2. 甘肃农业大学动物科学技术学院, 兰州 730070;
3. 河南农业大学牧医工程学院, 郑州 450002
2. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
3. College of Animal Husbandry and Veterinary Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
反刍动物瘤胃含有多种微生物，这些微生物彼此间相互作用，使瘤胃内环境处于相对稳定状态。犊牛出生后24 h内就已有微生物在体内定植，但3~6月龄犊牛瘤胃微生物区系未完全建立，所以此阶段犊牛所采食的饲粮对瘤胃微生物区系有重要影响[1]。有研究发现，动物品种、日龄、饲粮结构和季节等都会对瘤胃微生物产生影响[2]。B.Boots等[3]利用PCR技术研究发现，Neocallimastigales和assemblages的数量受日粮结构的影响显著；O.C.Shanks等[4]利用宏基因组测序法发现，饲喂方式也会影响瘤胃微生物区系。年龄对瘤胃微生物区系的影响较大，未断奶的犊牛乳酸杆菌和一定种类的蛋白水解菌占主要部分，随着固体饲粮和粗料的采食，瘤胃内微生物越来越丰富直到最后与成年相近。E.Jami等[5]通过宏基因组测序和实时荧光定量PCR技术对肉牛的研究发现，随着日龄的增加，瘤胃内严格厌氧菌逐渐代替了好氧和兼性厌氧菌，同时随着肉牛日龄的增加，瘤胃微生物区系越发完善。R.W.Li等[6]利用宏基因组测序同样得出日龄会影响瘤胃微生物区系。另外，瘤胃发酵参数是评价瘤胃健康的重要指标。有研究发现，随着饲粮精粗比的增加，瘤胃pH显著降低，NH3-N浓度显著升高，但总挥发性脂肪酸(TVFA)含量不受饲粮精粗比的影响[7-8]；但也有专家认为饲粮精粗比并不影响瘤胃pH[9]。瘤胃是反刍动物最主要的消化器官，饲粮结构会影响瘤胃发酵参数和微生物区系，但前人在3~6月龄犊牛上的研究较少，无法确定适宜的饲粮结构。
本试验对采食不同NFC/NDF水平的3~6月龄断奶公犊牛瘤胃发酵参数及微生物区系多样性进行研究，旨在探讨瘤胃发酵情况及微生物区系的变化。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点本试验于2015年10月15日-2016年4月22日在河南农业大学许昌试验基地进行。
1.2 试验材料本试验采用单因素试验设计。选用30头2~3月龄早期断奶夏杂公犊牛，平均体重(94.38±0.25) kg，随机分成2组，每组15头。根据犊牛体重和营养需要特点，参照中国《肉牛饲养标准》(2004)体重150 kg、日增重1.0 kg·d-1犊牛营养需要量，配制CP含量为11.7%左右，NFC/NDF水平分别为1.35(A组)和0.80(D组)的2种全混合饲粮(TMR)，其营养水平(干物质基础)见表 1。试验期105 d，其中预试期15 d，正试期90 d。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (dry matter basis) |
犊牛进场后清晨空腹称重，佩戴耳标，进行驱虫处理，再置于犊牛岛(4.5 m×1.5 m)内单栏饲养。给每头犊牛提供水槽、食槽，每周清粪和消毒各1次。干物质采食量按体重的3.3%供给全混合日粮，每天晨饲前收集每头牛的剩料量，计算每日采食量。
1.4 样品的收集与测定 1.4.1 瘤胃液试验正式开始后，每组选取6头体重接近本组平均水平、体况良好和健康的犊牛，分别在120、150和180日龄晨饲后2 h通过口腔真空抽取瘤胃液(弃去开始的50 mL以避免口腔唾液的影响)，其中一部分经过4层无菌纱布过滤，分装于2个10 mL离心管中，－20 ℃保存，用于测定VFA和NH3-N浓度。2管未过滤的立即投入液氮中保存，用于微生物的测定。
1.4.2 瘤胃pH测定用便携式pH计(testo-206-pH2)及时测定pH。
1.4.3 瘤胃液氨态氮和挥发性脂肪酸浓度测定用苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N浓度[11]，气相色谱法测定VFA浓度[12]。
1.4.4 微生物多样性的测定首先对瘤胃内容物中的DNA进行提取、PCR扩增和纯化，然后构建Miseq文库并进行测序。接着根据index和barcode序列区分各样本数据，且对数据进行处理，统计有效数据和确定优质序列长度分布。最后对所有序列进行OTU划分，采用RDP Classifier算法对OTU代表序列进行比对分析得到各群落物种信息(具体方法参照Omega厂家生产的E.Z.N.A.TM Soil DNA Kit试剂盒提取)。
1.5 数据分析试验数据用SAS 8.1软件中的MIXED过程进行单因子方差分析和显著性检验，差异显著时用LSD法进行多重比较检验。P < 0.05表示差异显著，0.05≤P < 0.10表示有显著差异的趋势。
2 结果 2.1 饲粮NFC/NDF水平对犊牛瘤胃发酵参数的影响由表 2可知，饲粮NFC/NDF水平对犊牛瘤胃液pH无显著影响(P>0.05)；NH3-N和乙酸浓度及乙/丙比例A组显著低于D组(P < 0.05)，而丙酸浓度则A组显著高于D组(P < 0.05)，TVFA和丁酸浓度不受影响(P>0.05)。
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表 2 不同NFC/NDF水平饲粮对120~180日龄犊牛瘤胃发酵参数的影响 Table 2 Effects of diets with different NFC/NDF levels on rumen fluid fermentation parameters in bull calves from 120 to 180 days old |
NH3-N浓度受日龄影响显著(P < 0.05)，其他指标不受日龄显著影响(P>0.05)。丙酸浓度受日龄和处理间交互作用的显著影响(P < 0.05)，其他指标不受日龄和处理间交互作用的显著影响(P>0.05)。
2.2 瘤胃内容物的PCR扩增如图 1所示，对不同样本基因DNA进行16S rDNA基因V3~V4区扩增，得到约500 bp的目的片段，扩增的条带大小正确，浓度合适且条带单一，说明纯化后基因组DNA中无抑制PCR反应的杂质，可以基于16S rDNA基因序列分析犊牛瘤胃微生物多样性。
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第6、14、15、19、20和31孔是A组犊牛120日龄瘤胃液样品；第3、8、17、25、28和33孔是D组犊牛120日龄瘤胃液样品；第7、9、11、29和35孔是A组犊牛150日龄瘤胃液样品；第4、5、16、21、22和27孔是D组犊牛150日龄瘤胃液样品；第2、10、13、23、26和34孔是A组犊牛180日龄瘤胃液样品；第1、12、18、24、30和32孔是D组犊牛180日龄瘤胃液样品 Lane 6, 14, 15, 19, 20 and 31 are the rumen fluid samples of calves in group A at 120 days old; Lane 3, 8, 17, 25, 28 and 33 are the rumen fluid samples of calves in group D at 120 days old; Lane 7, 9, 11, 29 and 35 are the rumen fluid samples of calves in group A at 150 days old; Lane 4, 5, 16, 21, 22 and 27 are the rumen fluid samples of calves in group D at 150 days old; Lane 2, 10, 13, 23, 26 and 34 are the rumen fluid samples of calves in group A at 180 days old; Lane 1, 12, 18, 24, 30 and 32 are the rumen fluid samples of calves in group D at 180 days old 图 1 琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果 Figure 1 Results of agarose gel electrophoresis for PCR |
利用QIME软件对微生物OTUs进行多样性分析，包括Chao1指数、Observed_species指数、PD_whole_tree指数和Shannon指数，这些指标数据越大，表示样品中的物种越丰富，各组文库覆盖率均在99%以上，说明每个样品测序量合理，可以很好地反映瘤胃中微生物群落种类和结构多样性。由表 3可知，D组各指标数均显著高于A组(P < 0.05)。
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表 3 不同NFC/NDF水平饲粮对120~180日龄犊牛瘤胃微生物多样性指数的影响 Table 3 Effects of diets with different NFC/NDF levels on rumen microbial diversity indices in bull calves from 120 to 180 days old |
除Shannon指数外，其他指标皆受日龄的显著影响(P < 0.05)；各指标不受处理和日龄两者交互作用的显著影响(P＞0.05)。
2.3.2 Venn图利用细菌群落中共享和独特的细菌丰度对采食不同NFC/NDF水平饲粮的犊牛瘤胃微生物进行分析，如图 2所示。在97%相似性水平下，2个处理组共产生1 713个OTU，其中A组和D组的OTU数量分别为1 281和1 596，2组共享了1 164个OTU，占细菌总OTU数目的67.95%，A组和D组独有的数目分别占细菌总OTU数目的6.83%和25.22%。
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左侧圆圈表示A组(S1)样品，右侧圆圈表示D组(S2)样品 The left circle represents the group A(S1), and the right circle represents the group D(S2) 图 2 犊牛瘤胃微生物多样性Venn图 Figure 2 The microbial diversity Venn of rumen microorganism in bull calves |
从表 4可以看出，在门水平(Phylum)上，A、D两组的优势菌群均为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)，它们的比例均占序列总数的1%以上。拟杆菌门的含量A组显著高于D组(P < 0.05)，厚壁菌门和变形菌门的含量不受饲粮NFC/NDF水平的显著影响(P＞0.05)。
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表 4 不同NFC/NDF水平饲粮对120~180日龄犊牛瘤胃微生物组成的影响 Table 4 Effects of diets with different NFC/NDF levels on rumen bacterial community in bull calves from 120 to 180 days old |
在属水平(Genus)上，A、D两组的优势菌群均为普雷沃氏菌属(Prevotella)，但其含量2组间差异不显著(P＞0.05)。Prevotellaceae_UCG-003和Christensenellaceae_R-7的含量A组显著低于D组(P < 0.05)；Eubacterium_coprostanoligenes和Lachnospiraceae_ND3007的含量有随饲粮中NFC/NDF水平的降低而降低的趋势(分别为P=0.087 5，P=0.078 9)；Rikenellaceae_RC9_gut的含量有随饲粮中NFC/NDF水平的降低而升高的趋势(P=0.052 6)，其他指标皆不受饲粮NFC/NDF水平的显著影响(P＞0.05)。
不论在门水平还是属水平上，各指标均不受日龄和日龄和处理两者交互作用的显著影响(P＞0.05)。
2.5 瘤胃微生物样本比较分析 2.5.1 瘤胃微生物相似性分析采用UPGMA法对犊牛瘤胃微生物DGGE图谱相似性分析如图 3所示。相同处理的犊牛瘤胃微生物除A511未聚合在一起，其他相同处理的犊牛相似性较高，聚在一起形成2大分支。该结果说明了不同NFC/NDF饲粮对瘤胃内微生物有影响。
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>A111、A211、A511、A512、A712和A812为犊牛A组120日龄瘤胃液样品，D211、D411、D711、D212、D412和D512为犊牛D组120日龄瘤胃液样品；A121、A221、A521、A522和A822为犊牛A组150日龄瘤胃液样品，D221、D421、D721、D222、D422和D522为犊牛D组150日龄瘤胃液样品；A131、A231、A531、A532、A732和A832为犊牛A组180日龄瘤胃液样品，D231、D431、D731、D232、D432和D532为犊牛D组180日龄瘤胃液样品 A111, A211, A511, A512, A712 and A812 are rumen fluid samples of calves in group A at 120 days old, D211, D411, D711, D212, D412 and D512 are rumen fluid samples of calves in group D at 120 days old; A121, A221, A521, A522 and A822 are rumen fluid samples of calves in group A at 150 days old, D221, D421, D721, D222, D422 and D522 are rumen fluid samples of calves in group D at 150 days old; A131, A231, A531, A532, A732 and A832 are rumen fluid samples of calves in group A at 180 days old, D231, D431, D731, D232, D432 and D532 are rumen fluid samples of calves in group D at 180 days old 图 3 犊牛瘤胃微生物相似性UPGMA分析 Figure 3 The UPGMA dendrogram for illustrating similarity of rumen microorganism in bull calf |
利用UniFrac PCA对采食不同NFC/NDF水平饲粮的犊牛瘤胃中细菌群落差异进行研究，通过系统进化距离来衡量样品间的距离，PCA可以将这种差异显示在二维或三维空间的PCA图上。由图 4可知，基于UniFrac加权主坐标分析其第一主成分和第二主成分的贡献率分别为13.82%和9.85%，采食不同NFC/NDF水平饲粮的犊牛瘤胃液样品中细菌群落结构差异明显，彼此间可以很好地分隔开，采食相同饲粮的样品可以很好地聚在一起，菌群相似度很高。
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图中圆点代表A组样品，三角形代表D组样品 The dots represent the samples in group A, and the triangles represent the samples in group D 图 4 犊牛瘤胃微生物主成分分析 Figure 4 The PCA of rumen microorganism in bull calf |
从图 5可以看出采食不同NFC/NDF水平饲粮后，A、D组的样本大部分分别在各自的圈内，且相互间无交集，说明采食不同NFC/NDF水平饲粮后瘤胃微生物组间有差异。
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图中三角形代表A组样品，圆点代表D组样品。NMDS.非度量多维尺度法 The triangles represent the samples in group A, and the dots represent the samples in group D. NMDS. Nonmetric multidimensional scaling 图 5 犊牛瘤胃微生物NMDS分析 Figure 5 The NMDS of rumen microorganism in bull calf |
瘤胃发酵情况可通过瘤胃液pH反映出来，瘤胃液pH受饲粮结构、饲粮各养分含量、唾液分泌量、食糜流速和瘤胃上皮对VFA的吸收程度等影响。瘤胃液pH随饲粮NFC水平的增加而显著降低[13-14]，高NFC饲粮所含的易发酵碳水化合物多，瘤胃微生物可对其进行快速发酵并产生大量VFA和有机酸，使瘤胃pH降低；但也有研究表明，饲粮NFC水平并不影响瘤胃pH的高低[9]。本试验中，动物处于瘤胃还未发育完全时期，对各养分并不能完全消化利用，所产生的挥发酸总量有限，又由于瘤胃上皮的吸收作用和唾液的缓冲作用，使瘤胃pH组间差异不显著；另外本试验通过口腔采集瘤胃液，可能混入了少量唾液，也会影响pH的测定结果。
饲粮中的含氮物质是瘤胃NH3-N的主要来源，其浓度受瘤胃对含氮物质降解速率和吸收速率的影响[15]，可反映微生物对氮的利用情况。有研究发现，微生物最适合生长的NH3-N浓度为6.3~27.5 mg·dL-1[16]，本试验NH3-N浓度在其范围内。提高饲粮NFC水平可增加微生物活性，进而提高饲粮中蛋白质的利用率和脱氨基作用，最终提高氮代谢，与之前的研究结果：高NFC/NDF组犊牛氮代谢高于其他组相符[17]。而刘洁等[18]发现，随着饲粮中NFC/NDF水平的增加，NH3-N浓度增加。NFC含量较高的饲粮分解后为微生物提供了更多的能量，提高了微生物活性，促进了微生物对饲粮蛋白质的降解；研究发现，采食高NFC饲粮降低了瘤胃pH，使释放的氨以NH4+的形式被固定，NH4+不易通过瘤胃壁被吸收，所以，以NH4+形式固定的氨增加，增加了NH3-N浓度[19-20]。但本试验结果却与之相反，可能是因为NH3-N浓度受微生物对发酵底物要求的限制[20]；另外，动物品种和所采食饲粮的不同也是造成结果差异的原因之一。
瘤胃发酵的主要产物为VFA，主要是通过对饲粮中碳水化合物发酵产生的。有研究发现，VFA为机体提供了70%~80%的能量，其中乙酸、丙酸和丁酸的含量共占总挥发性脂肪酸的95%左右[21]，因此乙酸、丙酸和丁酸浓度或其比例可以反映瘤胃的发酵情况。瘤胃发酵类型根据乙酸、丙酸和丁酸间的比例变化分为乙酸型、丙酸型和丁酸型，乙酸型和丙酸型发酵类型一般通过乙/丙比例确定[22]。有研究发现，降低饲粮中纤维含量或增加精料水平，TVFA皆增加[22-23]，因为高精料饲粮为微生物发酵提供了更多的发酵底物[22]。也有研究发现，饲粮精粗比对TVFA无显著影响，但饲粮中精料水平增加，丙酸比例增加，粗料水平增加，乙酸比例增加[24-25]。增加饲粮中NFC水平后瘤胃中淀粉分解菌占优势，而增加粗料水平后纤维分解菌占优势[26]。本试验中，随着饲粮NFC/NDF水平的降低，TVFA中乙酸的比例增加，而丙酸的比例降低，导致乙/丙比显著增加，说明饲粮NFC含量降低可推动犊牛瘤胃发酵类型从丙酸型向乙酸型转变。饲喂的精料较多，可溶性碳水化合物比例提高，在相同采食量情况下，可促进犊牛增重[27]。3~6月龄犊牛瘤胃发育尚有待提高，对纤维性物质的消化能力与成年牛相比较弱，由纤维消化产物供能的能力较低，更适合饲喂精料比例较高的饲粮。
3.2 DNA提取与扩增原核生物16S rDNA编码的rRNA长度约为1 500 bp，由于不同细菌序列潜在的多样性，暗示其在分类鉴定细菌时可以利用[28-29]。有研究发现，测序区域会对试验结果产生影响[9]。瘤胃微生物DNA的提取方法有直接法和间接法两种，两者的区别在于，用直接法提取微生物基因组DNA较方便、稳定且高效，但提取的DNA中含有的杂质可能会抑制下游的反应；间接法提取的DNA纯度高，但这种方法费时且费力，而且黏附在饲粮表面的颗粒可能无法提取出。有研究发现，这两种方法均可以得到高质量的DNA[30]，本试验采用直接法提取到的DNA经PCR扩增后的长度为360~480 bp，条带清晰透明，可用于后续试验。
3.3 OTUs基础分析结果多样性指数虽不能直接反映样品由哪些微生物群落组成，但可以反映微生物群落种类和结构的多样性，即微生物的丰富情况；Venn图可以很直观的展示在97%相似水平下各样品独有和共享的OTU数，即可以很直观地看出各样品是否不同。
3.4 分类学分析结果J.J.Qin等[31]和R.E.Ley等[32]研究表明，反刍动物瘤胃微生物中的优势菌群为厚壁菌门和拟杆菌门，且其优势地位不随饲粮中的纤维和淀粉水平的改变而改变[33]，本试验得到与之相同的结果。说明其对饲粮的降解有重要作用。拟杆菌门在非纤维物质的降解中发挥重要作用，厚壁菌门则主要是分解纤维类物质[34]。非纤维物质经瘤胃微生物发酵后丙酸产量增加，瘤胃发酵类型主要是丙酸型，而纤维类物质经发酵后乙酸浓度增加，瘤胃发酵类型主要是乙酸型。本研究中，随着饲粮NFC水平的降低，厚壁菌门的含量有所降低但差异不显著，但本课题组之前的研究发现，NDF表观消化率1.35组高于0.80组[27]，可能是因为其他菌对其进行了消化分解，有研究发现，瘤胃中的纤维水解酶大约有一半来自于原虫[35]。同时1.35组拟杆菌门含量显著高于0.80组，对非纤维物质的表观消化率高，有机物表观消化率高，最终促进了犊牛生长[27]。M.Kim等[36]和R.M.Petri等[37]通过16S rRNA对肉牛粪便和瘤胃中的微生物V1~V3区域进行研究，结果也发现，与采食高谷物饲粮的肉牛相比，采食高粗料饲粮的肉牛粪便和瘤胃中的拟杆菌门含量显著降低。而M.J.Ellison等[38]和韩旭峰[39]结果则不同，归结于动物品种和测序区域的不同[40]。
K.Tajima等[41]发现，Prevotella的含量随饲粮中NDF含量的增加而降低，说明其对于精料的分解有重要作用。E.Jami等[33]发现，Prevotella在瘤胃中的含量不受饲粮结构的影响，且一直处于优势地位，与本试验结果基本一致。说明Prevotella是犊牛瘤胃优势菌群。但在本试验结果中，Prevotellaceae_UCG-003的含量0.80组显著高于1.35组，可能是因为0.80组饲粮适口性差，犊牛出现挑食。有研究发现，当机体采食高精料饲粮时，优先选择采食粗料；而当采食高粗料饲粮时，优先选择采食精料[42]。Prevotella主要是对饲粮中的淀粉进行降解[43]，所以本试验中采食1.35组饲粮后，丙酸含量增加。W. Huo等[44]却发现，山羊采食干草后瘤胃中的Prevotella的含量增加，可能是由于动物品种和饲粮不同造成的差异。Christensenellaceae_R-7主要与乙酸的产量有关，所以本试验中乙酸含量0.80组高于1.35组。瘤胃pH会影响微生物活性，pH过低不利于纤维分解菌等恶酸性菌的生存，但pH过高又不利于淀粉分解菌等喜酸性菌的生存。但本试验中瘤胃pH组间差异不显著，未对各菌的活性产生影响，所以本课题组之前的研究发现，采食1.35组饲粮的犊牛各营养物质的消化率基本最高，且生长速度最快[27]。
3.5 日龄对夏南杂交犊牛瘤胃微生物区系的影响日龄会影响胃肠道内微生物组成[41]。韩旭峰[39]发现，断奶后的陕北白绒山羊瘤胃内的优势菌群在80~100日龄时为厚壁菌门和互养菌门(Synergistetes)，而在110 d时为拟杆菌门和厚壁菌门。有研究发现，哺乳动物胃肠道内的优势菌群为拟杆菌门和厚壁菌门，且在110日龄时更接近成年羊[39]。E.Jami等[33]也发现，随着日龄的增加，动物体内的拟杆菌门从1~3日龄时较少到逐渐成为优势菌群。在本试验中，日龄并未对瘤胃微生物组成产生影响，但显著或极显著增加了微生物的种类和丰富度，说明瘤胃微生物区系随着日龄的增加趋于完善，对营养物质的表观消化率增加[27]。E.Jami等[33]利用高通量测序发现，肉牛瘤胃内的优势菌群为普雷沃氏菌，且在总测序序列中占52%，韩旭峰[39]也发现，Prevotella的含量随着日龄的增加而增加，且在山羊110日龄时成为优势菌群。Prevotella具有对饲粮中的蛋白质进行消化利用的功能[44]，本试验饲粮蛋白水平相近，所以Prevotella含量组间无显著差异。
4 结论采食高NFC饲粮降低了犊牛瘤胃微生物的种类和丰富度，对属水平部分菌含量也有影响，最终影响了瘤胃液中各挥发性脂肪酸所占比例。120~180日龄犊牛瘤胃液中，在门水平上的优势菌群皆为厚壁菌门和拟杆菌门，属水平上的优势菌群为普雷沃氏菌属。
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