畜牧兽医学报  2017, Vol. 48 Issue (12): 2358-2364. DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2017.12.015    PDF    
经密码子优化的猪Ficolin α在昆虫细胞的表达及其体外抗病毒作用初步分析
李兰1, 乔绪稳1, 张元鹏1, 陈瑾1, 郑其升1, 侯继波1,2     
1. 江苏省农业科学院动物免疫工程研究所, 南京 210014;
2. 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心, 扬州 225009
摘要:利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统表达具有天然构象的猪Ficolin α。首先构建重组穿梭质粒rBacmid-Ficolin α,转染sf9细胞获得重组杆状病毒rBV-Ficolin α;通过Image J软件对优化表达的Western blot图片进行灰度分析确定较佳表达条件;纯化目的蛋白质后,进一步评价其体外抗病毒活性。Western blot结果显示以7.5 MOI接种量感染的sf9细胞在96 h时获得了较高的表达,同时获得的重组猪Ficolin α具有抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活性。猪Ficolin α在sf9昆虫细胞中获得成功表达,且具有良好的抗PRRSV活性。本研究可以为猪Ficolin α的抗病毒活性及作用机制研究提供物质基础。
关键词猪Ficolin    杆状病毒-昆虫细胞表达系统    抗病毒作用    
Expression of Codon-optimized Porcine Ficolin α in Insect Cell and Its Antiviral Activity in vitro
LI Lan1, QIAO Xu-wen1, ZHANG Yuan-peng1, CHEN Jin1, ZHENG Qi-sheng1, HOU Ji-bo1,2     
1. Institute of Animal Immunology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;
2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China
Abstract: To get native porcine Ficolin α, Bac-to-Bac baculovirus expression system was used. Firstly, rBacmid-Ficolin α was constructed, and then transfected into sf9 insect cells to obtain recombinant baculovirus rBV-Ficolin α. The optimized expression conditions were detected by Western blot and analyzed by gray level using Image J software. Followed by purification, antiviral activity of target protein was assessed in vitro. Western blot results showed that the expression level of Ficolin α in transfected sf 9 insect cells was higher at the infection (MOI) of 7.5 when they were harvested at 96 h, and porcine Ficolin α had the antivirus activity against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). In conclusion, porcine Ficolin α was successfully expressed in sf9 insect cells and showed strongly anti-PRRSV activity. This study provided a material basis for the study of antiviral activity and its mechanism of porcine Ficolin α.
Key words: porcine Ficolin     baculovirus-insect cell system     antiviral activity    

Ficolin最初是在猪的子宫内膜细胞上发现的转化生长β因子结合蛋白[1-2],存在于人及多种动物体内。猪体内发现了2种类型的Ficolin,分别为Ficolin α和Ficolin β,相似性高达80%[3-4]。本研究中目的蛋白Ficolin α主要存在于血清中,相对分子质量为35 ku[5]。作为一种胶原样凝集素,其单体也具有类似的结构:富含半胱氨酸的N端结构域、胶原样结构域(CLR)、颈区和C端的糖识别结构域(CRD)[6]。大量研究表明胶原样凝集素的CRD能够与存在于病毒、细菌及真菌等病原微生物表面的糖基特异性结合[6-9],从而抑制病原微生物的感染,这种高度特异性的结合决定了凝集素在实际应用中有着很大的发展空间。

Ficolin是一种N-乙酰基特异性的凝集素,尤其与N-乙酰葡糖胺的亲和力最高[10],可以通过与病毒表面糖蛋白的结合而发挥其抗病毒作用。关于Ficolin抗病毒作用的研究在人医领域较多,如人L-Ficolin、H-Ficolin及L-Ficolin/MBL嵌合凝集素与人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、埃博拉病毒和立百病毒的相互作用都有大量报道[11-14],而在兽医领域的研究资料非常匮乏,仅N. D. Keirstead等[10]于2008年报道利用CHO细胞瞬时表达的猪Ficolin可以与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)结合,并且可以降低PRRSV在Marc-145细胞的感染。

因此,本研究拟采用Bac-to-Bac系统,构建重组杆状病毒,感染sf9细胞制备重组猪Ficolin α,并对其抗病毒活性进行初步分析,为猪Ficolin α的抗病毒活性及机制研究提供物质基础。

1 材料与方法 1.1 材料

质粒pUC57-Ficolin α(经金斯瑞生物科技有限公司进行密码子优化后而人工合成)由本实验室构建并保存;大肠杆菌DH10Bac、转移载体pFastBacTM1、草地贪夜蛾卵巢细胞sf9由本实验室保存;DH5α购自北京全式金生物技术有限公司;DNA Marker、限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、Premix Taq PCR试剂、T4 DNA连接酶、pMD-19T载体等购自TaKaRa公司;质粒DNA小量试剂盒、胶回收纯化试剂盒购自Axygen公司;Bacmid DNA提取试剂盒购自OMEGA Biotek公司;胎牛血清购自Gibco公司;Grace培养液和CellfectinR Ⅱ Reagent购自Invitrogen公司;鼠源抗His标签的单克隆抗体,购自南京生兴生物技术有限公司;HRP标记的羊抗鼠IgG,FITC标记的羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 引物设计与合成

根据猪Ficolin α基因序列,利用Primer 5.0软件设计引物,基因两端分别引入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点,同时上游引物5′端引入His Tag便于纯化,上游引物F1为5′-GAATTCATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGATCCGCTG-ACACCTG-3′,下游引物F2为5′-AAGCTTTTAGGTCAGGCGGACTTTC-3′。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 重组质粒19T-Ficolin α的构建

扩增目的基因,25 μL PCR反应体系:Premix Taq 12.5 μL,引物F1 1 μL,引物F2 1 μL,质粒pUC57-Ficolin α 0.2 μL,MQ水10.3 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性10 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,循环30次,最后72 ℃ 10 min。获得的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,回收凝胶中的目的片段,克隆至pMD-19T载体,获得的重组质粒19T-Ficolin α,采用限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ对19T-Ficolin α重组质粒进行双酶切鉴定和测序分析,确定基因序列的正确性。

1.4 重组转移载体pFast-Ficolin α的构建

重组质粒19T-Ficolin α和转移载体pFastBacTM1进行EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切,回收所需片段,利用T4 DNA连接酶将pFastBacTM1和目的片段进行连接,转化至DH5α感受态细胞,提取质粒并进行双酶切鉴定,得到阳性重组转移载体pFast-Ficolin α。

1.5 重组转移载体pFast-Ficolin α与DH10Bac感受态细胞的转座反应

pFast-Ficolin α和pFastBacTM1分别转化DH10Bac感受态细胞,经三轮蓝白斑筛选得到重组穿梭质粒,利用通用引物pUC/M13进行PCR鉴定,PCR反应条件:93 ℃ 5 min,94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 5 min,循环35次,最后72 ℃ 10 min。获得的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,正确的命名为rBacmid-Ficolin α和rBacmid-pFast。

1.6 重组杆状病毒的构建和鉴定

参照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统操作手册,以CellfectinR Ⅱ为转染试剂,转染sf9单层细胞,转染后每24 h观察1次,直到细胞出现病毒感染现象,收获培养上清,提取病毒DNA,利用通用引物M13F/R进行PCR鉴定,得到的重组病毒命名为rBV-Ficolin α和rBV-pFast。

1.7 重组蛋白质的表达优化及纯化

重组病毒经传代提高滴度,用于蛋白质的表达,按最适密度将对数生长期的昆虫细胞接种于六孔板,分析种毒接种量(2.5、5.0、7.5、10.0 MOI)和表达时间(48、72、96、120 h)对目的蛋白质表达量的影响,待细胞完全出现病变,收获细胞,裂解后通过Western blot检测其表达情况,进一步利用Image J软件对优化表达的Western blot图片进行灰度分析,确定较佳表达条件。

按较佳种毒接种量感染昆虫细胞,于96 h收获细胞,加入裂解液,冰浴30 min后进行离心,使用Ni2+-Sepharose HisTrap HPTM镍柱纯化上清,收集蛋白峰对应的洗脱液,进行SDS-PAGE检测。

1.8 重组蛋白质抗病毒作用初步分析

对上述纯化的重组蛋白质经脱盐、过滤及浓度测定后进行抗PRRSV作用的初步分析。

预先将不同浓度的猪Ficolin α与PRRS病毒液于室温孵育20 min,然后于Marc-145细胞中测定病毒滴度,同时设立病毒对照和细胞对照,37 ℃ CO2培养箱吸附1 h,经PBS洗涤后更换成细胞维持液,观察并记录CPE形成情况,利用Reed-Muench法计算TCID50,进一步利用GraphPad Prism 6软件对TCID50进行Student’s t 检验分析。

同样的,预先将不同浓度的猪Ficolin α与PRRS病毒液于室温孵育,加于预先铺好的96孔板内,同时设立病毒对照和细胞对照,37 ℃ CO2培养箱吸附1 h,经PBS洗涤后更换成细胞维持液,48 h后倒掉上清,用冷甲醇固定15 min,以PRRSV GP5单抗及FITC标记的羊抗鼠IgG进行间接免疫荧光检测。

2 结果 2.1 重组质粒18T-Ficolin α的构建

PCR扩增带His标签的猪Ficolin α基因,产物在1%的琼脂糖凝胶电泳中显示约939 bp的片段(图 1),目的基因与T载体连接后,进行双酶切鉴定,经琼脂糖凝胶电泳检测,得到与预期大小一致的特异性条带(图 2),测序结果显示扩增片段与设计完全相符,成功构建了重组质粒18T-Ficolin α。

M. DL2000 DNA相对分子质量标准;1.目的基因 M. DL2000 DNA marker; 1. Target gene 图 1 猪Ficolin α基因的PCR扩增 Figure 1 PCR amplification of pig Ficolin α gene
M. DL10000 DNA相对分子质量标准;1~3.双酶切产物 M. DL10000 DNA marker; 1-3. Products after double-enzyme digestion 图 2 重组质粒18T-Ficolin α的双酶切鉴定 Figure 2 Identification of recombinant plasmid 18T-Ficolin α by double-enzyme digestion
2.2 重组转移载体pFast-Ficolin α的构建

pFastBacTM1和目的片段进行连接,转化DH10-Bac感受态细胞,提取质粒,进行双酶切鉴定,得到与预期大小一致的特异性条带(图 3),说明猪Ficolin α基因被正确插入到转移载体pFastBacTM1中。

M. DL10000 DNA相对分子质量标准;1~3.双酶切产物 M. DL10000 DNA marker; 1-3. Products after double-enzyme digestion 图 3 重组质粒pFast-Ficolin α的双酶切鉴定 Figure 3 Identification of recombinant plasmid pFast-Ficolin α by double-enzyme digestion
2.3 重组Bacmid的筛选及PCR鉴定

经三轮蓝白斑筛选制备重组Bacmid DNA,利用通用引物PUC/M13进行PCR鉴定,结果如图 4,rBacmid-Ficolin α、rBacmid-pFast及野生型Bacmid的PCR产物长度分别为3 239、2 300、300 bp,与预期大小一致,证明转座成功。

M. DL10000 DNA相对分子质量标准;1~3. rBacmid-Fiolin α DNA的PCR扩增产物;4~5. rBacmid-pFast DNA的PCR扩增产物;6.野生型Bacmid DNA的PCR扩增产物 M. DL10000 DNA marker; 1-3. PCR product of rBacmid-Fiolin α DNA; 4-5. PCR product of rBacmid-pFast DNA; 6. PCR product of wild Bacmid DNA 图 4 重组Bacmid DNA的PCR产物 Figure 4 PCR product of Bacmid DNA
2.4 重组杆状病毒的构建及鉴定

将rBacmid-Ficolin α和rBacmid-pFast转染sf9昆虫细胞144 h后细胞出现明显的病变,主要表现为细胞变圆变大,生长停止,细胞内出现颗粒状物质,细胞脱落,见图 5

图 5 sf9正常细胞及病变细胞形态图片 Figure 5 Morphological features of sf9 cells infected with recombinant baculovirus and normal sf9 cells

提取重组杆状病毒DNA,以M13引物进行PCR扩增,Ficolin α重组病毒(rBV-Ficolin α)、pFast病毒(rBV-pFast)、野毒扩增分别得到了3 029、2 300、300 bp的特异性片段,条带大小与预期一致,证明转染成功,可以用于蛋白质的表达(图 6)。

M. DL10000 DNA相对分子质量标准;2.重组毒株Ficolin α的PCR产物;3.重组毒pFast的PCR产物;4.野毒株的PCR产物 M. DL10000 DNA marker; 2. PCR product of rBV-Ficolin α; 3. PCR product of rBV-pFast; 4. PCR product of wild virus 图 6 重组杆状病毒PCR鉴定 Figure 6 Identification of recombinant baculovirus by PCR
2.5 重组蛋白的优化表达及纯化

利用鼠源抗His标签单克隆抗体,通过Western blot对表达产物进行鉴定,结果表明:重组猪Ficolin α为可溶性表达,破碎后上清在预期大小35 ku处有一条特异性条带,rBV-pFast及野毒感染的sf9细胞破碎后上清未出现该条带。为提高目的蛋白质表达量,对重组病毒感染量及表达时间进行了优化,通过Image J软件对优化表达的Western blot图片进行灰度分析,结果显示在接种量为7.5 MOI,收获时间为96 h的条件下目的蛋白质表达量最高,见图 7

A. Western blot图片(1~4.感染重组病毒rBV-Ficolin α的sf9细胞破碎后上清,感染量分别为2.5、5.0、7.5、10.0 MOI;M.蛋白质相对分子质量标准;5~8.感染重组病毒rBV-Ficolin α的sf9细胞破碎后上清,表达时间分别为48、72、96、120 h;9.感染重组病毒rBV-pFast的sf9细胞破碎后上清,阴性对照);B.灰度分析 A. Picture of Western blot (1-4. Supernant of sf9 cells infected with rBV-Ficolin α at MOI of 2.5、5.0、7.5、10.0;M. Protein molecular weight marker; 5-8. Supernant of sf9 cells infected with rBV-Ficolin α harvested at 48, 72, 96, 120 h; 9. Supernant of sf9 cells infected with rBV-pFast, negetive control); B. Gray level analysis 图 7 重组猪Ficolin α的Western blot检测 Figure 7 Dedection of porcine Ficolin α by Western blot

含有目标蛋白质的裂解后上清通过镍柱在AKTApurifier TM 10纯化系统上进行纯化,结果表明以400 mmol·L-1咪唑进行洗脱时,得到了单一的洗脱峰,对应的洗脱液经SDS-PAGE检测出现了单一的条带,由此获得了纯度较高的可溶性猪Ficolin α,见图 8

A.洗脱峰;B. SDS-PAGE检测(M.蛋白质相对分子质量标准;1.经镍柱纯化的猪Ficolin α) A. Elution peak; B. SDS-PAGE analysis (M. Protein molecular weight marker; 1.Porcine Ficolin α purified by a Ni2+ affinity column) 图 8 利用Ni2+亲和柱在AKTA purifierTM 10系统分离纯化重组猪Ficolin α及SDS-PAGE检测 Figure 8 Isolation of Ficolin α by AKTA purifierTM 10 on a Ni2+ affinity column and SDS-PAGE detection
2.6 重组猪Ficolin α抗病毒作用初步分析

结果表明重组猪Ficolin α能够与PRRSV结合且降低其对Marc-145细胞的感染。统计分析显示40 μg·mL-1重组猪Ficolin α呈现出较强的抗病毒作用,能够使病毒滴度从1.55×106·mL-1下降到0.28×106·mL-1(P < 0.001);20 μg·mL-1重组猪Ficolin α也表现出一定的抗病毒效果,能够使病毒滴度下降到0.71×106·mL-1 (P < 0.01);N-乙酰葡糖胺已被证明可以与Ficolin α进行结合,Ficolin α预先被N-乙酰葡糖胺饱和后,失去与PRRSV结合的能力,没有表现出抗病毒作用,与预期结果一致(图 9)。

*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 图 9 利用TCID50评价重组猪Ficolin α的体外抗PRRSV作用 Figure 9 Antiviral activity of porcine Ficolin α against PRRSV in vitro by TCID50

间接免疫荧光试验进一步表明猪Ficolin α能够降低PRRSV对Marc-145细胞的感染。病毒对照组在显微镜下观察可见很强的绿色荧光;40 μg·mL-1重组猪Ficolin α组仅见零星散在的荧光;细胞对照组未见非特异性荧光;Ficolin α预先被N-乙酰葡糖胺饱和后失去抗病毒作用,也出现了较强的绿色荧光荧光,与前面的结果一致(图 10)。

A.病毒对照;B. 40 μg·mL-1 Ficolin α+N-乙酰葡糖胺;C.细胞对照;D. 20 μg·mL-1 Ficolin α;E. 40 μg·mL-1 Ficolin α A. Virus control; B. 40 μg·mL-1 Ficolin α+GlcNAc; C. Cell control; D. 20 μg·mL-1 Ficolin α; E. 40 μg·mL-1 Ficolin α 图 10 利用间接免疫荧方法评价重组猪Ficolin α体外抗PRRSV作用 Figure 10 Antiviral activity of porcine Ficolin α against PRRSV in vitro by indirect immunofluorescence assay
3 讨论

Ficolin在机体的天然免疫中发挥着重要的作用,对于其功能的研究主要集中于补体激活、调理吞噬及炎症反应[15]。越来越多的研究显示Ficolin具有不依赖补体的抗病毒作用,其C端的糖识别结构域CRD作为一种糖类模式识别受体参与对病毒表面糖基的识别及结合。研究显示人体内3种Ficolin与GlcNAc都有较高的亲和性,但也存在着差异,L-Ficolin对葡萄糖无明显的亲和性,而H-Ficolin却能结合葡萄糖[15];大量研究显示人体内Ficolin可与人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、埃博拉病毒及立百病毒等多种病毒表面糖基结合而起到抗病毒作用,也能够与金黄色葡萄球菌、链球菌、胸膜肺炎放线杆菌及蜂房哈夫尼菌等G+/G-菌结合而起到抑菌作用[16],综上,人Ficolin具有较广泛的抗微生物谱。而兽医领域关于猪Ficolin的糖结合谱、微生物识别谱及其抗病毒活性和机制研究甚少。

许多研究[6, 10]中多采用从猪血浆中提取的方法获取Ficolin α,该方法操作繁琐,制备量小,不能满足长期研究需要,也有研究[17]利用中国仓鼠卵巢细胞(CHOK1)进行瞬时表达,由于转染效率存在差异,制备的目的蛋白质不适合进行长期研究;昆虫杆状病毒表达系统是一种有效的真核基因表达载体,系统操作简便、生产周期短;杆状病毒具有严格的宿主专一性,宿主仅限于昆虫和少数的无脊椎动物,无论对于操作本系统的科研人员还是应用重组蛋白质的靶动物本身都是安全的;另外昆虫细胞具有翻译后加工修饰的能力(如糖基化、磷酸化等),据文献统计,已有1 000余种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到了成功表达,其中约有95%的外源重组蛋白质能够被正确翻译后加工修饰,具有与天然蛋白质相同的生物活性。

用于本研究的目的蛋白质猪Ficolin α来源于哺乳动物,有糖基化位点,因此,为了获得有正确结构和修饰的活性蛋白质,选用昆虫杆状病毒表达系统。通过Western blot证明本研究制备的重组猪Ficolin α获得了成功表达,进一步研究显示重组猪Ficolin α具有与PRRSV结合的活性,并且能够降低PRRSV在Marc-145细胞上的感染。在人医领域包括Ficolin在内的多种凝集素已被列为抗HIV的潜在药物,也因此凝集素作为一类新型抗病毒药物越来越受到药物开发者的青睐。

4 结论

成功构建猪Ficolin α的重组杆状病毒,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明猪Ficolin α在sf9昆虫细胞中获得可溶性表达,并且具有抗PRRSV的活性,这为后期猪Ficolin α的抗病毒活性及抗病毒机制研究提供了物质基础。

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