氨基酸平衡低蛋白质日粮是提高氮的利用率、减少氮排放的有效手段之一。蛋白质资源的不足与晶体氨基酸的出现，使低蛋白氨基酸平衡日粮的研究必要而且可行。有研究表明，适当降低猪日粮蛋白质水平的同时平衡赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苏氨酸(Trp)、色氨酸(Thr)能显著降低尿氮的排放和提高氮的利用效率[1]。而将日粮蛋白水平降低4个百分点以下时，即使平衡4种必需氨基酸(Lys、Met、Trp、Thr)猪的生长性能仍然受到明显的抑制[2]。在平衡4种必需氨基酸的基础上补充支链氨基酸对于维持正常的生长性能起到重要的作用[3]。研究表明，胃肠道通过代谢氨基酸来获取能量，其中谷氨酸是主要的能源物质[4]，日粮中添加谷氨酸钠能提高空肠对其他氨基酸的吸收，提高日粮谷氨酸的水平有利于减少消化道对其他氨基酸的能量代谢[5]。肠道微生物通过代谢消化道中的营养物质维持自身生长，影响宿主的营养和健康。氨基酸不仅是日粮的主要成分和蛋白质的基本构成单位，而且具有调节能氮平衡的功能，因此为了提高营养物质的利用率，氨基酸平衡是必须考虑的因素[6]。体外试验表明，以不同氨基酸为底物的培养基所得优势菌群并不相同，因此消化道内游离氨基酸浓度可能对微生物群落组成和丰度产生影响[7]。此外，营养不良特别是氨基酸缺乏显著增加动物腹泻率、肠道通透性和细菌易位的几率[8]，而动物肠道菌群易位、通透性增加又与肠黏膜上皮抗菌肽的减少密切相关[9]。日粮添加氨基酸能改善肠道抗菌肽的表达，并能维持肠道微生物内稳态，继而减少肠道对炎症的易感性[10]。由此可见，日粮氨基酸平衡对肠道抗菌肽表达和微生物区系平衡起到重要作用。目前关于氨基酸平衡低蛋白日粮对动物生长性能、氮代谢影响的研究非常丰富，而对消化道微生物和抗菌肽基因表达的影响研究却较少。
本研究以生长育肥猪为试验动物，降低日粮蛋白质水平的同时平衡关键氨基酸及谷氨酸，探索氨基酸平衡低蛋白日粮对氮代谢、肠道微生物区系和肠道抗菌肽基因表达的影响。
1 材料与方法 1.1 试验设计选购体重为(60±2.5) kg的健康三元杂交去势育肥猪(杜洛克×长白×大约克)20头，采用单因素完全随机分组试验设计，分为4个处理：14.0% CP日粮(14.0% CP)，添加Glu、Lys、Met、Thr和Trp的12.5%CP日粮(12.5% CP)，添加Glu、Lys、Met、Thr和Trp的11.0%CP日粮(11.0% CP)，添加Glu、Lys、Met、Thr、Trp和BCAA(Val、Ile、Leu)的11.0%CP日粮(11.0% CP+BCAA)。每个处理5个重复，每个重复1头猪。试验基础日粮参照NRC(2012) [11]标准设计，日粮组成和营养水平见表 1。各处理中Glu和最后一组BCAA的添加量是以达到14.0%CP组Glu和BCAA水平为依据。试验在全封闭高床猪舍进行，每日于08:00、12:00和18:00共投料3次，自由饮水。试验期为35 d(5 d预试期和30 d正试期)。
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表 1 日粮组成及其营养水平1(干物质基础) Table 1 The compositions and nutrition levels of diets1 (DM basis) |
试验结束后，前腔静脉采血，屠宰打开腹腔。采集10 mL尿液，4 ℃保存，用于尿液相关指标测定。用载玻片刮取空肠黏膜、回肠黏膜于灭菌的锡箔纸，液氮速冻后-80 ℃保存，用于蛋白水平和mRNA丰度测定。无菌采集回肠、直肠食糜(20 g)于封口袋中，4 ℃保存，用于菌体氨基酸组成测定。无菌采集盲肠内容物(2 g)于1.5 mL离心管中，-80 ℃保存，用于肠道微生物16S RNA测序。
1.3 尿液指标测定尿液尿素氮、尿酸、尿胆红素含量测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。采用紫外分光光度计，按试剂盒说明书进行操作。
1.4 Western blot检测β-defensin-2蛋白水平取100 mg黏膜组织样，加入1 mL RIPA蛋白裂解液进行匀浆，离心分离上清，采用紫外分光光度计测定总蛋白浓度；根据蛋白结果用灭菌去离子水将总蛋白浓度调成一致，待测。每个泳道上样量为30 μL，采用15%分离胶，5%浓缩胶对样品蛋白进行分离，分离后的蛋白常温电转移约30 min至硝酸纤维素膜上(PVDF)，将PVDF膜置于Millipore孵育加速器上，用1×TBST洗膜3次后，加封闭液(购自Millipore)封闭3次，间隔3~5 min。加入用封闭液稀释的兔抗猪多抗β-defensins-2(1:1 000，Abcam)和β-actin(1:1 000，CST)孵育3次，间隔3~5 min。TBST洗膜3~5次后，加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG抗体(1:5 000，LifeSpan BioSciences)，孵育3次，间隔3~5 min，用1×TBST洗膜3次，取出PVDF膜于TBST备用。显影液与定影液1:1混合后，立即加到PVDF膜上，放入SmartChemi成像系统拍照保存，用GIS1000分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化，并将目的蛋白的灰度值除以内参β-actin的灰度值以校正误差。
1.5 荧光定量PCR法检测回肠黏膜抗菌肽基因mRNA相对表达量根据GenBank猪3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease gene，GAPDH)、血管紧张素-1(Angiopoietin-1, ANG1)、血管紧张素-4(Angiopoietin-4，ANG4)、脂肪酸结合蛋白(Fatty acid-binding protein，FABP2)的基因序列，采用DNA MAN设计引物，并用NCBI中Blast初步检测引物的特异性。引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列见表 2。
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表 2 回肠黏膜基因引物序列 Table 2 Primers used to amplify jejunum mucosa genes |
按照Trizol(购自Invitrogen)说明提取组织总RNA，并用核酸测定仪测量OD值，OD260 nm/OD280 nm为1.8~2.0的样品用于下一步试验。cDNA合成按反转录试剂盒(购自Promega)操作，反转录后的cDNA于－20 ℃保存备用，－80 ℃长期保存。
每个样品2个重复，Real-time PCR反应体系(10 μL)：cDNA 1 μL，SYBR(2×)5 μL，ROX 0.2 μL，Primer S(10 μmol·L-1)0.2 μL，Primer A(10 μmol·L-1)0.2 μL，DEPC-H2O 3.4 μL。反应程序：预变性(94 ℃ 30 s)，接下来40个循环(94 ℃ 5 s，55 ℃ 20 s，72 20 s)。
1.6 回肠和直肠微生物菌体氨基酸组成测定回肠和直肠微生物的分离参照赖星等[12]的方法进行。微生物菌体氨基酸组成采用全自动氨基酸分析仪测定。具体操作：准确称取样品0.8 mL于15 mm×150 mm试管中，向盛有样品的试管中加入0.8 mL盐酸(6 mol·L-1)，振荡混匀。用酒精喷灯把该试管口下1/3处拉细到4~6 mm，抽真空10 min后封管。处理过的试管置(110±1) ℃恒温烘箱中沙浴水解22 h，拿出冷至室温，转移离心，取1 mL滤液于50 mL烧杯中，用60 ℃恒温水浴蒸干滤液，加入0.02 mol·L-1盐酸1 mL，用0.22 μm滤膜过滤上机分析。
1.7 盲肠微生物区系测序测序的盲肠微生物DNA参照MO BIO公司的PowerFecal® DNA Isolation Kit试剂盒说明提取。盲肠微生物DNA委托罗宁生物公司进行16S RNA测序。简要程序：样本DNA纯化以后，用带有特定条码的特异性引物对样本的16S rDNA的V4区域进行扩增，PCR产物电泳检测后回收，用Qubit 2.0进行定量检测。然后用Illumina公司的TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit构建文库，MiSeq Reagent Kit v2测序。MiSeq测序得到的原始序列经过FLASH3拼接、质控、去除低质量碱基及接头污染序列等得到可供后续分析的高质量目标序列，最后用Silva等数据库、PyNAST算法、QIIME、Mothur和R等软件对样本进行分析。
1.8 数据统计分析采用SAS9.0统计软件GLM程序进行方差分析，差异显著性分析用LSD进行多重比较，数据采用平均值、SEM和P值表示；基因表达量分析以内参为对照，采用2-△△Ct法进行比较，对照组平均值归一法[6]。
2 结果 2.1 氨基酸平衡低蛋白质日粮对尿液指标的影响如表 2所示，不同蛋白质水平日粮能显著影响育肥猪尿液尿素氮和尿酸含量(P < 0.05)，随着日粮蛋白质水平的降低，尿液尿素氮和尿酸含量显著下降(P < 0.05)。14.0%CP组尿液尿素氮含量显著高于12.5%CP组、11.0%CP组和11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，12.5%CP组尿液尿素氮含量显著高于11.0%CP组和11.0%CP +BCAA组(P < 0.05)，11.0%CP组尿液尿素氮含量显著高于11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)。14.0%CP组尿酸含量显著高于12.5%CP组、11.0%CP组和11.0% CP+BCAA组(P < 0.05)，12.5%CP组与11.0%CP组2组间尿酸含量差异不显著(P>0.05)，2组尿酸含量均显著高于11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)。4个组中尿胆红素均为阴性。
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表 3 氨基酸平衡低蛋白质日粮对育肥猪尿液指标的影响(n=5) Table 3 The effect of the low protein level diets with balanced amino acids on urea parameters of fattening pigs (n=5) |
如图 1所示，不同蛋白质水平氨基酸平衡日粮对空肠和回肠黏膜β-defensin-2浓度有显著影响(P < 0.05)。11.0%CP组猪空肠黏膜β-defensin-2浓度显著低于14.0%CP组、12.5%CP组以及11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，14.0%CP组空肠黏膜β-defensin-2浓度显著高于12.5%CP组(P < 0.05)，11.0%CP+BCAA组与14.0%CP组、12.5%CP组间空肠黏膜β-defensin-2浓度差异不显著(P>0.05)。11.0%CP组猪回肠黏膜β-defensin-2浓度显著低于14.0%CP组和11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，12.5%CP组回肠黏膜β-defensin-2浓度显著低于11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，其余组间差异不显著(P>0.05)。
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图 1 氨基酸平衡低蛋白质日粮对空肠和回肠黏膜β-defensin-2蛋白水平的影响(n=5) Figure 1 The effect of the low protein level diets with balanced amino acids on the concentration of β-defensin-2 in jejunum and ileal mucosa (n=5) |
如表 4所示，不同蛋白质氨基酸平衡日粮对回肠黏膜抗菌肽基因mRNA相对丰度有显著影响(P < 0.05)。11.0%CP组猪回肠黏膜ANG1 mRNA的相对丰度显著低于其他3组(P < 0.05)，14.0CP%组猪回肠黏膜ANG1 mRNA相对丰度显著高于11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，12.5%CP组猪回肠黏膜ANG1 mRNA相对丰度与14.0CP%组、11.0%CP+BCAA组组间差异均不显著(P>0.05)。11.0%CP组猪回肠黏膜ANG4 mRNA的相对丰度显著低于其他3组，其他3组间差异不显著(P>0.05)。4组间猪回肠黏膜FABP2 mRNA相对丰度差异不显著(P>0.05)。
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表 4 氨基酸平衡低蛋白质日粮对回肠黏膜抗菌肽mRNA丰度的影响(n=5) Table 4 The effect of the low protein level diets with balanced amino acids on the relative mRNA expression of antimicrobial peptide genes in ileal mucosa (n=5) |
如表 5所示，12.5%CP组回肠菌体Asp比例显著低于14.0%CP组和11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。12.5%CP组回肠菌体Ser比例显著低于14.0%CP组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。11.0%CP+BCAA组回肠菌体Glu比例显著高于12.5%CP组和11.0%CP组(P < 0.05)，14.0%CP组回肠菌体Glu比例显著高于12.5%CP组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。12.5%CP组回肠菌体Gly比例显著高于其他3组(P < 0.05)，其他3组间差异不显著(P>0.05)。14.0%CP组回肠菌体Cys比例显著低于11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。14.0%CP组回肠菌体Met比例显著低于12.5%CP组、11.0%CP组和11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，11.0%CP组回肠菌体Met比例显著低于12.5%CP组和11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，12.5%CP组回肠菌体Met比例显著低于11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)。回肠菌体His比例除12.5%CP组低于14.0%CP组外，其他组间差异不显著(P>0.05)。14.0%CP组回肠菌体Arg比例显著高于其他3组(P < 0.05)，其他3组间差异不显著(P>0.05)。12.5%CP组回肠菌体Pro比例显著低于11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。12.5%CP组回肠菌体GLMT比例显著低于14.0%CP组和11.0%CP+BCAA组、11.0%CP+BCAA组显著高于11.0%CP组，其他组间差异不显著(P>0.05)。
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表 5 氨基酸平衡低蛋白质日粮对回肠食糜微生物菌体氨基酸组成的影响(n=5) Table 5 The effect of the low protein level diets with balanced amino acids on the amino acid composition of ileum microbial flora (n=5) |
如表 6所示，11.0%CP组直肠菌体Glu比例显著高于其他3组(P < 0.05)，其他3组间差异不显著(P>0.05)。14.0%CP组和12.5%CP组直肠菌体Gly比例显著低于11.0%CP组和11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，且14.0%CP组和12.5%CP组之间、11.0%CP组和11.0%CP+BCAA组之间差异不显著(P>0.05)。11.0%CP+BCAA组直肠菌体Cys比例显著高于14.0%CP组和11.0%CP组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。14.0%CP组肠菌体Met比例显著高于11.0%CP组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。11.0%CP组直肠菌体His比例显著低于其他3组(P < 0.05)，其他3组间差异不显著(P>0.05)。11.0%CP+BCAA组直肠菌体Arg比例显著高于14.0%CP组和11.0%CP组(P < 0.05)，11.0%CP组直肠菌体Arg比例显著低于12.5%CP组(P < 0.05)，其他组间差异不显著(P>0.05)。11.0%CP组直肠菌体Pro比例显著高于其他3组(P < 0.05)，其他3组间差异不显著(P>0.05)。12.5%CP组直肠菌体GLMT比例显著高于11.0%CP+BCAA组(P < 0.05)，其他3组间差异不显著(P>0.05)。
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表 6 氨基酸平衡低蛋白质日粮对直肠食糜微生物菌体氨基酸组成的影响(n=5) Table 6 The effect of the low protein level diets with balanced amino acids on the amino acid composition of rectum microbial flora (n=5) |
总体来看，蛋白水平对回肠和直肠食糜微生物菌体氨基酸组成的影响是不同的，12.5%蛋白水平对回肠食糜微生物菌体氨基酸组成影响最大，直肠各处理中蛋白水平为11.0%的两组对直肠食糜微生物菌体氨基酸组成较大。正常蛋白水平时，回肠与直肠食糜微生物菌体氨基酸组成模式很接近，表现为Asp、Glu、Gly、Leu及Lys含量高于其他氨基酸。
2.5 氨基酸平衡低蛋白质日粮对盲肠微生物区系的影响 2.5.1 盲肠微生物菌群alpha多样性分析如图 2所示，各组的稀释曲线趋于平稳，可认为测序深度已覆盖到所有物种。Alpha多样性(Alpha diversity)是对单个样品中物种多样性的分析，包括Observed species指数、Chao1指数、Shannon指数以及Simpson指数等。Observed species代表观察到的OTU数目，Chao1用来估计样品中物种总数，Shannon和Simpson指数常用来反映样本alpha多样性，PD是alpha水平上最常用的系统发育多样性度量方法，指数值越大，代表多样性越高。如表 7所示，不同蛋白质水平日粮显著影响盲肠微生物区系的物种总丰度和多样性(P < 0.05)，表现为适当降低蛋白质水平(12.5%)，Observed species指数显著提高(P < 0.05)，Chao1、Shannon、PD指数无显著变化(P>0.05)。随着日粮蛋白质水平进一步降低(11.0%)，Observed species、Chao1、Shannon、PD分别降低了3.91%、2.78%、9.82%、9.85%，且Shannon和PD指数达到了显著水平(P < 0.05)。补充支链氨基酸的11.0%CP+BCAA组，除Chao1指数外的其他3项指数与11.0%CP组相比均显著提高了(P < 0.05)，且与14.0%CP组较为接近。
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横坐标为测序深度，纵坐标为多样性指数 X axis is sequence depth and Y axis is alpha diversity index in the figure 图 2 稀释曲线 Figure 2 Rarefaction curve |
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表 7 盲肠微生物区系alpha多样性指数(n=3) Table 7 Alpha diversity indexes of caecum microbial flora(n=3) |
如表 8所示，在门水平下，拟杆菌门是盲肠内的优势菌群，其相对丰度所占比例超过50%，其次是厚壁菌门，超过20%。不同处理间拟杆菌门、厚壁菌门的组成比例未有显著改变(P>0.05)。氨基酸平衡低蛋白日粮没有改变盲肠微生物的主要优势菌群，但对其他物种的相对丰度有一定影响。14.0%CP组的酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度显著高于12.5%CP组和11.0%CP组(P < 0.05)，与11%CP+BCAA组无显著差异(P>0.05)，12.5%CP组和11.0%CP组无显著差异(P>0.05)。14.0%CP组芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)相对丰度显著高于其他3组(P < 0.05)，12.5%CP组和11%CP+BCAA组显著高于11.0%CP组(P < 0.05)，12.5%CP组和11%CP+BCAA组组间差异不显著(P>0.05)。14.0% CP组变形菌门显著高于12.5%CP和11%CP+BCAA组(P < 0.05)，其他组间差异均不显著(P>0.05)。在科水平下，育肥猪盲肠微生物主要由普氏菌科、毛螺菌科、拟杆菌科等构成，由表 8可知，不同蛋白质水平对这些菌科的相对丰度无显著影响(P>0.05)。降低日粮蛋白质水平，弯曲菌科的相对丰度显著降低(P < 0.05)。
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表 8 门和科水平盲肠微生物相对丰度(n=3) Table 8 The relative abundance of caecum microorganisms at phylum and family levels (n=3) |
如图 3A所示，当蛋白质水平由14%降至12.5%时，毛螺菌属FCS020相对丰度变化不大，蛋白质水平继续降至11%且不补充BCAA时，相对丰度显著升高(P < 0.05)，补充BCAA后，相对丰度显著下降(P < 0.05)，但仍高于14.0%CP组和12.5%CP组。如图 3B所示，降低蛋白质水平，粪肠球菌属的相对丰度显著下降(P < 0.05)，低蛋白水平的3组间无显著差异(P>0.05)。如图 3C所示，降低蛋白质水平显著降低狭义梭菌属的相对丰度(P < 0.05)。
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图A、B、C分别代表毛螺菌属FCS020、粪球菌属、狭义梭菌属 The figure A, B and C indicate the Lachnospiraceae FSC020, Corprococcus and Clostridiaceae_senu_stricto, respectively 图 3 主要差异菌群 Figure 3 The main different microbial floras |
本研究结果显示，随着蛋白质水平的降低，尿液尿素氮含量依次降低，与诸多学者的研究是一致的。补充BCAA的组，其尿液尿素氮含量显著低于相同蛋白质水平未加BCAA的组，说明补充BCAA增加了氨基酸的平衡性，因而尿液尿素氮水平更低。随着蛋白质水平的降低，尿酸含量也显著降低，补充BCAA组尿液尿酸含量最低，这可能是由于降低蛋白质水平和平衡的AA比例减轻了肾和肝的负担。日粮中没有被消化吸收的蛋白质和未降解的AA以化合物的形式从粪尿中排出。猪食入N的利用率很低，随粪排出的N约占20%，随尿液排出的N约占50%[13]。从粪尿中排出的N不仅污染环境，对动物而言更是营养上的浪费。当摄入的蛋白质、氨基酸过量或不平衡时，多余的N主要由尿液排出，因此尿液尿素氮可以作为评价N利用情况的指标[14]。本试验结果表明，氨基酸平衡低蛋白日粮能有效提高氮的利用率、降低尿液尿氮的排放，减少环境污染。
本试验发现，降低日粮蛋白质水平，β-defensin-2、ANG1、ANG4的mRNA表达水平下调，但是补充BCAA后，β-defensin-2和这些抗菌肽的表达恢复到正常水平。β型防御素由于其抗菌和免疫调节作用而成为猪肠道稳态维护的一类重要抗菌肽。F.F.Han等[15]研究发现，β-defensin-2改善了由芒硝诱导的肠黏膜损伤和细胞通透性的改变，从而阻止了肠炎的发生。β-defensi-2的过表达导致TNF-α和IL-6蛋白表达量降低，在大鼠急性肺炎中发挥抗炎效果[16]。ANG1能够募集和维持内皮细胞周围的支持细胞、促进血管形成[17]。ANG4增加Akt磷酸化，调节炎性因子的表达[18]。刘小倩等[19]研究发现，在饲喂高精料引起的内源性乳房炎中，奶牛乳房组织的ANG1、ANG4表达量显著升高，表明ANG1、ANG4对乳腺组织炎性损伤有一定的保护作用。免疫系统高度依赖于蛋白质的合成，因为免疫反应的进行需要大量细胞、免疫球蛋白、细胞因子、细胞因子受体等参与，BCAA的缺乏使这些蛋白质不能达到发挥效用的最佳浓度水平，阻碍了免疫反应的进行[20]。有研究表明，支链氨基酸尤其是亮氨酸通过调节mTOR依赖的信号通路中的S6K1、4E-BP1和eIF4E的磷酸化刺激蛋白质的合成[21]。Y.L.Yin等[22]在断奶仔猪低蛋白日粮中添加0.55%的亮氨酸提高了4E-BP1和eIF4E的磷酸化水平，肝、心等器官和组织中蛋白质合成以及提高日增重61%，添加0.27%的亮氨酸提高小肠、肾和胰的蛋白质合成。另外，M.Ren等[23]研究发现，在28日龄断奶仔猪17%蛋白水平中补充BCAA，显著提高了空肠IgA、sIgA、IgM与回肠IgA、IgM的水平，增强动物免疫机能。本研究结果显示，低蛋白水平日粮可降低育肥猪肠道黏膜β-defensin-2和抗菌肽基因ANG1、ANG4的mRNA表达水平，进一步证明BCAA的缺乏导致参与免疫反应的蛋白质相关分子合成不足，增加动物对疾病的易感性，补充BCAA能够在一定程度上抵消这种不良影响。
本研究结果显示：(1)回肠与直肠食糜微生物菌体氨基酸组成模式相似，即Asp、Glu、Gly、Leu及Lys含量高于其他氨基酸，与前人的研究结果基本一致[24]；(2)不同蛋白质水平氨基酸平衡日粮对回肠和直肠食糜微生物菌体氨基酸组成均有显著影响，但影响程度不同，表明不同肠段微生物对氨基酸的代谢是不同的，即氨基酸代谢区室化[25]。16S RNA测序结果显示，不同蛋白质水平氨基酸平衡日粮能影响盲肠食糜微生物菌群结构，当蛋白质水平由14%下降为12.5%时，盲肠微生物整体丰度和多样性提高，蛋白质水平进一步降低至11.0%且不补充BCAA，盲肠微生物整体丰度和多样性降低，在低蛋白质日粮补充BCAA有利于盲肠微生物丰度和多样性的提高。肠道菌群主要由厚壁菌门(35%~80%)和拟杆菌门(17%~60%)构成[26]，本试验中，厚壁菌门和拟杆菌门是各组猪盲肠微生物丰度最高的菌群，表明降低蛋白质水平对其主要菌群结构无显著影响。变形菌门的细菌多为致病菌，如大肠杆菌、沙门氏菌，且此类细菌多有生物固氮作用。弯曲菌属是变形菌门的一个类群，最常见的弯曲菌包括空肠弯曲菌和结肠弯曲菌，它们被认为是造成动物腹泻的重要原因[27]。本研究显示，降低日粮蛋白水平，变形菌门相对丰度有所降低，弯曲菌属相对丰度显著下降，表明低蛋白日粮能有效抑制造成猪腹泻的微生物(如弯曲菌属细菌)的生长。这可能是由于降低蛋白质水平减少了这些有害菌能够获得的氮源，从而生长受到抑制。毛螺菌科(毛螺菌属)是主要的糖酵解细菌，能够分解纤维为单糖和挥发性脂肪酸[28]。本试验中，低蛋白组玉米淀粉比例高于高蛋白组，因此会有更多的淀粉进入后肠被微生物利用，这可能是低蛋白组中毛螺菌属细菌相对丰度升高的重要原因。粪肠球菌属也是属于毛螺菌科的细菌，通常被认为是有益菌，降低蛋白质水平，其相对丰度降低，与毛螺菌属细菌的变化趋势相反。梭菌科1是一种蛋白降解菌，降低蛋白质水平，显著降低了它的相对丰度，这可能是氮源不足引起的。P.X.Fan等[29]研究蛋白水平为16%、13%、10%的日粮对育肥猪肠道微生物区系的影响，结果发现，低蛋白水平日粮降低猪的生长性能，当蛋白水平为10%时，育肥猪回肠、结肠菌群多样性下降，当蛋白水平为13%时，回肠菌群丰度和多样性提高，有益菌乳杆菌属比例提高，结肠有益菌巨型球菌属比例也明显提高。本研究结果与P.X.Fan等[29]低蛋白平衡日粮对肠道微生物总丰度和多样性的研究结果基本一致，但是在对具体物种的影响上是有差异的，可能的原因包括日粮配方以及肠段不同。
4 结论本研究结果表明，低蛋白氨基酸平衡日粮能提高氮的利用效率、降低尿液中氮的排放，影响育肥猪肠道黏膜抗菌肽的表达水平和食糜微生物菌体氨基酸组成，提高盲肠微生物物种丰度和多样性，提高有益菌群(如毛螺菌属)的相对丰度，降低有害菌群(如弯曲菌属)的相对丰度。在低蛋白日粮中补充Glu及BCAA可以提高低蛋白日粮氨基酸的平衡性，恢复育肥猪肠道黏膜免疫功能。
| [1] |
吴东, 赵辉玲, 陈胜. 低蛋白日粮添加氨基酸对生长肥育猪生长性能和氮排泄的影响[J]. 畜牧与饲料科学, 2010, 31(5): 39–41.
WU D, ZHAO H L, CHEN S. Effects of supplements of amino acid in low protein diets on growth of fattening pigs and its excretion of N pollutant[J]. Animal Husbandry and Feed Science, 2010, 31(5): 39–41. (in Chinese) |
| [2] | GLOAGUEN M, LE FLOC'H N, PRIMOT Y, et al. Performance of piglets in response to the standardized ileal digestible phenylalanine and tyrosine supply in low-protein diets[J]. Animal, 2014, 8(9): 1412–1419. DOI: 10.1017/S1751731114001360 |
| [3] | LORDELO M M, GASPAR A M, LE BELLEGO L, et al. Isoleucine and valine supplementation of a low-protein corn-wheat-soybean meal-based diet for piglets:growth performance and nitrogen balance[J]. J Anim Sci, 2008, 86(11): 2936–2941. DOI: 10.2527/jas.2007-0222 |
| [4] | STOLL B, BURRIN D G, HENRY J, et al. Substrate oxidation by the portal drained viscera of fed piglets[J]. Am J Physiol, 1999, 277(1 Pt 1): E168–E175. |
| [5] | FENG Z M, ZHOU X L, WU F, et al. Both dietary supplementation with monosodium L-glutamate and fat modify circulating and tissue amino acid pools in growing pigs, but with little interactive effect[J]. PLoS One, 2014, 9(1): e84533. DOI: 10.1371/journal.pone.0084533 |
| [6] | DAI Z L, WU G Y, ZHU W Y. Amino acid metabolism in intestinal bacteria:links between gut ecology and host health[J]. Front Biosci, 2011, 16(1): 1768–1786. DOI: 10.2741/3820 |
| [7] |
戴兆来. 猪小肠微生物氨基酸代谢的生态学分析[D]. 南京: 南京农业大学, 2010.
DAI Z L. Ecological analysis of the amino acid metabolism in pig small intestinal bacteria[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University, 2010. (in Chinese) |
| [8] | HODIN C M, LENAERTS K, GROOTJANS J, et al. Starvation compromises Paneth cells[J]. Am J Physiol, 2011, 179(6): 2885–2893. |
| [9] | TELTSCHIK Z, WIEST R, BEISNER J, et al. Intestinal bacterial translocation in rats with cirrhosis is related to compromised Paneth cell antimicrobial host defense[J]. J Hepatol, 2012, 55(4): 1154–1163. DOI: 10.1002/hep.24789 |
| [10] | HASHIMOTO T, PERLOT T, REHMAN A, et al. ACE2 links amino acid malnutrition to microbial ecology and intestinal inflammation[J]. Nature, 2012, 487(7408): 477–481. DOI: 10.1038/nature11228 |
| [11] | National Research Council. Nutrient requirements of swine:eleventh revised edition[M]. Washington, D.C.: National Academic Press, 2012. |
| [12] |
赖星, 石宝石, 刘金艳, 等. 日粮蛋白水平对生长育肥猪肠道微生物酶活性的影响[J]. 中国兽医学报, 2017, 37(2): 327–334.
LAI X, SHI B S, LIU J Y, et al. Effects of crude protein levels on intestinal microbial enzyme activity of growth fattening pigs[J]. Chinese Journal of Veterinary Science, 2017, 37(2): 327–334. (in Chinese) |
| [13] | JONGBLOED A W, LENIS N P. Alteration of nutrition as a means to reduce environmental pollution by pigs[J]. Livest Prod Sci, 1992, 31(1-2): 75–94. DOI: 10.1016/0301-6226(92)90057-B |
| [14] | TOLEDO J B, FURLAN A C, POZZA P C, et al. Reduction of the crude protein content of diets supplemented with essential amino acids for piglets weighing 15 to 30 kilograms[J]. Rev Bras Zootecn, 2014, 43(6): 301–309. DOI: 10.1590/S1516-35982014000600004 |
| [15] | HAN F F, ZHANG H W, XIA X, et al. Porcine β-defensin 2 attenuates inflammation and mucosal lesions in dextran sodium sulfate-induced colitis[J]. J Immunol, 2015, 194(4): 1882–1893. DOI: 10.4049/jimmunol.1402300 |
| [16] | SHEN Z W, ZHOU Y, QU L, et al. ATP serves an anti-inflammatory role by enhancing β-defensin-2 response in acute pneumonia of rat[J]. Biomed Rep, 2017, 6(6): 649–653. DOI: 10.3892/br.2017.906 |
| [17] | KOH G Y, KIM I, KWAK H J, et al. Biomedical significance of endothelial cell specific growth factor, angiopoietin[J]. Exp Mol Med, 2002, 34(1): 1–11. DOI: 10.1038/emm.2002.1 |
| [18] | LEE H J, CHO C H, HWANG S J, et al. Biological characterization of angiopoietin-3 and angiopoietin-4[J]. FASEB J, 2004, 18(11): 1200–1208. DOI: 10.1096/fj.03-1466com |
| [19] |
刘小倩, 刘颖, 荣超, 等. ACE2在奶牛乳腺中的表达定位及其抗炎性损伤作用的研究[J]. 畜牧兽医学报, 2017, 48(3): 552–560.
LIU X Q, LIU Y, RONG C, et al. Expression localization of angiotensin converting enzyme 2(ACE 2) in dairy cow mammary gland and its anti-inflammation effect[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2017, 48(3): 552–560. (in Chinese) |
| [20] | CALDER P C. Branched-chain amino acids and immunity[J]. J Nutr, 2006, 136: 288S–293S. |
| [21] | KIMBALL S R, JEFFERSON L S. New functions for amino acids:effects on gene transcription and translation[J]. Am J Clin Nutr, 2006, 83(2): 500S–507S. |
| [22] | YIN Y L, YAO K, LIU Z J, et al. Supplementing L-leucine to a low-protein diet increases tissue protein synthesis in weanling pigs[J]. Amino Acids, 2010, 39(5): 1477–1486. DOI: 10.1007/s00726-010-0612-5 |
| [23] | REN M, ZHANG S H, ZENG X F, et al. Branched-chain amino acids are beneficial to maintain growth performance and intestinal immune-related function in weaned piglets fed protein restricted diet[J]. Asian Austral J Anim, 2015, 28(12): 1742–1750. DOI: 10.5713/ajas.14.0131 |
| [24] | DAI Z L, ZHANG J, WU G, et al. Utilization of amino acids by bacteria from the pig small intestine[J]. Amino Acids, 2010, 39(5): 1201–1215. DOI: 10.1007/s00726-010-0556-9 |
| [25] | SORIMACHI K. Evolutionary changes reflected by the cellular amino acid composition[J]. Amino Acids, 1999, 17(2): 207–226. DOI: 10.1007/BF01361883 |
| [26] | SHOAIE S, KARLSSON F, MARDINOGLU A, et al. Understanding the interactions between bacteria in the human gut through metabolic modeling[J]. Sci Rep, 2013, 3: 2532. DOI: 10.1038/srep02532 |
| [27] |
阳成波, 蒋原, 黄克和, 等. PCR法和培养法调查食品和水中空肠弯曲杆菌的比较研究[J]. 中国人兽共患病杂志, 2003, 19(1): 91–94.
YANG C B, JIANG Y, HUANG K H, et al. Research on survey of Camplobater jejuni in food and water by PCR and culture methods[J]. Chinese Journal of Zoonoses, 2003, 19(1): 91–94. (in Chinese) |
| [28] | VOLTOLINI C, BATTERSBY S, ETHERINGTON S L, et al. A novel antiinflammatory role for the short-chain fatty acids in human labor[J]. Endocrinology, 2012, 153(1): 395–403. DOI: 10.1210/en.2011-1457 |
| [29] | FAN P X, LIU P, SONG P X, et al. Moderate dietary protein restriction alters the composition of gut microbiota and improves ileal barrier function in adult pig model[J]. Sci Rep, 2017, 7: 43412. DOI: 10.1038/srep43412 |