2. 成都农业科技职业学院, 成都 611130;
3. 攀枝花农林科学研究院, 攀枝花 617061
, XU Jing1, WANG Yu1, YANG Ying-dong3, WAN Jie3, GUO Cheng1, GU Xiao-bin1, XIE Yue1, YANG Guang-you1
2. Chengdu Agricultural College, Chengdu 611130, China;
3. Panzhihua Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Panzhihua 617061, China
脑多头蚴病(coenuriasis)又叫脑包虫病，是由多头带绦虫(Taenia multiceps)的中绦期——脑多头蚴(Coenurus cerebralis)寄生于牛、羊等偶蹄动物的脑和脊髓等处引起的一种寄生虫病。该病常引起患病动物死亡，给畜牧业造成巨大的经济损失，同时人也有被感染的报道[1-5]。
脱氧尿苷三磷酸酶(deoxyuridine triphosphatase, dUTPase)是一种广泛存在于各种生物体内的DNA复制修饰酶。dUTPase具有维持DNA复制稳定性的作用，这一作用是通过特异性的水解脱氧尿苷三磷酸(dUTP)生成2′-脱氧尿苷-5′-单磷酸(dUMP)和焦磷酸(PPi)，防止dUTP浓度过高而导致DNA复制错误。此外，dUTPase还可通过降低dUTP的错误掺入而保证DNA复制过程的正确性[6]。近年来，一些研究提示dUTPase具有作为新的药物靶标蛋白的潜在价值，一些病毒、细菌和寄生虫dUTPase的晶体结构已被解析[6-10]，为针对dUTPase的药物开发和设计提供了可能[11]。
目前，关于dUTPase功能的研究主要集中在病毒上，证实dUTPase对病毒在宿主体内的高效复制起着重要作用，同时dUTPase本身又是影响病毒毒力的重要因素[12-14]。当前关于寄生虫dUTPase的研究报道较少，只在疟原虫(Plasmodium)、锥虫(Trypanosoma)、猪带绦虫(Taenia solium)和豆状带绦虫(Taenia pisiformis)等物种上做过简单的研究[11, 15-17]。本研究通过原核表达得到重组Tm-dUTPase蛋白，并对其进行了Western blot分析、免疫荧光定位及酶学活性分析，为进一步研究Tm-dUTPase基因的生物学功能奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 虫体及血清多头带绦虫成虫采自人工感染脑多头蚴的健康犬。选取健康家犬1只，感染脑多头蚴前一周用吡喹酮(10 mg·kg-1，按体重给药)和左旋咪唑(8 mg·kg-1，按体重给药)驱虫，驱虫后一周经口感染取自山羊的脑多头蚴包囊1个，在感染后60 d剖杀犬获取成虫。脑多头蚴，采自四川省某羊场自然感染脑多头蚴的山羊脑部。
山羊脑多头蚴阳性血清采自四川省攀枝花市自然发病山羊；阴性血清采自四川省雅安市某羊场，通过尸体解剖确认无带科绦虫蚴感染。
1.2 试剂总RNA提取试剂盒(上海华瞬生物工程有限公司)；逆转录试剂盒(Fermentas公司)；pMD19-T Vector(大连宝生物工程有限公司)；2×Taq PCR master mixture、大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)(天根生物科技有限公司)；内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ(TaKaRa公司)；pET32a(+)原核表达载体由本实验室保存。
酶学活性测定试剂按如下方法配制。焦磷酸(PPi)标准液(1 mmol·L-1)：将0.446 g焦磷酸钠(Na4P2O7·10H2O)溶于双蒸水，定容至1 000 mL，4 ℃保存备用。硫酸溶液：精准量取73 mL双蒸水，缓慢加入27 mL浓硫酸，混匀，贮存备用；钼酸试剂：精准量取73 mL双蒸水，缓慢加入27 mL浓硫酸，混匀，再将2.59克钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]溶于预先配制的100 mL硫酸溶液中，4 ℃冰箱保存备用。亚硫酸盐试剂：A液，将10 g亚硫酸氢钠(NaHSO3)和0.59 g亚硫酸钠(Na2SO3)溶于双蒸水，定容至100 mL。将A液用双蒸水稀释15倍即得B液。巯基试剂：将10 mL β-巯基乙醇(HOCH2CH2SH)溶于90 mL双蒸水中，现配现用。
1.3 脑多头蚴dUTPase基因的表达、纯化以及重组蛋白质多克隆抗体的制备提取脑多头蚴总RNA，逆转录合成cDNA。参照猪带绦虫dUTPase序列(序列号：EF199625.1)及多头带绦虫转录组数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA80935/)相关序列设计一对特异性的PCR引物(上游：5′-CCGGAATTCATGGCTACTGCCATTCACGAT-3′，含EcoRⅠ酶切位点；下游：5′-CGGCTCGAGTCACACGCCGGTGGAGC-3′，含XhoⅠ酶切位点)。用PCR扩增脑多头蚴dUTPase基因序列，经TA克隆后，将克隆产物连接到pET32a(+)表达载体中，测序验证，然后转入大肠杆菌BL21(DE3)中，IPTG诱导表达。将表达细菌超声裂解，取上清液，用Ni2+柱亲和层析法纯化表达产物。重组蛋白质多克隆抗体的制备参照宋星桔等的资料[18]。
1.4 生物信息学分析根据扩增的脑多头蚴dUTPase基因全序列，用DNAStar软件推测其氨基酸序列，并用在线软件Signal IP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和Transmembrane Prediction server (http://www.sbc.su.se/~miklos/DAS/)分别对其进行信号肽和跨膜区预测。以推导出的氨基酸序列，使用在线软件NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)找出同源序列，DNAMAN比较相似性，MEGA 5.1软件构建进化树(邻接法)。
1.5 Western blot分析将纯化后的重组脑多头蚴dUTPase蛋白进行SDS-PAGE，然后转移到硝酸纤维素膜上，转膜缓冲液处理(5 min×3次)。用5%脱脂奶粉封闭2 h后，按1:100的比例加入山羊脑多头蚴阳性和阴性血清(0.01 mol·L-1 PBS稀释)。洗涤后，以HRP-标记的兔抗山羊IgG(1:300，0.01 mol·L-1 PBS稀释)孵育1 h，充分洗涤后，将NC膜放入DAB显色液中显色，双蒸水终止反应，观察结果。
1.6 免疫荧光定位将新鲜虫体(包括成虫和脑多头蚴)置于4%多聚甲醛溶液中固定36 h；经脱水和透明处理后包埋入石蜡内，切片备用，切片厚度为4 μm。经脱蜡和水化处理后，将切片用3% H2O2处理10 min，然后置于95 ℃的0.01 mol·L-1枸盐酸缓冲液中10 min进行抗原热修复；充分洗涤后，用兔抗dUPTase多克隆抗体4 ℃孵育过夜；洗涤，然后用FITC标记的山羊抗兔IgG避光孵化1 h，用甘油缓冲液封片，荧光显微镜观察结果。
1.7 重组dUTPase的酶学活性分析 1.7.1 PPi标准曲线的绘制参照G.B.Grindey等[19-20]和刘振勇等[16]的方法进行焦磷酸(PPi)标准曲线的绘制。取10个1.5 mL Eppendorf管，分别加入焦磷酸标准溶液(1 mmol·L-1)0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 μL，每管加双蒸水补至800 μL，混匀。每管依次加入钼酸试剂(50 μL)、亚硫酸试剂(A液，100 μL)及10% β-巯基乙醇(50 μL)，混匀，室温反应10 min。再依次加入亚硫酸试剂(B液，100 μL)、10%的β-巯基乙醇(50 μL)及无水乙醇(100 μL)混匀，测定575 nm OD值，绘制OD值与焦磷酸浓度的线性相关曲线。
1.7.2 重组dUTPase的酶活力测定dUTPase活性单位的定义是指37 ℃每分钟水解1 nmol dUTP所需要的酶量为1个酶单位。酶的比活性(specific activity)为每毫克蛋白质中所含酶单位的数量(U·mg-1)。取5个Eppendorf管分别加入2、4、6、8和10 μL重组dUTPase(质量浓度为0.907 mg·mL-1)，37 ℃预热5 min。各管分别加入1 μL dUTP(100 mmol·L-1)，37 ℃水浴1 min后终止反应，再加双蒸水至800 μL并混匀，检测575 nm OD值。
1.7.3 金属离子和EDTA对重组dUTPase活力的影响取33个1.5 mL Eppendorf管分为11组，每组3个重复，在酶反应体系中加入不同组合的EDTA(0.5 mmol·L-1)和金属离子(Mn2+、Zn2+、Cu2+, 1 mmol·L-1)，检测EDTA和金属离子对dUTPase活性的影响，同时在已加EDTA的反应体系中补加金属离子，检测金属离子对dUTPase活性的恢复程度(与未加EDTA的正常酶反应体系相比较)。用SPSS 20.0对数据间的差异显著性进行统计。酶促反应体系组成参见结果部分的相应表格。
2 结果 2.1 Tm-dUTPase基因的克隆与序列分析Tm-dUTPase基因的RT-PCR扩增与预期结果相符(图 1A)。将pMD19-T-dUTPase重组质粒进行PCR和双酶切双重鉴定，结果与预期一致(图 1B)。序列分析表明，Tm-dUTPase基因ORF框为447 bp，编码148个氨基酸。用氨基酸序列预测发现dUTPase没有信号肽和跨膜区，分子大小为16.39 ku，等电点为6.263。与猪囊尾蚴和豆状囊尾蚴dUTPaser的氨基酸序列相似性较高，达到97%和91%。用GenBank中相关物种dUTPase氨基酸序列进行的进化分析表明，绦虫dUTPase基因单独聚在一支，明显区别于吸虫和脊椎动物(图 2)。
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A. Tm-dUTPase的RT-PCR产物；B.重组质粒的双酶切鉴定；M. DL2000 DNA相对分子质量标准；1.PCR产物；2. pMD19-T-dUTPase重组质粒的双酶切产物；3. pET32a (+)-dUTPase重组质粒的双酶切产物 A. Products of Tm-dUTPase gene by RT-PCR; B. Identification of recombinant plasmid pMD19-T-dUTPase and pET32a (+)-dUTPase by restriction endonucleases digestion; M. DL2000 DNA marker; 1. PCR products; 2. Products of pMD19-T-dUTPase by double-enzyme digestion; 3. Products of pET32a (+)-dUTPase by double-enzyme digestion 图 1 Tm-dUTPase基因RT-PCR扩增产物及重组质粒的酶切鉴定 Figure 1 Products of Tm-dUTPase gene by RT-PCR and identification of recombinant plasmid by restriction endonucleases digestion |
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物种名称后为该序列的GenBank登录号；节点上的数字代表该分支的可信度(自展值) GenBank accession number were given after the species name; Node number represents bootstrap values 图 2 Tm-dUTPase氨基酸序列进化树(NJ树) Figure 2 The phylogenetic tree based on amino acid sequences of Tm-dUTPase |
重组质粒pET32a(+)-dUTPase经双酶切鉴定，插入片段的大小与预期结果一致(图 1B-3)。将酶切鉴定正确的pET32a(+)-dUTPase重质粒转化到表达菌BL21中，经PCR和测序鉴定表明成功构建pET32a(+)-dUTPase表达载体。
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A.重组Tm-dUTPase的表达；B. Tm-dUTPase重组蛋白的Western blot分析；M.蛋白质相对分子质量标准；1. pET-32a(+)空载诱导；2.未诱导重组表达质粒；3.诱导重组表达质粒；4. Tm-dUTPase重组蛋白与山羊脑多头蚴阳性血清孵育；5. Tm-dUTPase重组蛋白与健康山羊血清孵育 A.The expression of recombinant Tm-dUTPase; B. Western blot analysis of recombinant Tm-dUTPase protein; M. Protein molecular weight marker; 1. pET-32a(+) with IPTG; 2. pET-32a(+)-dUTPase without IPTG; 3. pET-32a(+)-dUTPase with IPTG; 4. Recombinant Tm-dUTPase protein probed with goat serum against T. multiceps; 5. Recombinant Tm-dUTPase protein probed with normal goat serum 图 3 Tm-dUTPase重组蛋白的表达及Western blot分析 Figure 3 Expression and Western blot analysis of recombinant protein Tm-dUTPase |
SDS-PAGE分析表明，重组表达蛋白质主要存在于上清液中，约36 ku(加上pET32a(+)载体上约20 ku的Trx标签和His标签)，与预期相符(图 3A)。表达产物经Ni2+柱亲和层析分离纯化，在100 mmol·L-1咪唑洗脱液中收集得到目的蛋白质，用BAC蛋白定量测定试剂盒测得纯化后的目的蛋白质质量浓度为0.907 mg·mL-1。重组蛋白质的免疫印迹结果显示，纯化的dUTPase重组蛋白质可被山羊脑多头蚴阳性血清特异性识别，条带大小在37 ku左右(图 3B)。
2.3 Tm-dUTPase蛋白的免疫荧光定位免疫荧光定位结果显示，Tm-dUTPase蛋白大量分布在多头带绦虫成虫的体内实质区(图 4)；此外，该蛋白质还广泛分布于多头蚴头节及多头蚴包囊囊壁外层(图 5)。
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绿色荧光区域为dUTPase蛋白定位区域；TZ.皮质区；PZ.实质区；E.虫卵；箭头所指区域：MT.微毛区；DC.远端胞质区；PC.核周胞质区；标尺=100 μm The green fluorescence tint shows the location of dUTPase protein; TZ. Tegument zone; PZ. Parenchymatous zone; E. Eggs; Arrows indicate certain areas of the parasite: MT. Microthrix; DC. Distal cytoplasm; PC. Perinuclear cytoplasm; Scale bar=100 μm 图 4 多头带绦虫dUTPase蛋白的免疫荧光分析(成虫) Figure 4 Immunolocalization of dUTPase protein in T. multiceps (adult tapeworm) |
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ZS.头节区；箭头所指区域：M.微刺；OCW.囊壁外层；MCW.囊壁中层；ICW.囊壁内层；标尺=100 μm ZS. Zone of scole; Arrows indicate the areas of the parasite: M.Microtrichia; OCW. The outer layer of cystic wall; MCW. The middle layer of cystic wall; ICW. The inside layer of cystic wall; Scale bar=100 μm 图 5 多头带绦虫dUTPase蛋白的免疫荧光分析(多头蚴) Figure 5 Immunolocalization of dUTPase protein in T.multiceps (Coenurus cerebralis) |
焦磷酸的量与575 nm光吸收值的标准曲线见图 6，各组数据间的相关系数为0.995。
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图 6 焦磷酸(PPi)浓度与吸光度标准曲线 Figure 6 The standard curve of PPi determined at 575 nm |
1~4组dUTPase使用量与产物焦磷酸(PPi)的相关数据见表 1，两者之间的相关系数是0.996 2，说明酶活性与表达产物量的线性关系较好。重组dUTPase每分钟水解1 nmol dUTP所需的酶量为1.013 9 μg，纯化的dUTPase 1个酶活力单位为1.013 9 μg，因此纯化的重组dUTPase的比活力为986.29 U·mg-1。
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表 1 不同浓度重组dUTPase 575 nm处的光吸收值 Table 1 Absorbance value of different concentrations of recombinant dUTPase at 575 nm |
EDTA和不同金属离子对重组dUTPase活力的影响见表 2和图 7。
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表 2 EDTA和不同金属离子对重组dUTPase活力的影响 Table 2 The effect of EDTA and different metal ions on the activity of recombinant dUTPase |
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图中星号表示统计学差异显著性，*.P＜0.05；**.P＜0.01 Asterisks indicate statistically significant differences, *.P < 0.05; **.P < 0.01 图 7 EDTA和不同金属粒子对重组dUTPase活性的影响 Figure 7 The effect of EDTA and different metal ions on the activity of recombinant dUTPase |
结果显示：EDTA可以抑制脑多头蚴dUTPase的活性，使dUTPase的活性降低33.78%；Mg2+、Zn2+和Cu2+离子则可以增强其活性；其中Zn2+对dUTPase活性的增强作用最明显，使dUTPase的活性增加了103.38%。此外，本研究还发现以Cu2+为首的金属离子可以恢复被EDTA抑制了的dUTPase的活性，Cu2+可以使抑制的dUTPase恢复90.05%的活性，而Mg2+、Zn2+的恢复能力分别为85.14%和61.46%(图 7)。
3 讨论dUTPase作为dUTP浓度的调节者在肿瘤的化疗中发挥着重要作用。DNA双链中不允许dUTP的存在，如果dUTP错误的掺入到正在复制的DNA中，则会导致DNA碎片化及细胞死亡。基于这一原理，已有针对dUTP设计的抗肿瘤和抗病毒药物出现，例如某些叶酸拮抗剂和胸苷酸合成酶抑制剂的抗肿瘤活性依赖于dUTP掺入到肿瘤细胞DNA中起到杀伤作用[6, 21]。此外，dUTPase还具有通过水解dUTP来维持其在细胞中的低浓度，对保持DNA复制的准确性具有十分重要的意义[22]。通过解析dUTPase的晶体结构，用特定的计算机软件来筛选小分子化合物是当前以dUTPase为基础进行药物设计的常用方法[6, 15, 22]，而获得稳定表达的、纯度较高的dUTPase是进行深入研究的基础。本研究发现多头带绦虫重组dUTPase大量以可溶性形式存在于上清液中，少量以不可溶形式存在于包涵体，并对其进行了纯化、SDS-PAGE和Western blot分析。此外，通过免疫荧光分析，我们观察到dUTPase蛋白主要分布于多头带绦虫成虫的体内实质区，同时广泛分布于脑多头蚴头节和包囊囊壁外层。
常用的测定dUTPase活性的方法有3种[23]：第一种方法是测定水解反应中H+释放量的酸碱指示光度分析法；第二种方法是用放射标记的dUTP作薄层分析或液相层析分析；第三种方法是利用磷钼酸与产物焦磷酸的显色反应来测定产物的量。本试验采用第3种检测方法，测定结果显示了很好的相关性，表明成功建立了检测多头带绦虫dUTPase活性的检测方法。用所建立的dUTPase活性检测方法测定重组表达的dUTPase活力，发现纯化的重组脑多头蚴dUTPase的比活力为986.29 U·mg-1。
金属离子具有维持dUTPase正常空间结构的作用，同是金属离子也是dUTPase的活性辅助因子，二价镁离子(Mg2+)具有维持dUTPase 5′端三磷酸亚基的正确空间构象和在dUTPase与底物结合的亲核攻击中起着定位等方面的作用[9]。乙二胺四乙酸(EDTA)可与Mg2+等金属离子形成螯合物，可减弱酶反应体系中dUTPase的活性，当在酶反应体系中重新加入Mg2+等金属离子时dUTPase的酶活性可得到恢复。本研究选取了Mg2+、Zn2+和Cu2+ 3种金属粒子来验证它们与EDTA相互作用对dUTPase活性的影响，结果表明3种金属离子都具有增强dUTPase活性的作用；在酶反应体系中预先加入EDTA，再分别加入Mg2+、Zn2+和Cu2+ 3种金属离子，dUTPase的活性均得到了一定程度的恢复，其中以Mg2+的恢复效果最明显，证明了Mg2+是dUTPase发挥酶学活性的重要辅助因子，这与刘振勇等[16]的研究结果一致。
此外，陈林等[17]以豆状带绦虫dUTPase重组蛋白作为包被抗原建立了检测兔豆状囊尾蚴感染的Dot-ELISA诊断方法，其特异性为85.7%~92.9%，敏感性为86.4%~88.0%，表明纯化的豆状带绦虫dUTPase重组蛋白可作为兔豆状囊尾蚴病的血清学诊断抗原。本研究所表达的dUTPase重组蛋白是否有作为山羊脑多头蚴病血清学诊断抗原的潜在价值，有待进一步的研究。
4 结论多头带绦虫脱氧尿苷三磷酸酶(Tm-dUTPase)基因的ORF为447 bp，编码148个氨基酸，原核表达得到可溶性重组Tm-dUTPase蛋白，纯化后的质量浓度为0.907 mg·mL-1，Western blot分析显示该蛋白质能够被山羊脑多头蚴阳性血清所识别，有较强的反应原性。免疫荧光定位显示Tm-dUTPase主要分布于多头带绦虫成虫的体内实质区，同时广泛分布于多头带绦虫幼虫(脑多头蚴)的头节和包囊囊壁外层。酶学活性试验测得重组Tm-dUTPase的比活力为986.29 U·mg-1，EDTA能够抑制Tm-dUTPase活性，而金属离子Mg2+、Zn2+、Cu2+能够增强Tm-dUTPase活性。
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