2. 南京农业大学, 南京 210095;
3. 肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心, 南京 210095
2. Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
3. Jiangsu Collaborative Innovation Center for Meat Production, Processing and Quality Control, Nanjing 210095, China
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，M. hyopneumoniae)是引起猪支原体肺炎(mycoplasma pneumoniae of swine，MPS)的主要病原，也是猪呼吸道综合征(porcine respiratory disease complex，PRDC)的主要原发性病原之一[1-2]。
猪群在感染M. hyopneumoniae后，很容易继发感染其他病原，发生猪呼吸综合征，为猪病诊断和预防控制增加了难度[3-4]。疫苗免疫是防控该病的主要手段，目前我国市场化的猪支原体肺炎活疫苗株仅有Z株、RM48株、168株，但对于这3种疫苗株暂无区分方法报道。P46蛋白是M. hyopneumoniae的黏附蛋白，主要免疫优势蛋白之一，且与其他支原体无交叉反应，常作为M. hyopneumoniae检测的靶蛋白或靶基因。P97蛋白是M. hyopneumoniae的黏附因子，与病原的感染与致病机制相关，具有很好的免疫原性，P97基因C末端的一部分包含两个不定数量的重复区域R1和R2。本研究拟测定各疫苗菌株的P46基因和P97R1R2基因序列，并进行核苷酸与氨基酸同源性分析，为不同疫苗株区别鉴定提供基础。
1 材料与方法 1.1 试验用的疫苗种类168株：来源于南京天邦生物科技有限公司猪支原体肺炎活疫苗(168株)——支必宁。
RM48株：分别来源于浙江诺倍威生物技术有限公司的猪支原体肺炎活疫苗(RM48株)——喘净威(RM48-NB)、山东绿都制药有限公司的猪支原体肺炎活疫苗(RM48株)(RM48-LD)。
Z株：来源于吉林正业生物制品股份有限公司猪支原体肺炎活疫苗(Z株)。
J株：GenBank登录号为NC_007295.1；232株：GenBank登录号为NC_006360；7448株：GenBank登录号为NC_007332.1；7422株：GenBank登录号为:NC_021831.1。
1.2 主要试剂及仪器柱式细菌DNAout试剂盒、胶回收试剂盒购自北京天恩泽基因科技有限公司；EX-Taq酶、pMD18-T载体购自TaKaRa公司；AceQ qPCR probe master mix、T4 DNA Ligase、BL21(DE3)化学感受态细胞、DL2000 DNA marker购自南京诺唯赞生物科技有限公司。
1.3 引物合成根据GenBank中M. hyopneumoniae J株序列(登录号：NC_007295.1)，分别设计P46、P97引物，由金斯瑞基因合成。
1.4 疫苗株基因组DNA提取3种疫苗株按照柱式细菌DNAout试剂盒说明书提取DNA。
1.5 PCR扩增以提取的基因组DNA为模板，P1、P2、P3、P4为引物，引物序列见表 1，PCR扩增P46基因，反应条件：94 ℃ 5 min；98 ℃ 1 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共32个循环；72 ℃ 10 min。扩增P97R1R2基因，94 ℃ 4 min；98 ℃ 1 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共32个循环；72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR产物纯化采用胶回收试剂盒。
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表 1 引物序列 Table 1 The primers |
按照pMD18-T试剂盒将回收产物连接入pMD18-T载体，BL21(DE3)化学感受态细胞转化后提质粒，PCR鉴定后测序。
1.7 目的基因的序列分析将阳性质粒送金斯瑞公司测序，比对四种疫苗的P46、P97R1R2基因序列，采用DNAStar5.0序列分析软件进行序列分析。
2 结果 2.1 P46基因、P97R1R2基因PCR扩增所有疫苗株P46基因、P97R1R2基因序列分析，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，均可见约1 153或685 bp的片段，与预期分子大小一致，见图 1。
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M. DL2000 DNA相对分子质量标准; 1.阴性对照；2. 168株；3. RM48-NB株；4. RM48-LD株；5. Z株 M. DL2000 DNA marker; 1. Negative control; 2.168 strain; 3. RM48-NB strain; 4. RM48-LD strain; 5. Z strain 图 1 P46基因、P97R1R2基因PCR扩增 Figure 1 Amplification of P46 gene and P97R1R2 gene by PCR |
对3种疫苗株的克隆产物进行序列测定，所测结果均为P46基因片段，应用DNAStar软件MegAlign程序对国际标准株J株、232株、7448株、7422株一起进行比对，发现168株、RM48-NB株、RM48-LD株、Z株的P46基因序列相似性为100%，与另外4株经典株的相似性也高达98.9%~99.1%。氨基酸序列比对发现，8株菌株间氨基酸序列中有4处突变，主要发生在第175位、220位、229位和第267位。其中，在175位，7422株是赖氨酸(Lys，K)，其他菌株均编码天冬酰胺(Asn，N)；在220位，3种活疫苗菌株是谷氨酸(Glu，E)，而J株、232株和7422株是谷氨酰胺(Gln，Q)，7448株是甘氨酸(Gly，G)；第229位，3种活疫苗菌株是天冬氨酸(Asp，D)，而J株、232株、7422株是谷氨酸(Glu，E)；第267位，7448株和7422株是异亮氨酸(Ile，I)，J株、232株和疫苗菌株是缬氨酸(Val，V)。
2.3 P97R1R2基因的核苷酸和氨基酸序列分析对3种疫苗株P97R1R2基因的克隆产物进行序列测定，并且和国际标准株J株、232株、7448株、7422株一起进行比对，应用DNAStar软件MegAlign程序分析其序列，发现RM48株和Z株的P97R1R2基因序列相似性为100%；与168株相似性为97.5%；而3种疫苗株与其他4株经典株相比，相似性相对较低，仅为90.1%~93.6%，遗传进化关系相对也较远。
进一步对8个菌株P97R1R2基因的氨基酸序列进行分析，其差异主要表现在R1、R2重复区的个数上。从P97的R1氨基酸重复序列分析(图 2)，RM48株、Z株的重复序列各为17次(其中，AAKPE重复次数为9次，AAKPV重复次数为8次)；168株重复序列为11次(其中，AAKPE重复次数为5次，AAKPV重复次数为6次)；J株重复序列为9次(其中，AAKPE重复次数为4次，AAKPV重复次数为4次，TTKPV重复次数为1次)；232株重复序列为15次(其中，AAKPE重复次数为8次，AAKPV重复次数为6次，TTKPV重复次数为1次)；7422株重复序列为15次(其中，AAKPE重复次数为5次，AAKPV重复次数为1次，TTKPV重复次数为1次，TAKPV重复次数为3次)；7448株重复序列为10次(其中，AAKPE重复次数为3次，AAKPV重复次数为7次)。
在P97的R2区方面(图 2)，RM48株、Z株、168株的重复序列各为3次(其中，GSSNQGKKGE重复1次，GTPNQGKKAE重复1次，GAPSQGKKAE重复1次)；J株的重复序列为5次(其中，GSPNQGKKAE重复1次，GAPNQGKKAE重复2次，GAPSQGKKAE重复2次)；232株的重复序列为4次(其中，GSSNQGKKGE重复1次，GTPNQGKKAE重复2次，GAPNQGKKAE重复1次)；7448株、7422株的重复序列各为4次(其中，GSSNQGKKGE重复1次，GAPNQGKKAE重复2次，GAPSQGKKAE重复1次)。
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图 2 8个样本P97R1R2蛋白氨基酸序列比较 Figure 2 Comparison of the anino acid sequence of P97R1R2 protein from 8 samples |
疫苗免疫是猪支原体肺炎防控的主要手段，我国成功研制了猪支原体肺炎活疫苗，并实现了产业化推广应用，从2010年的1家疫苗公司到2017年的9家疫苗公司生产，呈现了井喷式的发展，给临床上猪气喘病防控带来极大的利好。目前在我国市场上推广的猪支原体肺炎活疫苗菌株主要有三株，分别是中国兽医药品监察所研制的Z株和RM48株、以及由江苏省农业科学院研制的168株。但目前尚无对不同活疫苗菌株区别鉴定的方法报道。国内外对M. hyopneumoniae分型方法有很多，通过P97 R1R2区的重复序列不同比较各菌株间差异是一种简单的分型方法，还有其他很多种基因的分型方法和鉴定方法，比如，AFLP、RAPD、RFLP、PFGE等，但是这些方法操作复杂，结果不易分析，准确性有待提高，不适用于临床；而且全球基因分型方法没有完全一致的标准。本研究选择P46和P97基因作为靶基因，对我国市场上目前所有的猪支原体肺炎活疫苗菌株进行鉴定并区别，将P46和P97基因的保守性和特异性结合起来应用于疫苗生产鉴定，对于保持其生物学特征，保证疫苗产品质量及生物安全具有十分重要的意义。
M. hyopneumoniae膜表面的黏附蛋白变异很频繁[5]。自然界的M. hyopneumoniae可以自发的使其表面的膜蛋白抗原发生大小和结构的变化，在蛋白抗原表面趋近性的形成抗原表位遮蔽物。许多关于M. hyopneumoniae膜蛋白的报道均有不同[6-7], 说明M. hyopneumoniae易发生变异，而P46的基因及编码的蛋白质却具有很高的保守性[8]。P46是M. hyopneumoniae中具有较强的种特异性蛋白质，不存在于其他种类的支原体或其他微生物中，是引起机体早期免疫反应的抗原蛋白，也是M. hyopneumoniae的主要免疫优势蛋白[9]，是诊断试剂常用的备选蛋白质，很多研究人员将其作为M. hyopneumoniae检测的靶蛋白或靶基因[10-15]，是区别鉴定M. hyopneumoniae和其他种属支原体的一个重要依据，对M. hyopneumoniae的诊断具有重要意义。S. Futo等[10]将重组的P46蛋白用于血清抗体的ELISA检测，敏感、特异，在M. hyopneumoniae感染后的2周内就可以检测到抗体的存在；沈青春等[16]将重组P46表达蛋白作为间接ELISA包被抗原用于检测猪血清中M. hyopneumoniae抗体为抗原，优化建立rP46-ELISA方法；杜改梅等[17]尝试了P97R1、P36、P46、DnaK混合蛋白质作为包被抗原，筛选出特异性好、敏感性高的ELISA用M. hyopneumoniae抗原蛋白，更加准确地监测M. hyopneumoniae的感染或免疫状态。本研究选择P46基因对三种疫苗株进行检测，鉴定疫苗株的准确性，结果发现3个弱毒疫苗株P46基因相似性完全相同，与GenBank中J株、232株、7448株和7422株四株标准株相比，相似性也在98.9%以上。P46基因在人工致弱的疫苗株中仍然高度保守，可作为猪肺炎支原体疫苗株鉴定靶标之一。但所有的活疫苗菌株均在P46基因的第220位和229位氨基酸发生了一致性的突变，在第220位，由谷氨酰胺(Gln，Q)或甘氨酸(Gly，G)突变为谷氨酸(Glu，E)；在第229位，由谷氨酸(Glu，E)突变为天冬氨酸(Asp，D)。魏晶晶等[18]在对其他猪肺炎支原体菌株基因比对分析时，也在相同的位点发现了突变的现象。而覃青松等[19]、李莹莹等[20]通过软件分析得出，这些位点氨基酸的变化并不影响P46蛋白的氨基酸二级结构(α-螺旋、β-折叠、β-转角)和亲水性，只有该氨基酸所在表位的抗原性发生了一些小差异，而不影响抗原表位数量的变化，整个序列包含30个抗原表位。熊丁杰等[21]研究M. hyopneumoniae MY-99株，也得出了同样的结论。3个人工致弱的疫苗株在P46基因的第220位和229位发生的一致性突变，是否与长期在培养基中传代并适应生长有关，或许与毒力下降有关，尚难作出定论。
P97编码区C端的R1区是P97的抗原决定簇区，随机分布在M. hyopneumoniae细胞膜外表面，最早被证明具有黏附作用的黏附因子，是纤毛的结合位点(AAKPV/E)[22-24]，参与纤毛的黏附[25-26]，会引起感染猪产生免疫应答[27-29]，当它黏附在宿主细胞上时，会造成呼吸道纤毛的损伤，将有利于其他病原体的入侵[30]；R2区不能黏附纤毛[31-32]。通过对P97蛋白的体外研究发现了P97的N和C端都能够黏附肝磷脂，C末端的R1和R2两个重复单元对肝磷脂的黏附都是不可缺少的[23]。当猪感染M. hyopneumoniae后，最早产生针对P97的IgM和IgG，比针对其他抗原早30~60 d[33]，所以也将P97蛋白作为M. hyopneumoniae早期感染的致病机制中的一环进行研究。P97R1蛋白可诱发猪呼吸道产生特异性IgA抗体[34]，逯晓敏等[35]初步建立M. hyopneumoniae IgA间接ELISA方法，用于临床监测；Z. X. Feng等[36]用纯化的P97R1为抗原建立的M. hyopneumoniae SIgA-ELISA诊断方法能够检测出鼻拭子中的M. hyopneumoniae IgA，该方法的特异性、敏感性和准确性可以达到94%以上。
不同菌株的差别主要集中在P97R1R2片段重复序列的差别，可以作为区分不同M. hyopneumoniae菌株的一个标准[37-38]。作为一个主要毒力因子，P97蛋白用于M. hyopneumoniae早期检测、强弱毒株黏附力的分析以及疫苗的防治等。有报道称，R1区重复序列的差异性可能与黏附能力、毒力相关。M. hyopneumoniae不同菌株型间黏附因子序列的比较，发现R1区的变异性最大，重复基元范围从8~15个数量不等，而R2区的重复基元一般保持在3~4个之间。有文献报道重复单元的个数与猪肺炎支原体的黏附能力相关。F. C. Minion等[22]发现P97蛋白C末端的R1重复区是与纤毛结合部位，当R1区域重复单元至少8个，该杂合蛋白才能与纤毛结合，被抗体识别至少需要3个以上的重复序列；T. Hsu等[32]同样发现当P97R1区域的重复次数在8以上时，该杂合蛋白才能与纤毛结合，而且重复单元数越高，黏附能力越强。另外也有研究表明，P97R1重复数的多少与强弱毒株的区分有一定联系，可以作为M. hyopneumoniae分型和鉴定的一个标准[39-40]。丁芳等[41]对232株、中国兽医药品监察所保存的R659株和F19株的P97R1比较发现，重复序列数分别为15次、17次、11次，因此推测R1重复序列的差异可能就是导致R659弱毒株致病力下降的原因。但本研究发现，三个人工致弱的疫苗株R1重复区分别为11次和17次，而强毒株232株R1重复序列个数处于中间，为15次。这又说明M. hyopneumoniae毒力的强弱不一定与R1区重复次数完全相关。疫苗株中，Z株是由M. hyopneumoniae兔化弱毒株接种鸡胚，繁殖并收获卵黄囊制成的弱毒菌株；将兔化弱毒株适应培养基，并在培养基上连传48代，在使其更加适应培养基，提高活菌数的同时，进一步减弱了毒力，研究出了培养基弱毒活疫苗RM48株[41-46]。从P46与P97R1R2基因的遗传分析看，Z株与RM48株的相似性达到100%，这可能与相同的遗传来源相关。而168株是江苏省农业科学院兽医研究所于1979年在甘肃省分离，经3次克隆化培养，无细胞培养基中致弱培养至322代次以上，形成有免疫原性的弱毒菌株[47]。相比Z株与RM48株，虽然168株的P46基因的相似性达100%，但在P97R1R2基因的重复区个数方面存在差异，这种差异与菌株之间的黏附力或毒力是否存在关系，本研究尚无法得出结论；但利用这种差异，可以方便地区别各疫苗菌株。
M. hyopneumoniae基因组较大，对其主种子批进行全基因组测序，耗时、费用高，但选择保守性高的P46和存在定向突变的P97基因区段测序可有效避免上述诸多不利因素，同时也防止主种子批、主种子库发生变异，以便对疫苗生产用种子进行质量控制。
4 结论选择P46和P97基因作为靶基因，对我国市场上3种猪支原体肺炎活疫苗菌株(168株、RM48株、Z株)进行鉴定并区别，利用DNAStar序列分析软件对测序结果和国际标准株J株、232株、7448株、7422株一起进行比对，结果发现，疫苗株Z株、RM48株、168株的P46基因序列相似性为100%，与J株、232株相似性为99.1%，与7422株、7448株相似性为98.9%。疫苗株RM48株和Z株的P97R1R2基因序列相似性为100%；而与疫苗株168株相似性为97.5%；3个疫苗株与J株、232株、7448株、7422株的P97R1R2基因相似性仅为90.1%~93.6%，差异主要发生在R1区重复序列的次数上。
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