定结果见图 4。由图 4可知，大约在76.8 ku处出现目的条带，与预期蛋白质大小一致。
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1. pCold-holin/BL21菌液裂解上清；2. pCold-holin/BL21菌液裂解沉淀；M.蛋白质相对分子质量标准；3. pCold-holin/BL21未诱导对照；4.纯化的holin蛋白；5. holin蛋白Western blot鉴定 1. The supernatant of pCold-holin/BL21; 2. The precipitation of pCold-holin/BL21; M. Protein marker; 3. pCold-holin/BL21 before induction; 4. Purified holin protein; 5. Western blot of holin protein 图 4 holin蛋白的纯化及Western blot鉴定 Figure 4 Purification and Western blot identification of holin protein |
IPTG诱导大肠杆菌pCold-holin/BL21中holin蛋白的表达，通过对表达菌E. coli BL21不同时间点的浊度测定、菌落计数检测holin蛋白的抑菌活性，并通过革兰染色观察其生长状态的变化。加入IPTG诱导后，pCold-holin/BL21菌液浊度逐渐下降，4 h左右达到最低，随后逐渐上升，与E. coli BL21及未诱导的pCold-holin/BL21对照组比较，直到8 h菌液浓度仍有明显差异(P＜0.05)(图 5)。活菌计数结果显示，IPTG诱导holin蛋白表达后，表达菌pCold-holin/BL21活菌数明显低于对照组，随着时间的延长，细菌数量缓慢增加，7 h后仍有一个数量级的差异，说明holin蛋白的表达对细菌的生长有抑制作用(图 6)。
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图 5 holin蛋白表达后pCold-holin/BL21生长性能测定 Figure 5 Growth character of pCold-holin/BL21 with expressed holin protein |
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图 6 holin蛋白表达后pCold-holin/BL21活菌数测定 Figure 6 Alived bacteria analysis of pCold-holin/BL21 with expressed holin protein |
holin蛋白诱导表达后的pCold-holin/BL21进行革兰染色，显微镜下观察细菌形态，结果见图 7。IPTG诱导holin蛋白表达后，pCold-holin/BL21出现明显的凝集现象，而未诱导的对照组菌体散在均匀分布，说明holin蛋白的表达能够影响细菌的生长状态。
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A. pCold-holin/BL21 IPTG诱导组；B. pCold-holin/BL21未诱导对照组 A. pCold-holin/BL21 induced with IPTG; B. pCold-holin/BL21 before induced with IPTG 图 7 holin蛋白表达后pCold-holin/BL21形态观察(100×) Figure 7 Morphological observation of pCold-holin/BL21 with expressed holin protein (100×) |
噬菌体及其产物作为抗生素替代品近年来备受关注，对耐药菌的防治具有潜在的应用价值[3]。但是由于大多数噬菌体特异性强，宿主谱窄，在临床上的应用受到限制[13]。穿孔素是一种小分子量的蛋白质，作为噬菌体裂解系统的成分，能够在细胞膜上形成非特异性的通道，促使胞内溶菌酶释放，进而导致细菌裂解。这种作用机制不受噬菌体宿主谱的限制，应用范围更广，有望开发成抗菌制剂应用于耐药菌的防治。
目前λ噬菌体的穿孔素裂解机制已有大量报道，而T4类噬菌体来源的穿孔素报道较少[14]。本研究对大肠杆菌噬菌体Bp7的holin蛋白进行了序列分析，发现该蛋白质分子仅有一个跨膜区，属于Phage-holin-T (PF11031)。在Pfam数据库中，与之同一家族的还有T4和T5噬菌体的holin蛋白。该家族成员仅有一个跨膜区，N端位于胞内，其C端位于胞外[15-16]。TMHMM软件预测Bp7的holin蛋白的拓扑结构发现其恰恰与T4和T5噬菌体的holin蛋白的相反，N端位于胞外，C端位于胞内。该预测结果尚需进一步试验验证，确定Bp7的holin蛋白的拓扑结构。同源性分析显示，Bp7的holin蛋白与T4噬菌体的相似性为54%，与T5噬菌体几乎无同源性。而同源性高的IME08、JS10噬菌体的穿孔素未见具体的报道。
为了研究该蛋白的抑菌活性，在前期试验中，我们尝试使用pET28a载体进行蛋白质的表达，但是表达量极低。随后我们以pCold-TF为载体实现了holin蛋白的表达，尽管重组holin蛋白携带较大的蛋白标签，但是活性测定结果显示表达的holin蛋白能够有效抑制E. coli BL21的生长，使活菌数量减少，细菌生长出现凝集现象，说明holin蛋白能够在表达菌细胞膜上形成通道，使细胞膜不完整，进而影响细菌的生长状态，这与之前报道一致[17-18]。holin蛋白表达后，对表达菌E.coli BL21进行了浊度测定，发现菌液的OD值在诱导4 h降到最低，随后菌液浓度缓慢上升。已有报道均证实穿孔素能够引起菌液浊度显著下降，但是测定时间均控制在4 h以内，未提及4 h后细菌的生长情况[19-20]。C. A. Agu等[21]报道了λ噬菌体来源的holin蛋白具有细胞毒性，能够影响肿瘤细胞膜的完整性，抑制蛋白的合成，体外试验和动物试验证实肿瘤细胞死亡率达98%。在本试验中，IPTG诱导4 h后，菌液浓度开始缓慢增加，推测与不同的穿孔素来源以及不同的作用细胞有关，对哺乳动物传代细胞的作用尚需进一步验证。
作为噬菌体裂解系统，穿孔素与溶菌酶联合应用，能起到有效的裂解细菌作用[22]。Y. B. Shi等[23]开发该系统用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的防治，发现穿孔素单独使用也能够裂解多株金黄色葡萄球菌。与革兰阴性菌比较，革兰阳性菌的细胞壁没有外膜，仅由肽聚糖层构成，更有利于穿孔素的作用，其具体作用机制尚不明确。另外，穿孔素还可以作为传递系统，将外源的药物、核酸、蛋白质导入菌内，起到杀菌的作用[5, 24]。本试验对大肠杆菌噬菌体Bp7来源的穿孔素进行了表达以及活性测定，发现其具有明显的抑菌活性，这为进一步研究穿孔素的抑菌机制及后续穿孔素的开发应用提供了理论基础。
4 结论噬菌体Bp7的holin蛋白在原核系统中实现了可溶性表达，活性测定发现其具有明显的抑菌活性。
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