淀粉是日粮中最为重要的能量来源,尤其对于单胃哺乳动物更重要[1]。淀粉最为主要的生理学功能就是在肠道中被消化水解成葡萄糖,为机体提供能量[2]。淀粉分解的葡萄糖被吸收后,在机体中可以经过糖酵解途径产生乙酰CoA或α-酮酸,其中乙酰CoA用于脂肪酸的合成,α-酮酸可作为碳骨架用于非必需氨基酸的合成。
前人研究发现,淀粉因直链淀粉和支链淀粉比例不同导致其在单胃哺乳动物肠道中有不同的消化率,按照其直链淀粉/支链淀粉比例由低到高,消化速率由快到慢,可将其分为快速消化淀粉(RDS)、慢速消化淀粉(SDS)以及抗性淀粉(RS)[3],从而导致代谢反应变化差异较大[4-5]。低直支链淀粉比例日粮被快速消化,导致血糖急剧的升高和降低以及更强烈的胰岛素反应[6-8],从而上调了脂肪合成[9-10];而高直支链淀粉比例日粮提供一个更为平稳的血糖指数以及胰岛素反应[1, 11]。不同淀粉类型日粮对不同生长阶段猪空肠消化蛋白质与吸收氨基酸(AA)有不同的影响。在断奶和生长阶段,SDS日粮显著增加了肝门静脉循环中AA表观流动率,并提高了对氮营养素的利用率[12-13]。然而,F.G.Yin等[5]的研究发现,提高断奶仔猪日粮中支链淀粉含量有助于提高日粮AA的表观回肠末端消化率,从而提高对日粮AA的利用率。与此同时,本实验室之前研究发现,相比于饲喂蜡质玉米淀粉日粮,饲喂豌豆淀粉日粮的育肥猪能够显著提高平均日增重和降低料重比[14]。近些年来,关于不同淀粉类型日粮对育肥猪消化影响的研究一般只停留在养分消化率上[15-16],很少对肠道消化酶活和营养素感受体及转运载体进行深入的研究。
因此,本试验拟通过研究不同淀粉类型日粮对育肥猪肠道消化吸收以及血清生化指标和激素水平的影响,从消化吸收代谢角度来揭示豌豆淀粉(高直支链淀粉比例)日粮是如何提高育肥猪生长性能的,以期为合理利用淀粉原料配合育肥猪日粮提供科学依据和理论指导。
1 材料与方法 1.1 试验动物与设计本试验采取单因素试验设计,选取健康、初始体重相近((68±2.0) kg)的大×长×梅山三元杂交去势公猪90头,随机分配给3个日粮处理组,每组5个重复(圈),每个重复6头猪,试验期28 d。试验在江苏省农科院六合动物科学实验基地进行。
1.2 试验日粮和营养水平本试验采用纯的蜡质玉米淀粉(Waxy maize starch,WMS)、非蜡质玉米淀粉(Nonwaxy maize starch,NMS)、豌豆淀粉(Pea starch,PS)作为唯一淀粉来源,根据NRC(2012) [17]75~100 kg育肥猪营养需要配置3种等能等氮试验日粮。营养成分按照“中国饲料数据库”的推荐值计算[18]。3种日粮的总淀粉含量均为51.1%,其中直链淀粉/支链淀粉的比例分别为0.07、0.19和0.28,日粮的组成及营养水平见表 1。
试验期结束当天,每圈选取体重接近平均体重的2头猪(10头/处理,总共30头),将所选取的猪送至淮安苏食有限公司屠宰场。宰前禁食12 h,自由饮水,按照常规的流程进行屠宰。电击晕后前腔静脉采血,用10 mL离心管采集血液,之后在4 ℃ 3 000 r·min-1离心10 min,吸取上清液,将血清分装后于-20 ℃冰箱保存并待测。采集空肠黏膜,用0.9%的生理盐水洗净肠道内容物,滤纸吸干后刮取黏膜分装于冻存管,放入液氮中保存待测。
1.4 指标测定及方法 1.4.1 日粮直链淀粉/支链淀粉的比例测定日粮中直链淀粉/支链淀粉的比例采用直链淀粉/支链淀粉测定试剂盒(Megazyme,爱尔兰)进行测定。WMS、NMS和PS 3种日粮的直链淀粉/支链淀粉的比例分别为0.07、0.19和0.28。
1.4.2 空肠黏膜消化酶活性测定取空肠黏膜按质量比1:9加入预冷的0.9%生理盐水,冰浴匀浆,3 000 r·min-1离心10 min,取上清液保存于-20 ℃冰箱待测。空肠黏膜中二糖酶(蔗糖酶和麦芽糖酶)测定步骤按照说明书进行,所需测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.4.3 空肠黏膜营养素感受体及转运载体mRNA相对表达量的测定取出-80 ℃保存的空肠黏膜样品约100 mg,用Trizol试剂(Invitrogen,中国)提取总RNA。用紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度,其中所有RNA样品的OD260 nm/OD280 nm比值均为1.8~2.0,并用0.1%焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate,DEPC)水将RNA稀释到同一质量浓度500 ng·μL-1。稀释后的RNA以20 μL反转录反应体系,用TaKaRa的反转录试剂盒按说明书的方法和步骤进行逆转录成互补脱氧核糖核酸(cDNA)。反转录的反应参数:37 ℃ 15 min,3个循环;85 ℃ 5 s。cDNA保存于-20 ℃备用。基因引物序列见表 2。
RT-PCR采用20 μL反应体系:10 μL SYBR(TaKaRa,中国),上、下游引物各0.4 μL,Rox Reference Dye(50 ×)0.4 μL(TaKaRa,中国),6.8 μL无RNA水和2 μL cDNA模板。PCR反应步骤:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40个循环。每个样品做3个重复,以β-actin作为内参基因,用2-△△CT方法[19]对mRNA基因表达水平结果进行统计。
1.4.4 血清生化指标测定利用全自动生化分析仪测定血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、葡萄糖(Glu)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)的含量。试剂盒均购自北京利德曼生化股份有限公司。
1.4.5 血清激素水平测定血清中三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4)、胰岛素(INS)和胰高血糖素(GC)水平采用放射性免疫法测定,测定试剂盒均购自北方生物技术有限公司。
1.5 统计分析试验数据先以Excel初步处理后,利用SPSS Statistics 20.0中的One-way ANOVA进行单因素方差分析和LSD多重比较。试验数据以圈为单位进行统计[n=5(每圈选取体重接近平均体重的2头猪)]。结果以“平均值±标准误”表示,P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 不同淀粉类型日粮对育肥猪空肠黏膜消化酶活性的影响由表 3可知,不同淀粉类型日粮对育肥猪空肠黏膜的麦芽糖酶和蔗糖酶活性并无显著影响(P>0.05)。
由图 1可知,与饲喂WMS日粮的育肥猪相比,育肥猪饲喂PS日粮显著降低了味觉受体家族1成员2(T1R2)与味觉受体家族1成员3(T1R3)的mRNA表达水平(P < 0.05)。
由图 2可知,相比于饲喂WMS日粮,PS和NMS日粮显著下调钠/葡萄糖协同转运蛋白1(SGLT1)和葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)的mRNA表达水平(P < 0.05)。
由图 3可知,与WMS日粮相比,PS日粮显著提高了可溶性载体家族1成员5(SLC1A5)的mRNA表达水平(P < 0.05),NMS日粮显著提高了可溶性载体家族7成员7(SLC7A7)的mRNA表达水平(P < 0.05),在可溶性载体家族6成员19(SLC6A19)和可溶性载体家族7成员9(SLC7A9)的mRNA表达水平上3组日粮间并无显著差异(P>0.05)。
由表 4可知,不同淀粉类型日粮对育肥猪血清中ALT、AST、Glu、BUN、TC和TG含量无显著影响(P>0.05)。相比于WMS日粮,PS和NMS日粮显著降低了血清中的FFA含量(P < 0.05)。
由表 5可知,不同淀粉类型日粮对育肥猪血清中的T3、T4、INS和GC水平无显著影响(P>0.05)。
淀粉是单胃哺乳动物最为重要的能量来源,不同淀粉类型其消化率差异较大[4-5]。低直支链比例淀粉易于水解消化,而高直支链比例淀粉水解消化更慢,可作为慢速消化淀粉为机体提供能量。麦芽糖酶和蔗糖酶皆由小肠分泌,于小肠刷状缘处对二糖进行水解产生葡萄糖和果糖[20]。本试验结果表明,不同淀粉类型日粮对育肥猪空肠黏膜的麦芽糖酶和蔗糖酶无显著影响,这可能与育肥猪的消化器官发育成熟,消化道内消化酶活性相对稳定且与底物过量有关[21-22]。
3.2 不同淀粉类型日粮对育肥猪空肠黏膜营养素感受体及转运载体的影响低直支链淀粉比例日粮能导致血糖浓度急剧的升高与降低和更强的胰岛素反应[6-8],促进脂肪的合成与沉积[9-10],高直支链淀粉比例日粮会导致一个更为平稳的血糖浓度与胰岛素反应[1, 11]。本试验发现,不同淀粉类型日粮对育肥猪空肠黏膜消化葡萄糖无显著影响,进一步对空肠黏膜吸收葡萄糖进行研究,发现了一个有趣的结果,饲喂PS日粮育肥猪的空肠黏膜上的甜味感受体T1R2/T1R3的mRNA表达水平显著的低于饲喂WMS日粮的育肥猪。而J.Dyer与O.J.Mace等[23-24]发现,随着肠道吸收葡萄糖的增加,肠道甜味感受体T1R2/T1R3的mRNA表达水平显著提高。与此同时,饲喂PS和NMS日粮育肥猪的空肠黏膜上SGLT1和GLUT2的mRNA表达水平显著的低于饲喂WMS日粮育肥猪,说明饲喂WMS日粮育肥猪的空肠黏膜吸收转运葡萄糖的效率显著高于饲喂PS和NMS日粮的育肥猪。因此低直支链淀粉比例日粮可能是通过上调空肠黏膜上的甜味感受体mRNA表达水平,提高对葡萄糖的感应,促进葡萄糖转运载体mRNA表达水平,提高空肠黏膜对葡萄糖吸收的速率,最终导致血糖浓度急剧的升高,这与前人的研究结果一致[6-8]。
日粮AA是小肠黏膜细胞的主要供能物质之一,也是小肠合成蛋白质、谷胱甘肽等物质的前体物质。有研究表明,淀粉在空肠中水解产生的葡萄糖除了参与机体能量代谢外,还能作为一个信号分子调控AA的转运及骨骼肌的合成[25-26]。本试验发现,饲喂WMS日粮育肥猪的SLC1A5和SLC7A7 mRNA表达水平分别显著的低于饲喂PS和NMS日粮的育肥猪,这可能是因为WMS日粮显著提高了SGLT1的mRNA表达,然后葡萄糖与钠离子一起结合SGLT1协同转运到小肠黏膜细胞内,增加了与钠离子依赖性氨基酸转运载体对钠离子的竞争,其中SLC1A5与SLC7A7都是钠离子依赖性氨基酸转运载体[27]。PS和NMS日粮显著增加吸收进入外周血液循环的AA,减少了AA在小肠细胞中被氧化,节约了AA的消耗。
3.3 不同淀粉类型日粮对育肥猪血清生化指标的影响血糖是机体细胞首要的供能物质来源。低直支链淀粉比例日粮能导致一个更强的血糖指数和胰岛素反应[6-8]。而在本试验中,不同淀粉类型日粮对血糖含量并没有显著影响,这可能归结于血样的采集时间是在禁食12 h之后进行,与J.He等[10]的试验结果一致。前人的研究发现,淀粉在小肠中消化留存的时间大概为4 h,餐后血糖的变化也是呈周期性的,因此在禁食12 h后,血清中的葡萄糖含量趋近于维持正常生理范围以内[4]。
血清中FFA的唯一来源是脂肪组织的动员,当血糖迅速降低,葡萄糖不再进入脂肪细胞,糖酵解速度减慢,甘油-3-磷酸的产量降低,于是脂肪酸的酯化作用减弱,脂肪动员释入血清中的脂肪酸增加。本试验中,饲喂WMS日粮育肥猪血清中FFA含量显著高于其他2组,可能与饲喂WMS日粮的育肥猪在低血糖的情况下机体脂肪有更多的动员有关,具体原因还有待进一步研究。而不同淀粉类型日粮对育肥猪血清中TG、TC含量无显著影响,可能与育肥猪禁食状态有关。AST、ALT的活性是反映肝合成蛋白质功能的重要指标,而BUN的含量反映的是动物机体对蛋白质的利用率。然而,不同淀粉类型日粮对育肥猪血清中AST、ALT以及BUN含量无显著影响。这说明不同淀粉类型日粮对育肥猪肝等组织的蛋白代谢未产生影响。
3.4 不同淀粉类型日粮对育肥猪血清激素水平的影响T3和T4是动物机体正常生理机能所需的激素,影响着几乎全部机体的生理过程,在生长发育、代谢、体温和心率等方面都起着重要作用[28]。本试验结果表明,不同淀粉类型日粮对育肥猪血清中T3和T4水平无显著影响。血清中的INS是机体中的降血糖激素,可促进葡萄糖进入脂肪、肝和骨骼肌细胞,用于合成脂肪、糖原和蛋白质[29]。GC和INS是胰岛组织不同细胞分泌的一对血糖水平调控的拮抗分子。J.Deng等[7]发现,低直支链淀粉比例日粮会导致血清中INS水平的升高。同时于长宁等[30]发现,日粮淀粉水平升高能提高血清INS水平。然而本试验中,不同淀粉类型日粮对血清中INS水平的影响并无显著差异,与李丰隆[16]的试验结果一致,可能与禁食12 h导致血糖降低到维持正常生理代谢水平范围有关。同时,不同淀粉类型日粮对育肥猪血清中GC水平也无显著影响,可能是饲喂WMS日粮育肥猪在一定程度上依靠动员体脂供能,从而维持血糖的平稳。
4 结论不同淀粉类型日粮对育肥猪空肠黏膜消化酶活性与血清生化指标和激素水平并无显著影响,高直支链淀粉比例日粮显著下调了甜味感受体、葡萄糖转运载体mRNA表达水平,提高了部分氨基酸转运载体mRNA表达水平,减弱了对葡萄糖的吸收,有利于对氨基酸的吸收。
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