大熊猫已在地球上生存了至少800万年，据我国2015年调查，野生大熊猫仅有1 864只，80%以上分布于四川境内^[1]，至2015年底全世界共圈养熊猫425只^[2]。其被誉为“活化石”和“中国国宝”，是世界生物多样性保护的旗舰物种，在我国外交上发挥重要作用^[3]。

随着部分大熊猫由于老年化等各种原因导致的身体抵抗力下降，以及广谱抗生素、糖皮质激素等药物的使用，使得大熊猫真菌性皮肤病逐年高发^[4-5]。酵母菌属于真菌，主要是因机体免疫力低下导致体表或深部组织感染，可以用克霉唑、咪康唑等抗菌药物对症治疗。由酵母菌引起的侵袭性感染是导致癌症化疗、器官移植及免疫抑制患者死亡的主要原因之一^[6]。毕赤酵母属、红酵母属、毛孢子菌属、白念珠菌等酵母菌引起感染的报道逐渐增加^[7]。近年来在大熊猫阴道分泌物中^[8]和老年死亡大熊猫褥疮和部分脏器中分离出多株酵母菌^[5], 表明大熊猫在一定条件下，特别是抵抗力降低后存在感染酵母菌的风险。

不同种属的酵母菌对抗真菌药物的敏感性不同^[9]，为了及早预防和合理用药，本试验采用丹麦Rosco真菌药敏纸片扩散法，对从大熊猫被毛分离到的酵母菌进行药敏试验研究，为大熊猫因酵母菌引起的疾病治疗提供参考。

1 材料与方法 1.1 样品采集

对中国保护大熊猫研究中心某基地的37只大熊猫体表(四肢上部、腋窝、腹股沟、耳内、头部、背部等)进行毛发采集。按参考文献^[10]方法采集适量毛发，将样本装入黑纸袋中^[10]，送实验室分离培养。

1.2 主要试剂

酵母基因组DNA提取试剂盒、溶壁酶Lyticase、Green View、D2000 Marker和2×Taq PCR Master Mix均购自北京天根生化科技有限公司；Hy Agarose^TM LE琼脂糖购自厦门太阳马生物工程有限公司；氯霉素和放线菌酮购自BIOSHARP生物科技公司；抗真菌药敏纸片：制霉菌素(NYSTA，50 μg·片^-1)、两性霉素B(AMPHO，10 μg·片^-1)、氟康唑(FLUCZ，25 μg·片^-1)、伊曲康唑(ITRAC，8 μg·片^-1)、酮康唑(KETOC，15 μg·片^-1)及改良SHADOMY琼脂培养基，均购自广州迪景微生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

霉菌培养箱(MJ-400B)，上海跃进医疗器械有限公司；荧光显微镜(BX51)，日本Olympus公司；PCR仪(DNA Engine 2000)，凝胶成像系统(GelDoc XR+)，BIO-RAD公司；电泳仪(JY600C), 北京君意东方电泳设备有限公司。

1.4 培养基

试验所用培养基主要为加抗生素沙氏葡萄糖蛋白胨培养基(SDA)，其中氯霉素质量浓度为200 mg·L^-1、放线菌酮质量浓度为250 mg·L^-1[10]。Shadomy琼脂培养基购自丹麦Rosco公司。

1.5 酵母菌的分离及纯化培养

超净工作台内，将样本按文献^[11]方法处理后分散接种到SDA培养基中25 ℃培养1~4周^[11]。每长出新的真菌菌落时，将其转接种于新的同种真菌培养基，经纯化后对其进行形态学观察。

1.6 真菌DNA的提取与PCR扩增

对纯菌株按照TIANGEN酵母基因组DNA提取试剂盒说明书操作。以提取真菌基因组DNA为模板。以ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)^[12-13]为引物(引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成)进行扩增。PCR反应体系和PCR反应条件均按参考文献^[3]进行。取5 μL PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测有无。最后将含有目的条带的PCR产物送成都擎科梓熙生物技术有限公司测序。

1.7 系统发育学分析

将测序结果通过DNAStar软件的Seqedit程序去除接头，并输入NCBI GenBank数据库进行同源性检索，获得近似序列。用Clustal X软件进行核苷酸序列多序列比对分析，通过Mega 6.0软件构建系统发育树。同时，将序列提交到NCBI，并获得登录号。

1.8 药敏试验

利用丹麦Rosco纸片扩散法，用5种抗真菌药物对12种酵母菌进行药敏试验。将待测菌株用无菌生理盐水制成菌悬液，采用麦氏比浊法，调整浓度到0.5麦氏浊度，约为5×10⁵ CFU·mL^-1，再用生理盐水1:1稀释。

吸取0.5 mL接种液倾注于Shadomy琼脂培养基表面涂抹均匀，35 ℃放置10 min后贴药敏纸片, 置于25 ℃培养18~24 h后根据判读标准判读结果^[14-15]。

1.9 动物致病性试验

取SDA培养基上25 ℃培养5 d的12种分离株菌落，用无菌生理盐水制成菌悬液浓度为1×10⁷ CFU·mL^-1。将225只体况相近的6~8周龄健康小鼠(雌雄不限)随机分为A(108只)、B(108只)、C(9只)三组。A组为免疫抑制组，B组为非免疫抑制组，饲养观察一周，临床表现无异常。C组为空白对照组。A组腹腔注射环磷酰胺(50 mg·kg^-1)和青霉素钠(15 mg·只^-1)，隔天注射一次，连续三次，然后按菌株各分为12个菌株组。A、B两组各菌株组再分别分为腹腔注射组、皮下注射组和皮肤涂擦组，每小组3只。A、B皮肤涂擦组小鼠试验前剪除背部毛发，约3 cm×2 cm。接种时消毒后，用无菌粗砂纸轻轻磨破小鼠背部皮肤至点状渗血为宜，涂布菌悬液，皮下注射组皮下注射菌悬液0.1 mL，腹腔注射组腹腔注射0.1 mL菌悬液。C组再分为皮肤涂擦组、皮下注射组和腹腔注射组，分别皮肤涂擦生理盐水，皮下注射0.1 mL生理盐水，腹腔注射0.1 mL生理盐水，每小组3只。观察试验小鼠死亡情况和接种处皮肤红斑、脱屑、结痂和毛发生长变化，观察期为7 d。

2 结果 2.1 大熊猫被毛酵母菌的分离与纯化

本次从37个大熊猫毛发样本中共分离到45株酵母型真菌，不同种酵母菌形态差异较大，部分酵母菌菌落形态与显微形态特征如图 1。

星形毛孢子菌(Trichosporon asteroids)菌落生长速度快，米白色，类酵母样，闪光，表面脑回样，背面为淡黄色(图 1-A11)。无明显菌丝，偶见假菌丝，结构复杂，芽生细胞，有侧生分生孢子，透光(图 1-A2)。

秋吉台毛孢子菌(Trichosporon akiyoshidainum)菌落生长速度快，米白色，湿润，菌落中心有泡状突起，外侧呈线性发散，背面为淡灰色(图 1-B1)。芽生细胞多，关节孢子柱状或椭圆形，侧生分生孢子(图 1-B2)。

串珠状毛孢子菌(Trichosporon moniliiforme)菌落生长快，米白色，酵母样，湿润，闪光，脑回状，边缘不整齐，背面淡黄色(图 1-C1)；无菌丝，芽生孢子，孢子圆形，厚壁，大小不一，具有染色特征(图 1-C2)。

蒙得维的亚毛孢子菌(Trichosporon montevideense)菌落生长速度快，奶酪样，干燥，闪光，边缘不整齐，有大凹陷，背面为淡黄色(图 1-D1)。有假菌丝，芽生孢子，芽颈呈领圈样结构，孢子呈长柱形、卵圆形或球形，透光(图 1-D2)。

长莓隐球酵母(Cryptococcus fragicola)菌落生长速度一般，奶酪样，圆形，脑回状，反光，表面光滑，背面为乳白色(图 1-E1)，芽生细胞多，关节孢子柱状至椭圆形(图 1-E2)。

2.2 PCR扩增产物电泳分析

对45株酵母菌ITS区基因进行扩增，菌株PCR扩增产物电泳结果如图 2、3所示。由图 2、3可知，大部分条带大小在500 bp左右，不同菌株条带的亮度不一，但都获得清晰的单一条带，说明提取DNA纯度高，结果可信。

2.3 大熊猫被毛酵母菌的系统发育分析

从Neighbour-Joining法构建的系统进化树(图 4)可知，本次共分离到45株酵母型真菌, 其中41株能够鉴定到种，4株只能鉴定到属。40株为毛孢子菌属，4株为隐球菌属，1株为链状假丝酵母属。共得到12种酵母菌，有10株菌鉴定为指间毛癣菌(Trichosporon interdigitale)，编号分别为J3、J7、J9、J11、J14、J20、J24、J25、J32、J37；8株菌鉴定为串珠毛孢子菌(T. moniliiforme)，编号分别为D17、D37、M6、M9、M29、M21、S11、S14；5株菌鉴定为辜氏毛孢子菌(Trichosporon guehoae)，编号分别为S5、S13、D4、D5、D7。2株菌鉴定为秋吉台毛孢子菌(Trichosporon akiyoshidainum)，编号分别为M5和M8；3株菌鉴定为芸苔毛孢子菌(Trichosporon brassicae)，编号分别为D15、D16、D19；4株菌鉴定为星形毛孢子菌(Trichosporon asteroids)，编号分别为M24、D21、D30、S22；1株菌鉴定为皮肤毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)，编号为M11；2株菌鉴定为耶氏毛孢子菌(Trichosporon jirovecii)，编号为D6和M28；1株菌鉴定为蒙得维的亚毛孢子菌(Trichosporon montevideense)，编号为S41；4株菌鉴定为长莓隐球酵母(C. fragicola)，编号分别为S23、M14、D2、D8；1株菌鉴定为C. catenulate，编号为S9。4株菌仅能鉴定到毛孢子菌属(Trichosporon sp.)，编号分别为M1、D18、D23、D34。

2.4 药敏试验

表 1为12种酵母型真菌在25 ℃培养24 h，由3人共3次分别测量抑菌圈直径，并将3次结果取平均值作为判定的依据。真菌的药物敏感性情况按照丹麦Rosco药敏纸片基本判读标准进行判定。

表 1表明长莓隐球酵母对酮康唑耐药，芸苔毛孢子菌和耶氏毛孢子菌对酮康唑中度敏感，其余菌株对酮康唑敏感；指间毛癣菌和链状假丝酵母菌对两性霉素B耐药，皮肤毛孢子菌和辜氏毛孢子菌对两性霉素B中度耐药，其余菌对两性霉素B敏感；耶氏毛孢子菌和链状假丝酵母菌对伊曲康唑耐药，其余各菌株对伊曲康唑敏感；毛孢子菌对氟康唑耐药以外，其余菌株对氟康唑均敏感；皮肤毛孢子菌、指间毛癣菌、辜氏毛孢子菌和链状假丝酵母菌对制霉菌素耐药，其余菌株对制霉菌素敏感。综上所述，仅有1种酵母菌对氟康唑有强的耐药性，在临床中可优先选择氟康唑用于大熊猫临床酵母菌感染的治疗。

2.5 小鼠致病性试验

试验结果表明皮肤毛孢子菌、指间毛癣菌、星形毛孢子菌和长莓隐球菌对A、B组试验小鼠均致病，表现为不同程度的瘙痒、脓肿和精神萎靡。皮下接种与皮肤涂擦组脓肿和瘙痒更明显；腹腔接种组精神萎靡，剖解后可见腹腔粘连。其余菌株接种免疫抑制组小鼠后出现脓肿，但非免疫抑制组小鼠未表现临床症状，处死后剖解发现内脏无明显肉眼变化，表明仅为条件致病。C组皮肤涂擦伤3 d后痊愈，其余无任何肉眼可见病变。所有分离菌株接种均不致死小鼠(表 2)。

3 讨论

本次通过对大熊猫毛发样本中酵母菌的常规分离培养，形态学特征结合真菌通用引物对分离株进行PCR扩增，以快速鉴定所分离菌株的种属，本次所分离的45株酵母菌中，分别属于3个属，12个种，其中41株能鉴定到种，其余4株仅鉴定到属。主要以毛孢子菌为优势酵母菌群。

毛孢子菌属(Trichosporon)又为丝孢酵母属，常引起毛孢子菌病^[16]。目前认为可引起人类疾病的菌种有13种^[17]，本次在大熊猫体表分离鉴定到皮肤毛孢子菌( T. cutaneum)、星形毛孢子菌(T. asteroides)、耶氏毛孢子菌(T.jirovecii)和蒙得维的亚毛孢子菌(T. montevideense)是引起人毛孢子菌病的病原，在大熊猫和其他动物上未见关于毛孢子菌的案例报道。毛孢子菌病常常是一种凶险的疾病，其诊断往往很难明确，甚至被忽略，特别是在发展中国家，由于缺乏对病因学抗原显著诊断特征的认识和了解，情况更是如此^[16]，其他菌株虽然没有感染人的报道，但不排除在一定条件下感染大熊猫。

临床药敏试验中运用最广泛的是纸片扩散法，其能将待检测的菌株对抗真菌药物的敏感性定性分为敏感、中度敏感及耐药。丹麦Rosco纸片扩散法是欧洲标准的酵母菌药物敏感试验方法，比美国临床和实验室标准协会(NCCLS)公布的CLSI法适用药物范围大^[18]。丹麦Rosco纸片扩散法操作简单，有判断标准，便于临床操作，且具有结果直观、价廉、药物选择种类多、准确性好的优点，在国内被广泛用于临床实验室^[15]。在人类医学中，对酵母菌的药敏试验有其标准，但在动物医学研究中，还未有一种公认的实验方案标准。因此，在本次试验中借鉴人医学的研究方法及其标准。

本试验中长莓隐球菌对酮康唑耐药；链状假丝酵母菌和指间毛癣菌对两性霉素B耐药；链状假丝酵母菌和耶氏毛孢子菌对伊曲康唑耐药；未鉴定到种的毛孢子菌对氟康唑耐药；皮肤毛孢子菌、指间毛癣菌、辜氏毛孢子菌和链状假丝酵母菌对制霉菌素耐药。刘小平等^[19]利用Etest法对念珠菌进行药物敏感试验得出念珠菌对常用抗真菌药物存在不同程度的耐药率，非白色念珠菌较白色念珠菌对抗真菌药物的耐药率高。宋明辉等^[20]研究表明存在对氟康唑和两性霉素B耐药性的隐球菌菌株，与本试验结果一致。韩红燕等^[21]体外药敏试验结果表明，两性霉素B和5-氟胞嘧啶的敏感性最高，氟康唑对非白色假丝酵母菌耐药性较强，与本试验结果存在差异。指间毛癣菌、链状假丝酵母菌和耶氏毛孢子菌的耐药性研究还未见报道。

4 结论

本次共在37个熊猫被毛样本中分离到45株酵母菌，分属于3个属，12个种。分别为毛孢子菌属40株，隐球菌属4株，假丝酵母菌属1株。皮肤毛孢子菌、指间毛癣菌、星形毛孢子菌和长莓隐球菌对小鼠致病，其余对小鼠条件致病。多数菌种对5种抗真菌药物敏感。本研究丰富了对大熊猫源酵母菌种群的认识, 为大熊猫酵母菌病的诊治提供参考。